이 프로토콜은 Sandell-Kolthoff 반응을 이용해 인간 간 미생물체에서 화학물질이 데이오디나제1(DIO1) 활성에 미치는 영향을 신뢰성 있게 평가하는 색도계 방법을 설명합니다. 사전 정의된 수용 기준과 통계적 성과 지표를 포함하며, OECD 시험 지침 포함을 위한 지속적인 노력을 지원합니다.
이 논문에서
요약
초록
이 방법은 DIO1 활성을 억제하여 갑상선 호르몬 항상성을 방해할 수 있는 검사 물질을 식별할 수 있게 합니다. 제시된 프로토콜은 인간 간 미크체에서 디오딘나제1(DIO1)의 효소 활성에 대한 시험 물질의 영향을 평가하기 위한 비방사성 색도 방법을 설명합니다. 이 분석법은 Sandell-Kolthoff(SK) 반응을 기반으로 하며, 역트리이오도티로닌(rT3)이 디오도티로닌(T2)으로 탈오디화되는 과정에서 방출되는 요오디화를 정량화합니다. 노란 세륨(IV)은 요오화물이 존재하면, 무색 세륨(III)으로 환원되어 415nm 광도 탐지가 가능하다. 이 표준화된 설정에서는 세륨(IV) 농도를 40 mM로 설정하여 해당 조건에서 신호 안정성과 견고성을 향상시킵니다. 분석의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 포괄적인 대조군 구성이 포함되어 있습니다: 6-프로필-2-티오라실(참조 항목), 오로티오글루코스(양성 대조), 1-티오-β-D-포도당 나트륨염(음성 대조), 1% 디메틸설폭사이드(용매 통제). 프로토콜에는 적절한 검사 농도를 결정하기 위한 거리 측정 분석, 미량체의 배치별 요오화물 방출 활도의 표준화, 미세체가 없는 상황에서의 구조화된 화학적 간섭 검사, 그리고 선택적으로 디티오트레이톨(DTT) 없이 DTT 의존성 인공물을 식별하는 후속 평가가 포함됩니다. DIO1-SK 분석법은 중간에서 고처리량 스크리닝 및 기전적 독성학 연구에 적합합니다. 그 견고성, 확장성, 그리고 인간 미세체에 대한 적용 가능성은 내분비 교란을 조사하는 데 매우 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 규제 검증 노력을 지원합니다.
서론
내분비 교란물질(ED)은 호르몬 조절을 방해하여 인간에게 부작용을 일으키는 화학물질입니다 1,2. 디오디나제(DIO)는 막 관련 효소로, 활성 부위에 셀레노시스테인이 주요 잔기입니다. 이 효소 계열은 세 가지 뚜렷한 아이소폼(DIO1, DIO2, DIO3)으로 구성되며, 이들은 순환 갑상선 호르몬(TH) 농도를 조절하고 세포 내 조직 특이적 가용성을 조절합니다. 프로호르몬 역할을 하는 티록신(T4)과 활성 형태인 트리이오도티로닌(T3)은 신체 내 에너지 소비, 성장, 발달 과정, 체온 조절에 중요한 역할을 합니다. DIO 아이소폼은 이요오디네이션 부위 특이성, 동역학적 특성, 기질 선호도에서 차이가 있다. DIO1은 성인 간에서 주요 디요오디나제 아이소폼이며, 역트리이오도티로닌(rT3)과 황산화된 요오도티로닌에 강한 기질 친화성을 보이는 반면, DIO2는 T4와 rT3를 우선적으로 이용하고, DIO3는 주로 T4와 T3에 작용합니다. 인간 간 미세체와 rT3를 기질로 사용하여 DIO1 활성을 선택적으로 검출하여 다른 아이소폼의 간섭을 최소화할 수 있습니다. 물질에 의한 DIO1 억제의 정확한 결과는 아직 완전히 밝혀지지 않았지만, 인간 유전자 돌연변이가 DIO1에 영향을 미치는 증거는 DIO1이 갑상선 호르몬계를 교란시킬 수 있음을 명확히 보여줍니다5. 따라서 DIO1 억제를 조사하기 위해서는 견고하고 재현 가능한 방법이 매우 필요합니다.
제시된 방법의 목표는 Sandell-Kolthoff(SK) 반응을 기반으로 한 비방사성 색도 접근법을 사용하여 시험관 내에서 DIO1 활성을 정량화하는 것입니다. DIO1은 역방향 rT3를 T2로 전환하는 과정을 촉매하여 요오다이드 이온을 방출합니다. SK 반응은 방출된 요오드화물의 민감한 검출을 가능하게 하여, DIO1 활성의 직접적인 측정 지표로서 아이오다이드 방출 활성(IRA)을 결정할 수 있게 합니다. 이 분석법은 DIO1에 대한 시험 물질의 억제 효과를 검출할 수 있게 하여 기전적 독성학, 스크리닝 또는 규제 의사결정을 지원합니다. 이는 특히 국제 검증 노력(예: EURL ECVAM 6,7과 같이 조정됨)에서 제시된 바와 같이, 갑상선 교란을 초래하는 부작용 경로의 분자적 유발 사건으로서 DIO1 억제를 조사하는 데 중요합니다. 이 방법은 원래 2012년에 개발되었으며, 특히 갑상선 호르몬 대사 맥락에서 내분비 선별검사 배터리에 통합할 수 있는 견고하고 재현 가능하며 확장 가능한 시험관 내 분석에 대한 수요가 증가함에 따라 6,7을 더욱 최적화했습니다. 최근에는 중간 10에서 고처리량 스크리닝11에 대한 아날로그 SK 기반 설정 적용 사례가 발표되어 SK 기반 접근법의 광범위한 적용 가능성을 입증했습니다.
DIO1-SK 분석법은 TH 산물이 아닌 IRA를 정량하여 DIO1 활성을 간접적으로 측정하지만, 대체 기법에 비해 여러 가지 장점을 제공합니다. 방사성 표지 기판12나 고갈되거나 형성된 갑상선 호르몬의 질량분석법에 의존하는 방법과달리, SK 반응은 415 nm14에서 요오드 방출을 측정하여 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 판독값을 제공합니다. 고체 상 추출을 이용한 LC-MS/MS 방법(SPE-LC-MS/MS)은 rT3와 T2 정량에 높은 특이도와 감도를 제공하지만, 값비싼 장비가 필요하고 고처리량 스크리닝에는 덜 적합합니다. 반면, DIO1-SK 분석법은 표준 실험실 환경에서 구현할 수 있으며 인간 간 미량체에 대한 사전 검증을 통해 높은 재현성과 예측성을 입증했습니다 6,7. 비교 연구에서는 SK 반응, 특히 요오드 방출 결과가 SPE-LC-MS/MS 15를 이용한 갑상선 호르몬 대사산물(rT3 및 T2)의 정량과 직접 비교되었습니다. 연구 결과는 다양한 시험 물질과 억제 능력에서 두 접근법 간에 강한 일치를 보여주었습니다. 검사된 모든 물질에 대해 SK 반응으로 측정된 요오드 방출 활성(IRA) 변화는 질량분석법으로 결정된 rT3 및 T2 농도 변화와 매우 유사했습니다. 이는 SK 판독이 DIO1 활동의 대체 지표로서 타당함을 더욱 뒷받침했습니다. 이 비교 분석들은 SK 분석이 더 복잡한 분석 기법에 대한 견고하고 신뢰할 수 있는 대안을 제공하며, 요오화물 방출을 자신 있게 측정하여 시험관 내 DIO1 억제 평가가 가능함을 확인했습니다.
그러나 SK 방법은 고려해야 할 몇 가지 한계가 있습니다: 불순물로 자유 요오다이드를 포함하거나, 비효소적으로 요오드화물을 방출하거나, 디티오트레이톨(DTT)과 같은 분석 성분과 반응하는 물질의 간섭에 취약합니다. DTT는 활성 부위 셀레노시스테인의 감소된 상태에서 재생을 지원하여 디오디나제 촉매 능력을 유지하는 환원 보인자로 포함된다. DTT는 강한 환원제이기 때문에, 특정 시험 물질(또는 불순물)이 산화환원 반응을 일으켜 색도 측정에 영향을 미치고, 경우에 따라 효소 요오드 방출과 관련 없는 DTT 의존성 분석 인위물을 유발할 수 있습니다. 이러한 간전은 측정된 요오화물이 rT3의 효소 전환에서 유래하지 않을 수 있기 때문에 DIO1 억제에 대해 거짓 음성으로 이어질 수 있습니다. 따라서 SK 분석은 일상적인 스크리닝과 대부분의 시험 물질에 적합하지만, LC-MS/MS는 분석이 간섭이 의심되거나 복잡한 화학적 성질을 가진 물질에 대한 확인에 사용할 수 있습니다.
DIO1-SK 분석법은 현재 OECD 국제 PEPPER(내분비 교란 요인 특성 방법 검증을 위한 민관 플랫폼) 프로젝트의 시험 지침으로 포함되기 위해 준비 중이며, 이는 규제 적용과 내분비 교란 검사 전략의 국제적 조화에 점점 더 중요해지고 있음을 강조합니다. 이 분석은 포괄적인 시험관 내 시험관 검사 배터리에 통합되어 화학물질 안전성 평가와 내분비 교란에 대한 기전적 조사를 지원할 수있습니다. 갑상선 부작용 경로의 추가 주요 사건을 다루는 검사와 결합하면, 갑상선 호르몬 교란 기전에 대한 보다 완전한 이해에 기여합니다.
또한 이 프로토콜의 확장성과 높은 재현성 덕분에 중대에서 고처리량 스크리닝에 적합합니다. 이는 약물 개발 및 학술 환경에서 많은 수의 물질을 평가하는 데 필수적이며, 최근11. 스크리닝, 기전적 독성학, 규제 의사결정 등 DIO1 억제에 관심 있는 연구자들은 견고하고 접근성 있으며 다재다능한 분석법의 혜택을 누릴 것입니다. 이 방법의 검증은 갑상선 호르몬 시스템 교란 연구와 화학적 안전성 평가의 표준 도구가 될 것입니다.
프로토콜
참고: 주 분석을 수행하기 전에 DIO1-SK 분석의 정확성, 재현성 및 타당성을 보장하기 위해 일련의 준비 단계가 필수적입니다. 이러한 사전 분석 활동에는 이온 교환 주조, 수지 충전 필터 플레이트가 포함되며, 이는 효과적인 분리와 SK 반응에서의 배경 간섭 최소화에 매우 중요합니다. Sandell-Kolthoff 반응은 체계적인 변화를 모니터링하고 분석의 질을 유지하기 위해 요오다이드 표준 곡선을 사용하여 정기적으로 표준화됩니다. 인간 간 미세체의 활성을 측정하여 배치별 요오드화 방출 용량을 결정하여 실험 전반에 걸쳐 일관된 효소 성능을 보장합니다. 이 단계들은 이후 주요 분석과 데이터 평가를 위한 견고한 토대를 제공하여 재현 가능하고 해석 가능한 결과를 생성하는 데 도움을 줍니다.
1. 사전 작업
- 버퍼 및 시약의 준비
- 표 1에 설명된 대로 모든 완충제와 재고 용액을 미리 준비하세요. 안정성과 재현성을 보장하기 위해 지정된 대로 알리쿼트를 저장하세요.
- 분석 당일에는 각 96웰 플레이트마다 기질 혼합물을 신선하게 준비하세요. 96웰 플레이트 한 장에 5.75 mL HEPES/EDTA 버퍼(50 mM HEPES, 2.16 mM EDTA, pH 7.0), 0.5 mL 해동 1 M DTT, 10 μL 6 mM rT3(DMSO에 용해됨)를 조합합니다. 부드럽게 섞고 바닥재 혼합물을 얼음 위에 올려두어 사용하세요.
- 참고 자료 준비
- 분석 당일에 기준 제어 6-PTU의 10-1M 재고 용액을 적절한 용매(예: DMSO)에 준비합니다.
- 이 재고를 diH2O(RI-C8)에 1:10 희석하여 DMSO 농도를 10%로 만들고, 표 2에 설명된 대로 10% DMSO를 diH2O에 희석하여 일련의 희석액을 준비합니다.
- 양성 대조군 준비
- 적절한 용매(예: DMSO)에 양성 대조군 Aurothioglucose의 10-2M 스톡 용액을 준비하여 4 °C에서 최대 6개월간 보관합니다.
- 분석 당일에는 재고를 diH2O에서 10-3 M으로 희석하여 DMSO 농도를 10% DMSO로 만듭니다.
- 음성 대조군 준비
- 분석 당일에 10-2M 용량의 음성 대조군 1-티오-β-D-포도당 나트륨 염을 신선한 상태로 준비합니다.
- 분석 당일에는 재고를 diH2O에서 10-3 M으로 희석하여 DMSO 농도를 10% DMSO로 만듭니다.
참고: 특히 비소나트륨과 황산과 같은 유해 화학물질을 다룰 때는 항상 적절한 안전 수칙을 지켜야 합니다. 모든 시약은 탈이온수로 준비하여 제조사의 권장에 따라 보관해야 합니다. 기질 혼합물과 해동된 DTT 알리코트는 분석 당일에 한 번만 사용하도록 되어 재냉동해서는 안 됩니다.
- 이온 교환 수지 주조
- 준비에는 적절한 직사각형 투명 용기를 사용하세요.
- 큰 용기에 약 250g(또는 원하는 양)의 이온 교환 수지를 넣고 세척합니다. 10% 아세트산을 첨가하여 세척합니다; 수지 현탁액을 10분간 휴지시킵니다.
- 현탁액이 10분간 가라앉게 둔 후, 약간 기울여서 상정액을 흡인하세요. 총 5번 이상 세척하거나 용매에 색이 새지 않을 때까지 세척하세요.
- 마지막 세척 단계에는 10% 아세트산을 넣어 전체 부피의 약 50%를 차지하게 합니다.
- 용기를 기울여 수지가 한쪽으로 움직이게 하고, 기울어진 상태로 용기를 안정시키세요. 상들이 분리될 때까지 ~10분 정도 기다려.
- 96웰 필터판을 96깊이 웰 플레이트 위에 올려놓고, 각 웰에 10% 아세트산 100μL을 추가합니다.
- 수지 주조에 사용되는 팁을 ~1cm 높이로 잘라 끝 구멍을 넓히고, 96웰 필터 플레이트의 각 웰에 300μL의 이온 교환 수지를 주조합니다.
참고: 저희 작업에 사용되는 팁은 최대 용량이 1,200 μL이며 다중 채널 피펫에 부착할 수 있습니다. - 아세트산은 100–200 × 깊이의 웰 플레이트에 원심분리하여 1분간 스윙아웃 로터가 장착된 원심분리기에서 1분간 용출합니다. 레진이 플레이트 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인하세요.
- 플레이트를 불투수 플라스틱 시트로 밀봉하고 최대 6개월간 4°C에서 보관하세요.
참고: 이온 교환 수지 성분은 제대로 씻어내지 않으면 SK 반응에 영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 제거된 상정액은 SK 반응에 직접 사용할 수 있으며(상상액 샘플 50 μL 사용, 세륨 50 μL 첨가, 마지막으로 비소 용액 50 μL 추가) 10% 아세트산 샘플과 비교하여 성분이 완전히 세척되도록 할 수 있습니다.
- 샌델-콜트호프 반응의 표준화
- 해당 요오화물 원천(예: 표준 요오화물 용액)에서 권장 농도인 1,500, 1,000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5, 1 nM 요오화물 희석물을 diH2O 내 해당 요오화물 표준 물질로 준비합니다.
- 대조군으로 순수 diH2O 50 μL, 준비된 요오드 희석물 50 μL을 96웰 플레이트에 3중으로 추가하는데, 이는 그림 1의 레이아웃에 설명된 것입니다.
- 모든 우물에 40 mM 세륨 용액 50 μL를 추가하고, 반응을 시작하면 25 mM 비소 용액 50 μL 주입으로 시작한다.
- 비소 용액을 첨가한 직후 가능한 한 빨리 플레이트 리더기를 사용해 415nm(±2nm)에서 흡수를 측정하여 21분간 매분마다 광학 밀도(OD)를 기록하고 초기 OD도 기록합니다.
- 4절에 설명된 결과를 평가하세요.
참고: 순수 diH2O 대조에서 ΔOD21분 > 0.3의 배경은 주의와 근본 원인(예: As 또는 Ce-배치 오염, 낮은 수질 등)에 대한 추가 조사가 필요합니다.
- 미세체 활성 평가
- 1.2단계에서 설명한 기준 항목(6-PTU)의 최고 농도(RI-C8)를 준비합니다.
- 표 3에 설명된 6개의 마이크로솜 희석물과 표 1에 설명된 기질 혼합물을 준비합니다.
- 10% (v/v) 용매 희석액 10 μL (예: diH2O에 10% DMSO)와 10-2 M 6-PTU (RI-C8) 10 μL 10 μL를 96웰 플레이트에 3회 접시에 추가하라.
- diH2O 내 미세솜 희석 40 μL을 96웰 플레이트에 추가하여 플레이트 레이아웃에 따라 각 웰당 20, 10, 5, 2.5, 1.25, 0.68, 0 μg 미세염체 단백질을 생성합니다.
참고: 공급업체는 일반적으로 미소체체 단백질의 재고 농도를 제공합니다. 그렇지 않은 경우, 표준 단백질 정량 방법을 사용할 수 있으나, 본 연구에서는 적용하지 않았습니다. - 각 웰에 신선하게 준비된 기질 혼합물 50 μL를 추가하고, 불투수성 플라스틱 시트로 플레이트를 밀봉합니다.
- 96웰 플레이트를 인큐베이터(37°C, 850rpm)의 셰이커에 올려 2시간 배양합니다.
- 배화 시간이 끝난 후에는 반응을 멈추기 위해 접시를 얼음에 올려놓으세요.
- 2.2단계와 유사한 이온 교환을 수행하세요.
- 이온 교환 단계에서 얻은 깊은 우물에서 적절한 양의 샘플을 신선한 96웰 플레이트로 옮겨 희석되지 않은 상태(샘플 50 μL 양), 1:2(샘플 25 μL + 10% 아세트산 25 μL 비율), 1:4 비율(샘플 12.5 μL + 10% 아세트산 37.5 μL) 희석 비율을 측정하되, 플레이트 배치는 변경하지 않습니다.
- 4절에서 설명한 결과를 평가하고, 10% 아세트산 시료의 희석 계수와, Sandell-Kolthoff 반응에서 포화 정기에 도달하지 않고 가능한 최고 ΔOD21min -BG 값을 유지하는 미세분체 단백질 농도를 결정합니다.
참고: 일반적으로 20 μg 미소체체 단백질의 1:4 또는 1:2 아세트산 희석 비율에서 ΔOD21 분> 0.5 요오드 방출이 쉽게 가능하며, 보통 ΔOD21분 1 주기 범위 내입니다. 미세체의 단백질 농도가 높은 것은 분석에서 배경 결합과 비특이적 결합을 증가시키기 때문에 권장되지 않습니다. 결과를 확인하기 위해 결정된 미세좀 농도와 희석 계수를 사용하여 6-PTU 희석 계열 측정을 반복하는 것이 권장됩니다.
- 시험 문항의 용해도 평가
- 시험 품목을 100 mM 또는 200 mg/mL 용매(예: DMSO)에 실온에서 용해합니다. 혼합하거나 소용돌이로 현미경으로 녹아 확인해 보세요.
- 녹지 않은 상태라면 최대 5분간 초음파 검사를 한 후 다시 확인하세요. 아직 녹지 않았다면 37°C에서 최대 60분간 가열한 후 다시 확인하세요.
- 불용성이라면 더 희석하거나 낮은 농도로 새 육수를 준비한 후 이 과정을 반복하세요. DMSO가 적합하지 않다면 대체 용매로 물이나 에탄올을 시도해 보세요.
- 용해되면 diH2O(10% 용매)에 1:10 희석액을 준비하고 혼합, 초음파 처리, 필요에 따라 가열하는 등 평가를 반복합니다.
- 분석 조건을 시뮬레이션하기 위해 1% 희석된 시험 물질을 분석제 버퍼에 준비하고 용해도 검사를 반복합니다.
- 시험 물건 준비 및 거리 측정
- 시험 품목 스톡 용액은 1.8단계에서 용해도 평가 시 결정된 적절한 용매(가급적 DMSO)에서 가장 높은 용해도의 용액으로 준비합니다.
- 거리 측정 분석에서는 정액과 diH2O에 10% DMSO를 사용하여 1:10(v/v) 희석 단계로 8개의 시험 품목 희석을 준비합니다.
- 2절에 설명된 단계를 수행하여 테스트 항목의 억제 프로필을 추정하기 위한 거리 탐색 분석법을 수행하세요. 시험 항목이 어떤 농도에서든 억제 ≥25%를 보일 경우, 최종 분석 농도 범위를 선형 억제 범위 내 최소 세 가지 농도와 10% IRA 미만 농도 두 개로 조정하세요.
- 시험 항목이 모든 검사 농도에서 <25% 억제를 보인다면, 최종 분석에서 동일한 희석 시리즈를 재사용하세요. 이 경우 거리 측정 분석은 세 가지 필수 독립 분석 중 하나로 간주될 수 있습니다.
참고: 결과의 재현성과 신뢰성을 보장하기 위해 각 시험 문항에 대해 최소 두 번, 이상적으로는 세 번의 독립적인 실험을 수행하세요. 활성 범위를 더 잘 커버하기 위해 다른 희석을 선택하면 1:10 희석 비율에서 벗어날 수 있습니다. 이 검사 전략의 25% 컷오프(1.9.3 및 1.9.4 단계 참조)는 검사 항목 효과와 음성 통제군을 구분하여 기초 활동 변동성을 고려하고 추가적인 안전 마진을 제공합니다. 이 임계값은 억제성 프로필의 신뢰성 있는 분류를 보장합니다.
그림 1: 요오화합 표준 곡선의 플레이트 배치. 이 그림은 요오다이드 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 96웰 플레이트 배치를 보여줍니다. 웰에는 1 nM에서 1,500 nM까지 다양한 요오화물의 연속 희석과 diH2O-단독 대조군이 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 2: 미소구 단백질 적정 및 참조 항목 검사를 위한 플레이트 레이아웃. 이 그림은 미소체 단백질 적정 및 기준 억제제(6-PTU) 검사를 위한 96웰 플레이트 배치를 보여줍니다. 6-PTU 유무에 따라 행(row)은 웰당 미세체체 단백질의 양이 점점 증가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
2. DIO1–SK 분석 수행
- 검사 항목과 함께한 미세체체 배양
- 1.2단계에서 설명한 참조 문항과 1.3, 1.4단계에서 설명된 양성 및 음성 대조군을 준비합니다. 1.8단계와 1.9단계에 설명된 프로토콜에 따라 적절한 농도로 시험 항목을 준비하세요.
- 표 1에 설명된 기질 혼합물을 준비하고, 1.7단계에 따라 미리 정의된 단백질 농도에 미세솜 현탁액을 조심스럽게 해동하고 분리된 마이크로솜 용액을 diH2O에 희석하여 준비합니다. 마이크로솜 현탁액은 배양에 필요할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
- 그림 3과 그림 4에 표시된 판 배치에 따라(두 개 이상의 시험 품목이 동시에 평가될 경우) 기준 품목 농도, 양성 및 음의 대조군, 용매 조절(diH2O의 10% (v/v) 용매), 시험 품목 농도를 웰에 추가합니다.
- 모든 웰에 미세체체 현탁액 40 μL을 추가하세요. 신선하게 준비한 기질 혼합물 50 μL을 샘플에 첨가합니다.
- 접시를 불투수 플라스틱 시트로 밀봉한 뒤, 인큐베이터(37°C, 850rpm)에서 셰이커에 2시간 동안 올려두세요; 배양 후 접시를 얼음 위에 올려 반응을 멈추세요.
- 배양 후에는 접시를 얼음 위에 올려 반응을 멈추세요.
참고: 시료 완전성을 유지하기 위해 플레이트는 측정 전까지 얼음 위에 보관할 수 있습니다. 첫 번째 검사판에는 기준 항목의 8가지 농도가 포함되어 있으며, 같은 날 추가된 각 검사판에는 기준 항목의 최고 농도만 포함되어 있어 필요시 추가 검사 항목들을 위한 공간이 더 확보됩니다.
- 이온 교환 수지로 채워진 96웰 필터판을 통한 분리
- 1.5단계에서 준비한 96웰 필터 플레이트 위에 준비된 이온 교환 수지 충전 96웰 필터 플레이트를 96 깊이 웰 플레이트 위에 올려놓고, 각 웰에 10% 아세트산 150 μL을 첨가하여 컬럼 내 레진을 적시도록 합니다.
- 100–200 g 의 × 원심분리기에서 1분간 스윙아웃 로터가 있는 원심분리기에서 1분간 아세트산을 용출하여 사용한 96깊이의 웰 플레이트에 원심분리하여 아세트산을 용출합니다.
- 사용한 96깊이 웰 플레이트를 새 96깊이 웰 플레이트로 교체하세요.
- 2.1.6단계에 따른 인큐베이션 96웰 플레이트의 각 웰에 133 μL 10% 아세트산을 추가하고, 플레이트를 잠시 흔들어 용액을 혼합합니다.
- 이전 단계에서 준비한 샘플 175 μL을 이온 교환 수지로 채워진 96웰 필터 플레이트에 전달하며, 초기 플레이트 레이아웃을 유지합니다.
- 샘플을 수지를 통과해 96 깊이의 웰 플레이트에 1분간 원심분리(100–200 g ×)하여 스윙아웃 로터가 장착된 원심분리기를 통해 96 깊이의 웰 플레이트로 통과시킵니다. 이온 교환 레진이 채워진 96웰 필터 플레이트를 제거하세요.
참고: 샘플이 있는 96 깊이의 웰 플레이트는 불투수 플라스틱 시트로 밀봉할 수 있으며, 최소 3개월 동안 4 °C 온도에서 보관할 수 있습니다. 이렇게 하면 수작업/기술적 오류나 Sandell-Kolthoff 반응 또는 다음 측정 중 희석 인자 변화가 있을 경우 추가 측정이 가능합니다.
- 샌델-콜트호프 반응
- 마이크로솜 배치의 10% 아세트산 희석 비율에 따라 샘플의 희석 인자(1.7단계 참조)에 따라 희석되지 않은 샘플 50 μL를 새로운 96웰 플레이트에 첨가합니다.
- 표 1에 설명된 대로 준비된 40 mM 세륨 용액 50 μL를 모든 우물에 추가하고, 반응을 시작하여 모든 우물에 표 1에 설명 된 25 mM 비소 용액 50 μL를 추가합니다.
- 비소 용액을 첨가한 직후 가능한 한 빨리 플레이트 리더기로 415 nm(±2 nm) 거리에서 흡수량을 측정하며, 21분 동안 매분마다 광학 밀도(OD)를 기록하고 초기 OD도 기록합니다.
그림 3: 두 시험 항목의 병행 검사를 위한 플레이트 레이아웃. 여러 농도에서 세 배로 두 검사 항목을 검사하는 96웰 플레이트 레이아웃, 음성, 양성, 용매 조절, 기준 항목 복제를 포함합니다. 그날 첫 번째 분석 플레이트로 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 4: 세 가지 시험 항목의 병렬 검사를 위한 플레이트 배치. 96웰 플레이트 레이아웃은 세 가지 시험 항목을 여러 농도에서 3중으로 검사하며, 음성, 양성, 용매 조절 체계를 복제합니다. 참조 품목은 첫 번째 플레이트에서 완전히 검사되므로 최고 농도에서만 포함된다(그림 3 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
3. 간섭 검사 (± 미세체와 ± DTT)
- 1.2단계에서 설명한 기준 항목(6 PTU)의 최고 농도(RI C8)를 준비하고, 시험 항목의 정액과 희석액(최고 시험 항목 농도 포함)을 준비합니다.
- 미량체체 현탁액은 정해진 농도(1.7 단계 참조)로 diH2O에 희석하여 준비합니다. 사용 전까지 미량체체 현탁액을 얼음 위에 보관하세요.
- 두 가지 기판 혼합을 준비하라: 표 1에 설명된 DTT가 포함된 표준 기판 혼합과 DTT가 없는 동일한 기판 혼합(DTT만 제외).
- 그림 5에 따라 96 웰 플레이트의 지정된 웰에 분사합니다: RI C8 10 μL, diH2O 내 10% (v/v) DMSO 10 μL (용매 조절), 각 시험 항목 희석액 10 μL 투여.
- 그림 5에 따라 "미세좀이 있는 정"에 40 μL 마이크로솜 현탁액을, "미세체가 없는 정문"에 40 μL diH2O를 추가한다.
- 얼음 위에는 DTT가 포함된 기질 혼합물 50 μL을 "DTT가 있는 "유정"에 추가하고, DTT가 없는 기질 혼합물 50 μL을 "DTT가 없는 "우물"에 추가합니다(그림 5).
- 접시를 불투수 플라스틱 시트로 밀봉한 후, 인큐베이터(37 °C, 850 rpm)에서 셰이커에 2시간 동안 배양하세요.
- 배양 후에는 접시를 얼음 위에 올려 반응을 멈추게 합니다.
- 2.2 및 2.3단계에서 설명한 대로 SK 반응을 통한 이온 교환 분리 및 요오화물 정량을 수행하고, 4절에 설명된 결과를 평가합니다.
참고: 이 단일 플레이트 구성(그림 5)은 미세체와 함유, DTT 유행 및 DTT 유행 시 최고 검사 품목 농도를 검사하여 효소성 DIO1 활성과 분석 인공물을 구분합니다. 미세체가 없는 우물에서 IRA 증가≥20%는 SK 간섭(요오다이드 방출/판독)을 나타내며, 해당 물질은 "DIO1 SK 분석에 적용 불가"로 분류되어 분석에서 제외됩니다. DTT가 있는 조건과 없는 조건의 차이는 DTT 의존적 요오화물 방출을 추가 간섭 메커니즘으로 식별하는 데 도움을 줍니다.
그림 5: 간섭 시험을 위한 플레이트 배치. 이 그림은 간섭 검사를 위한 96웰 플레이트 배치를 보여주며, 시험 항목, 기준 검사, 용매 제어가 DTT가 있는 상황에서 미세체가 있을 때와 없이, 미세체가 없고 DTT가 없는 상태에서 모두 시험됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
4. 데이터 평가
- DIO1 활성 평가
- ΔOD21분 값은 초기 측정(0분) 값에서 모든 샘플의 21분 값을 빼서 구합니다:
- 모든 샘플의 ΔOD21분 값에서 억제된 10개의 3 M 6-PTU(RI) 대조군의 ΔOD21분 평균을 빼어 ΔOD-BG 값을 산출합니다:
- 시험 항목의 값을 해당 용매 제어 값에 정규화하여, 시험 항목(TI) ΔOD21분-BG TI값을 해당 용매 제어제의ΔOD 21분 -BG SC 값의 평균으로 나누어 요오화물 방출 활도(IRA) 값을 % 단위로 산출합니다.
- 통계 소프트웨어 패키지에서 검사 항목의 다양한 농도별 IRA 값을 그래프로 표시하는데, IRA 값은 y축(선형), 검사 항목 농도는 x축(로그)에 배치합니다.
- 곡선 적합 알고리즘을 사용하여 집중-반응 관계를 시각화하세요(예: "[억제제] 대 반응 -- 변수 기울기(네 가지 매개변수)"). "탑"은 최대 응답을, "바텀"은 가장 낮은 응답을, "힐슬로프"는 곡선의 가파른 상태를 설명합니다:
- 참조 문항의 IC 50과 해당되는 경우 시험 문항의 IC50 을 결정합니다.
- 참조 항목의 로그 IC50 추정치의 분산계수(CV)를 % 단위로 계산합니다:
- 용매 대조군에 정규화된 음성 대조군의 IRA를 % 단위로 계산합니다:
- 양성 대조군의 IRA를 용매 대조군에 정규화하여 % 단위로 계산합니다:
- z' 인자를 계산하세요:
- 실험의 타당성을 확인하기 위해 계산된 값을 표 4의 수용 기준과 비교하십시오.
참고: 유효한 분석 실행을 받기 위해서는 모든 기준을 충족해야 합니다. - 검사 항목을 최대 억제 및 IC50 값을 기준으로 완전 억제제, 부분 억제제, 비억제제로 분류하라( 표 5에 요약).
- ΔOD21분 값은 초기 측정(0분) 값에서 모든 샘플의 21분 값을 빼서 구합니다:
결과
그림 6 은 DIO1-SK 분석법 워크플로우와 실험실에서 성공적으로 이 방법을 확립하기 위해 필요한 주요 표준화 단계를 개괄적으로 보여줍니다. 워크플로우(그림 6A)는 인간 간 미생물체 사용, 검사 대상 및 대조군과의 배양, 이온 교환 분리를 통한 요오화물 추출, Sandell–Kolthoff(SK) 반응을 이용한 색도 요오화물 정량 등 분석의 순차적 단계를 요약합니다. 그림 6B 는 (i) SK 반응의 표준화, (ii) 배치별 미시체 활성 테스트, (iii) 용해도 평가 및 간섭 테스트, (iv) 거리 탐색 분석, (v) 첫 유효 분석에 따른 시험 품목 농도 조정 등 견고한 성능과 유효한 결과를 뒷받침하는 표준화 전략을 강조합니다.
이 전략의 핵심 요소는 배치별 미소체체 활성 검사로, 인간 간 미크체체 배치는 rT3 탈요오디네이션 활성에서 크게 다를 수 있어 각 배치마다 적절한 효소 농도를 결정해야 하므로 정기 물질 검사 전에 적절한 효소 농도를 결정해야 합니다.
이 단계별 시험 전략은 실행에 매우 중요합니다: 분석의 기준선 성능(대조군, SK 반응 행동, 미량체체 활성)이 검증되고 검사 조건이 표준화된 후에야 물질 검사가 유효하고 해석 가능한 억제 프로필을 도출할 것으로 기대됩니다.
그림 6: DIO1 SK 분석의 워크플로우 및 표준화 단계. (A) 워크플로우는 인간 간 미세체의 사용, 96웰 플레이트 설치, 시험 항목 및 대조군을 이용한 배양, 요오화물 추출, SK 반응을 통한 색도 정량 등을 보여줍니다. 각 단계는 분석의 주요 단계를 강조하기 위해 순차적으로 묘사됩니다. (B) 표준화 단계에는 Sandell-Kolthoff 반응의 표준화, 배치별 미량체체 활성 시험, 용해도 평가 및 간핵 시험, 거리 탐색 분석, 그리고 첫 유효 분석법 실행을 기반으로 한 시험 품목 농도 조정이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
그림 6에 표시된 워크플로우 및 표준화 프레임워크를 바탕으로, 그림 7은 실험실이 적절한 미세염체 단백질 농도(및 이온 교환 후 희석)를 결정하여 참조 억제제에 대한 시그모이드 억제 반응을 유지하면서 충분한 동적 범위를 달성하는 방법을 보여줍니다. 그림 7A에서 ΔOD21min-BG는 미소염체 단백질 증가에 따라 증가하며, 이온 교환 후 희석(희석되지 않은 상태, 1:2, 1:4)에 따라 달라진다. 이후 실험에서는 시그모이드 반응을 유지하면서 가장 높은 ΔOD21min-BG를 내는 희석액이 선택된다(예: 1:2 희석). 그림 7B에서는 6-PTU 억제 곡선을 미소체체 단백질 양에 걸쳐 비교하여 여전히 시그모이드 곡선을 보이는 가장 낮은 단백질 농도를 식별합니다(예: 5 μg 단백질/웰) 이를 통해 민감도와 배경 감도를 균형 있게 조정합니다.
중요하게도, 이 최적화 단계는 각 실험실에서 반드시 수행해야 하는데, 필요한 단백질 농도는 사용된 미량체 배치의 활성에 따라 달라지므로 배치별 효소 농도의 표준화가 필요하기 때문입니다.
그림 7: 6-PTU에 의한 미세체의 활성과 억제. (A) 그래프는 희석되지 않은 1:2, 1:4 희석 상태에서 측정된 미소체체 단백질 양이 증가함에 따라 배경(BG) 보정된 Sandell-Kolthoff 신호(ΔOD21분 n- BG)에 따른 활성이 증가함을 보여줍니다. 가장 높은 희석과21분의 BG 값, 그리고 시그모이드 형태를 가진 희석도가 향후 실험에 사용될 예정입니다. 이 경우에는 1:2 희석 비율이 문제입니다. (B) 기준 억제제 6-프로필-2-티오라실(6-PTU)의 농도-반응 곡선이 다양한 미세분체 단백질 부하(5, 7.5, 10 μg 단백질/웰)에서 log10[농도(M)] 대비 프로필을 표시함. IRA 값은 용매 조절에 정규화됩니다. 두 그래프의 데이터 포인트는 대표적인 미량체체 활성 검사 한 번± 상태당 세 번의 기술적 복제(웰)의 평균 SD를 나타냅니다. 곡선은 4매개변수 로지스틱("가변 기울기") 모델(억제제 대 반응)을 사용하여 비선형 회귀로 적합되었습니다. 향후 실험에는 시그모이드 곡선을 가진 가장 낮은 단백질 농도가 사용될 예정이며; 이 경우에는 5 μg/well입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
워크플로우 및 표준화 단계(그림 6)가 완료되고 선택된 미세좀 배치에 적합한 미세체체 단백질 농도가 설정되면(그림 7), 핵심 분석법 매개변수가 정해져 일상적인 물질 검사를 진행할 수 있습니다. 이 단계에서 테스트 항목들은 표준 플레이트 형식의 판 대조군(참조 항목, 용매 통제, 양성/음의 대조군)과 함께 평가할 수 있어, 견고한 정규화와 억제 프로파일의 일관된 해석이 가능합니다.
그림 8 은 요오화물 방출 활성(IRA)에서 농도-반응 행동에 기반한 분석법 구분을 보여줍니다. 기준 억제제 6-PTU(그림 8A)는 IRA의 농도 의존적 감소를 보여, 분석 성능 검증에 기대되는 시그모이드 억제 프로파일을 제공합니다. 탄닌산(그림 8B)은 제시된 조건에서 기준 억제제와 비교할 만한 억제 프로필을 보이며(최대 억제 > 90%). 시험 물질의 세 가지 농도가 높은 곳에서 IRA 값이 음수로 나타났습니다. IRA 값<0%은 생물학적으로 의미 있는 '음의 요오화물 방출'을 반영하지 않으며, 계산 절차(배경 빼기 및 용매 조절 정규화)에서 발생하며, 용매 조절의 작은 변동을 음의 정규화 값으로 전파시킬 수 있습니다. 따라서 IRA 값이 0% 미만은 결과 해석을 위해 0%(기준선)와 동등하게 간주됩니다. 디부틸프탈레이트(그림 8C)는 시험된 농도 범위 전반에서 억제 효과가 없으며(최대 억제 억제 25% 미만), 비억제제 프로필을 나타냅니다. 이 프로파일들은 표준화된 조건에서 억제성 행동과 비억제성 행동을 구분할 수 있음을 보여줍니다. 이 검사 시스템은 부분 억제제도 식별할 수 있는데, 이는 최대 억제 수준이 25%에서 90% 사이임을 나타냅니다(데이터는 표시되지 않음). 이들이 어떻게 분류되는지에 대한 자세한 내용은 표 5에서 확인할 수 있습니다.
그림 8: DIO1–SK 분석법의 용량-반응 거동은 억제제와 비억제제를 구분합니다. 용량-반응 곡선은 (A) 기준 억제제 6-PTU, (B) 대표 억제제(탄닌산), (C) 대표적 비억제제(디부틸프탈레이트)에 대해 log10 농도(M)에 대해 이오드 방출 활성(IRA per %) 그래프를 나타냅니다. IRA 값은 배경 감산 후 계산되어 용매 제어에 정규화되었습니다. 기호는 하나의 독립 실험에서 평균 ± SD(n = 3)를 나타내며, 각 실험은 농도당 세 개의 기술적 복제(우물)로 수행됩니다. 곡선은 4매개변수 로지스틱("가변 기울기") 모델(억제제 대 반응)을 사용하여 비선형 회귀로 적합되었습니다. IRA 값이 0% 미만인 경우, 결과 해석을 위해 기준선 0%와 동등하게 간주됩니다. 이 데이터는 이 분석법이 기준 억제제에 대해 시그모이드 억제 프로파일을 제공하며, 표준화된 조건에서 농도-반응 곡선이 억제성인지 비억제성인지 확인할 수 있음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
유효한 분석 실행에서 용매 조절제(SC)는 완전히 억제된 기준 조건(6-PTU, RI-C8)으로부터21분 신호 분리가 명확합니다. 예시 데이터셋(10개의 독립 실행)에서 각 플레이트에는 SC와 완전 억제된 기준(10−3 M에서 6-PTU)에 대해 n = 9개의 기술적 복제가 포함되었습니다. 모든 판을 종합하면, 판 평균 SC ΔOD21분 값은 1.383에서 1.819(평균 ± SD: 1.565 ± 0.114) 사이였으며, 억제된 6-PTU 상태의 판 평균 ΔOD21분 값은 0.258에서 0.771 사이였다(평균 ± SD: 0.473 ± 0.087). 이 분석에서 ΔOD 계산은 OD0min 과 OD21min의 차이를 기반으로 하며, 분석법의 타당성은 일반적으로 z′ 임계값 >0.5에 의해 지지됩니다.
10회의 독립 분석 과정을 거치며, 6-PTU는 IC50 값이 1.20E-06 M에서 5.02E-06 M 범위인 시그모이드 농도-반응 곡선을 산출했습니다(평균 ± SD: 2.74E-06 M ± 1.13E-06 M). 1.00E-06에서 1.00E-05 기준 범위 내 IC50 값의 수용 기준은 이전 검증 연구 데이터를 기반으로 합니다. 그러나 IC50 수치는 사용된 특정 마이크로솜 배치에 의해 크게 영향을 받으며 상당한 변동성을 보일 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 변동은 동일한 규모 내에 머무를 것으로 예상됩니다.
분석의 품질은 신호 창과 대조군의 변동성을 모두 반영하는 z′-인자를 사용하여 요약할 수 있습니다. 기술된 데이터셋에서 6개의 참조 곡선은 0.544에서 0.774(평균 ± 표준밀감 0.658 ± 0.062)의 z′ 인자와 연관되어 있으며, 이는 일반적으로 사용되는 수용 목표인 z′ > 0.5와 일치합니다.
실제로는 분석지 편차나 사전 정해진 수용 기준 미충족으로 비효율적인 런을 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 순수 diH₂O 블랭크에서 ΔOD > 0.3을 보일 때 Sandell-Kolthoff 반응에서 높은 배경 현상이 나타난다는 것은 검사가 필요하다(예: 시약 오염 또는 수질 문제). 이러한 배경 증가는 분석의 동적 범위를 감소시키고 통제 변동성을 증가시켜 z′ 인자가 0.5 미만으로 떨어지는 등 수용 기준 실패에 기여할 수 있습니다. 명백한 기술적 결함(예: 침전이나 비정상적인 변색)을 보이는 우물은 평가에서 제외됩니다. 박스플롯 이상치 검사를 통해 결정된 이상치도 제외됩니다. 이상치를 제거한 후에도 수용 기준을 충족하지 못하면 검사 실행은 유효하지 않아 반복해야 합니다.
| 시약/버퍼 | 준비 정보 |
| 산성 암모늄 세륨 용액 (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0.5 M H2SO4) (250 mL) | 250 mL 부피 플라스크에 (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O 6.32 g과 diH2O 125 mL를 추가합니다. 125mL와 1 M H2SO4를 추가하여 최종 부피는 250 mL로 만듭니다. 상온에서 최대 6개월간 보관하세요. |
| DTT (1M 알리코트 분기) | 준비 또는 공급된 1 M DTT 용액을 0.5 mL로 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 담아 -20°C에서 최대 6개월간 보관합니다. |
| HEPES (50 mM) / EDTA (2.16 mM) 버퍼 (pH 7.0) | 250 mL 용량 플라스크를 사용해 12.5 mL 1 M HEPES 용액과 201 mg 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 추가하고 최대 250 mL까지 디H2O를 채웁니다. 최대 3개월간 4°C에서 보관하세요. |
| rT3 용액("기판 혼합 튜브") | rT3를 DMSO에 최종 6 mM의 농도로 용해한 후, 15 mL 원심분리관에 10 μL 분량으로 나누어 -20°C에서 최대 6개월간 보관합니다. |
| 비소나트륨 용액 (25 mM NaAsO2, 0.8M NaCl, 0.5 M H2SO4) (250 ml) | 250 mL 부피 플라스크에 NaAsO2 0.81g, NaCl 11.7g, diH2O 125mL를 추가합니다. 125mL와 1 M H2SO4를 추가하여 최종 부피는 250 mL로 만듭니다. 상온에서 최대 6개월간 보관하세요. |
표 1: 완충제 및 시약의 준비. 이 표는 HEPES/EDTA 버퍼, DTT, rT3 용액, 산성 암모늄 세륨 용액, 비소나트륨 용액을 포함하여 DIO1 SK 분석에 사용되는 모든 버퍼 및 스톡 용액의 준비 단계와 저장 지침을 상세히 설명합니다.
| 참고 항목 희석의 명칭 | 기준 품목 희석 농도 [M] | 10% DMSO [μL] | 참고 항목 | 분석에서 기준 항목의 최종 농도 [M] |
| RI-C8 | 1.00E-02 | 450 | 10-1M 기준 품목 50 μL 재고 용액 | 1.00E-03 |
| RI-C7 | 1.00E-03 | 450 | 50 μL RI-C8 | 1.00E-04 |
| RI-C6 | 1.00E-04 | 450 | 50 μL RI-C7 | 1.00E-05 |
| RI-C5 | 3.16E-05 | 342 | 158 μL RI-C6 | 3.16E-06 |
| RI-C4 | 1.00E-05 | 450 | 50 μL RI-C6 | 1.00E-06 |
| RI-C3 | 3.16E-06 | 450 | 50 μL RI-C5 | 3.16E-07 |
| RI-C2 | 1.00E-06 | 450 | 50 μL RI-C4 | 1.00E-07 |
| RI-C1 | 1.00E-07 | 450 | 50 μL RI-C2 | 1.00E-08 |
표 2: 참고 항목 희석 준비. 이 표는 기준 항목(6-PTU)의 연속 희석 준비 과정을 요약하며, 농도, DMSO의 부피, 최종 농도를 포함하여 분석에 사용되었습니다.
| 미세솜은 우물당 [μg] | diH2O [μL] | 미세체체 희석 [μL] | 분석법 내 최종 효소 농도 [μg/mL] |
| 20 | 780 | 20 μL 20 mg/mL 마이크로솜 스톡 용액 | 200 |
| 10 | 400 | 웰 희석당 400 μL 20 μg 마이크로솜 | 100 |
| 5 | 400 | 웰 희석당 10 μg 마이크로솜 400 μL | 50 |
| 2.5 | 400 | 웰 희석당 5 μg 마이크로솜 400 μL | 25 |
| 1.25 | 400 | 웰 희석당 400 μL 2.5 μg 마이크로솜 | 12.5 |
| 0.68 | 400 | 웰 희석당 1.25 μg 마이크로솜 400 μL | 6.8 |
표 3: 마이크로솜 희석 준비. 이 표는 최종 미소체 단백질 농도를 달성하기 위해 필요한 diH₂O 및 미량체 스톡 용액을 포함한 웰당 미소체 단백질의 희석 방식을 제공합니다.
| 수락 기준 | 권장 컷오프 값 |
| 수치 | |
| 참조 항목 [M] IC50 | 1*10-05 - 1*10-06 |
| 로그 CV IC50 참조 항목 추정치 [%] | < 3 |
| IRA 음성 대조군 [%] | 80 - 120 |
| IRA 양성 대조군 [%] | < 20 |
| z'-팩터 | > 0.5 |
| 이진 | |
| 기준 항목의 형태(시그모이드?) | 네 |
| 기준 항목의 최종 농도-반응 곡선은 세 번의 복제 중 최소 여섯 가지 농도로 구성됩니다 | 네 |
| 시험 항목의 최종 농도-반응 곡선은 세 번의 복제 중 최소 여섯 가지 농도로 구성됩니다 | 네 |
표 4: DIO1 SK 검사의 수용 기준. 이 표는 IC₅₀ 범위, 변동계수, 대조군의 IRA 값, z' 인자, 농도-반응 곡선 요구 사항 등 검사 유효성에 대한 수용 기준을 나열합니다. 수용 창은 이전에 보고된 DIO1-SK 검증 연구6에서 도출되었으며, 참조 IC₅₀ 창을 결정한 5개의 독립 실행을 기반으로 한 재현성 평가도 포함되었다. 10개의 독립 실행 예제 데이터셋에서 z′ 인자 성능은 0.544에서 0.774(평균 ± SD: 0.658 ± 0.062)로 여기 사용된 z′ 수용 임계값을 지지합니다.
| 효능에 따른 범주 | 하위 범주 (효능에 따라) | 억제 활성 | 임계값 |
| 카테고리 1: 완전 억제제 | A: 강력한 완전 억제제 | 기준 항목인 6-PTU와 유사한 농도에서 DIO1 활성을 완전히 억제합니다 | 최대 억제율은 90% 이상 발생하며, IC50은 6-PTU의 상부 IC50 이하에서 나타난다 |
| B: 약한 완전 억제제 | 기준 품목 6-PTU보다 높은 농도에서 DIO1 활성을 완전히 억제합니다 | 최대 억제율은 90% 더 크고 IC50은 6-PTU의 상부 IC50 이상입니다 | |
| 카테고리 2: 부분 억제제 | - | 완전한 억제는 없지만 음과 용매 조절보다 더 강합니다 | 최대 억제율은 25%에서 90% 사이입니다 |
| 카테고리 3: 억제제가 아님 | - | DIO1을 억제하지 않습니다(음성 및 용매 조절과 동일) | 최대 억제 25% 이하 |
표 5: DIO1 억제 효능 및 효능을 기준으로 한 시험 항목 분류. 시험 항목은 DIO1 활성의 최대 억제 효과에 따라 전면, 부분, 비억제제 세 가지 효능군으로 분류됩니다. 완전 억제제는 기준 항목 6-PTU에 대한 IC₅₀에 따라 효능에 따라 추가로 세분화됩니다.
토론
DIO1-SK 분석법은 방사성 표지 분석법이나 질량분석법과 같은 전통적인 DIO1 활성 평가 방법에 대비해 비방사성, 비용 효율적이고 확장 가능한 대안을 제공합니다. 인간 간 미세체에 대한 사전 검증과 갑상선 호르몬 수치의 SPE-LC-MS/MS 측정과 강한 일치성은 신뢰성과 규제 관련성을 확인시켜 주며, OECD 검사 지침 작업 계획에 포함된 것으로 반영됩니다. Sandell-Kolthoff(SK) 반응의 단순성 덕분에 첨단 장비가 없는 실험실에서도 이 분석에 접근할 수 있습니다.
본 프로토콜에서는 기존 발표된 DIO1-SK 절차에 비해 여러 실용적인 측면이 더 자세히 명시되어 96웰 형식에서의 견고성과 재현성을 더욱 지원하였습니다. 이 설명들은 제어 개념(용매, 음, 양의 대조군)의 근거, 이전에 주조된 판을 재사용하지 않고 신선히 준비된 이온 교환 수지 플레이트를 사용한 결정, 그리고 다중 웰 플레이트 측정에서 견고함을 향상시키는 SK 반응 조건에 초점을 맞추며, 생물학적 해석이 이전 표준화 작업과 일치하도록 하는 6,7.
강점에도 불구하고, DIO1 매개 rT3에서 T2로 전환되는 과정에서 방출되는 요오화물을 정량화하기 위해서는 여러 중요한 단계가 필요합니다. 이는 재현성을 보장하기 위해 정확한 타이밍과 일관된 시약 취급이 필요한 샌델-콜토프 반응을 통해 이루어집니다. SK 반응은 아이오다이드가 비소년에 의해 황색 세륨(IV)을 무색 세륨(III)으로 환원시키는 빠른 촉매 과정입니다; 색 변화 속도는 요오다이드 농도에 비례합니다. 비소 용액이 첨가되면 반응이 빠르게 진행되기 때문에 측정을 지체 없이 시작하는 것이 필수적입니다. 96웰 플레이트 형식에서는 비소 용액의 느리거나 불일정한 첨가가 우물마다 상당한 변동성을 초래할 수 있습니다. 따라서 모든 웰에서 시약이 균일하고 빠르게 첨가되도록 멀티채널 피펫이나 자동 디스펜서 사용이 강력히 권장됩니다.
웰 간 비교 및 판 간 비교를 극대화하기 위해, SK 반응에서 시약 첨가 순서는 기술된 작업 흐름과 일치해야 합니다: 세륨이 염색 기판으로 존재하고, 반응은 비소 첨가로 시작되어 시작 시간이 정의되므로 빠르고 동기화된 투여가 필요합니다. 이 구성에서는 대체 시약 첨가 순서를 평가하지 않았으며; 따라서 프로토콜을 재현할 때 순서를 변경하는 것은 권장되지 않습니다. 또한, 세륨 농도는 SK 판출물의 실제 성능 특성(예: 신호 창 및 견고성)에도 영향을 미칠 수 있습니다. 25 mM 세륨은 이전 분석법 표준화 시 검증된 표준 조건으로 정의되었으나, 40 mM과 같은 높은 농도는 IC50 값이나 생물학적 해석에 영향을 주지 않고 신호창과 z′ 인자를 증가시키는 것으로 이전 연구6에서 이미 설명되었습니다. 이 프로토콜에서는 40 mM 세륨을 사용하여 분석 조건 하에서 완전하고 빠른 요오화물 복합화를 보장하고, 일상적인 판 기반 측정에서 견고성과 신호 안정성을 향상시킵니다. 수용 기준(예: z′-인자, 참조 억제제의 IC50 값)은 이전 검증 연구에서 관찰된 과거 성능을 기반으로 하며, 일상적인 분석 성능 점검으로 의도되었습니다.
인간 간 미크솜의 사용은 생물학적 변이성을 도입하므로, 배치별 특정 요오드화 방출 활성의 표준화가 필수적입니다. 이온 교환 레진이 채워진 필터 플레이트의 신중한 준비가 필요하며, 필터 플레이트 전체에 수지가 고르게 분포되지 않도록 하고, 요오다이드가 잠재적으로 간섭하는 물질로부터 완전히 분리되도록 해야 합니다. 수지 작업 흐름과 관련해서는, 수지 포화, 요오화화물 또는 단백질 운반으로 인한 추가 변동성 위험을 최소화하기 위해 신선 주석 이온 교환 레진이 채워진 필터 플레이트를 선택했으며, 재사용 시 결합 효율 손실 가능성을 최소화하였습니다. 수지와 필터 플레이트를 재사용하는 것은 기술적으로 가능하지만, 이 연구에서 체계적으로 평가되지 않은 일부 위험이 있을 수 있습니다. 수지 결합 용량이 감소하거나 이전 가동 후 잔류 매트릭스 성분이 수지 베드에 남아 있으면 배치 간 드리프트가 발생할 수 있습니다. 재활용을 고려하는 실험실의 실용적인 권고는 재사용 후 수지 성능을 검증하는 것(예: 배경 및 표준 곡선 동작 모니터링과 일관된 요오화물 포집 확인)이며, 배경 증가, 동적 범위 감소, 또는 불일치한 분리가 관찰되면 재사용을 중단하는 것이 권장됩니다. 이 프로토콜은 해당 방법론을 기반으로 특별히 개발된 것이므로 일회용으로는 수지가 채워진 필터 플레이트를 사용하는 것이 권장됩니다.
또한, 각 시험 항목의 용해도는 적절한 유체에서 결정되어야 하며, 최대 농도는 용해도에 의해 제한됩니다(일반적으로 1% DMSO에서 최대 1 mM까지). 모든 시험 화합물이 용매로 DMSO에 적용되기 때문에, 용매 조절은 분석 관련 조건에서 기준선 DIO1 활성을 정의하며, 정규화 및 비교를 위한 가장 적합한 기준 조건 역할을 합니다. 반면, 1-티오-β-D-포도당 나트륨염은 구조적으로 양성 대조군인 오로티오글루코스(ATG)와 유사하지만 요오도티론 탈요오디네이션에 대해 화학적으로 불활성이며 미소 산화환원 시스템이나 DIO1 촉매 활성에 방해가 없기 때문에 음성 대조군으로 포함되었습니다. 이 개념의 포함은 진정한 DIO1 특이적 효과와 화합물 첨가, 취급 또는 분석 매트릭스 상호작용과 관련된 비특이적 효과를 구분하는 데 도움을 줍니다. 무처리/무유체 대조군은 모든 화합 처리 우물에서 DMSO가 존재하는 실제 분석 환경을 반영하지 않아 주요 기준 조건으로 사용되지 않았습니다; 따라서 용매 통제가 분석 해석에 적합한 기준선입니다.
문제 해결은 SK 반응의 간섭을 식별하는 데 중점을 둡니다. 요오드 함유, 킬레이팅 또는 강산화성 물질이 비광계 14,17,18 표에 인위적으로 영향을 줄 수 있습니다. 이를 해결하기 위해 프로토콜에는 미세체체 없이 간섭 검사를 포함하고 있습니다. 더욱이, 디티오트레이톨(DTT)을 보조 인자로 사용하면 특정 시험 물질에서 비효소성 요오드 화물 방출이 발생할 수 있습니다. 이러한 경우에는 SPE-LC-MS/MS와 같은 직교 방법이 DIO1 억제를 확인하도록 권장됩니다. 일반적인 변성 효과(예: 계면활성제)를 통한 비특이적 간섭은 거짓 양성을 생성할 수 있으므로, 인실리코 도구나 통합 테스트 방식을 활용해 빈번한 타격자를 식별하는 일반적인 전략이 유용할 수 있습니다.
이 분석법에는 몇 가지 한계가 있습니다. 이 물질은 DIO1 활성과는 독립적으로 분석 성분과 반응하거나 요오화물을 방출하는 시험 물질의 간섭에 취약합니다. 이 분석법은 DIO1의 특이적 억제와 효소 기능이나 구조적 완전성에 대한 비특이적 간섭을 구분하지 않습니다. 특이성을 높이기 위해 추가 미세체체 효소의 억제를 병행하여 분석할 수 있으며, 다양한 효소 분석법 간 억제 능력을 비교하는 것이 추가 증거를 제공할 수 있습니다.
가능한 인공물을 식별하는 또 다른 전략은 세포 기반 시험관 내 검사에서 흔히 수행되는 무결성 또는 생존 가능성 검사를 포함하여 최대 검사 농도를 정의하는 것입니다. DIO1-SK 분석에는 직접적인 무결성 검사가 없지만, 시험관 내 검사 배터리 내에서 사용함으로써 다른 세포 기반 검사법의 세포독성 데이터를 통합하여 농도 선택에 정보를 제공할 수 있습니다. 이러한 교차 분석 정보가 없으면, DIO1-SK 분석법의 상부 농도는 용해도에 의해 제한되며, 이는 생체 내 노출을 반영하지 않을 수 있습니다. 그러나 독성 조절 방법을 통해 시험관 내 농도를 더 잘 정의하고 해석할 수 있습니다.
DIO1-SK 분석법은 특히 독성학적 스크리닝과 내분비 교란의 기전 연구에서 매우 유용합니다. 갑상선 호르몬 항상성의 핵심 사건을 다루며, 시험관 내 검사 배터리에 통합할 수 있습니다. 견고성, 재현성, 다양한 실험실 환경과 처리량 요구에 대한 적응성 덕분에 화학 안전성 평가 및 규제 검증에 유용한 도구가 됩니다. 이 검사법은 표준화된 조건에서 DIO1 억제를 강력하게 측정할 수 있는 시험관 내 측정값을 제공하며, 잘 특성화된 기준 억제제(6-PTU)와 비교해 시험 물질 분류를 지원합니다. 그러나 DIO1 억제에 관한 생체 내 데이터는 부족하며, 시험관 내 DIO1 억제 결과와 생체 내 효과를 직접 상관시키는 것은 현재 생체 내 예측성 추정에 적용되지 않습니다. 따라서 검사 결과는 갑상선 호르몬 대사의 한 핵심 사건에 대한 기전적 증거로 해석되고, 필요한 경우 다른 갑상선 MoA 검사 및 정교 측정과 같은 추가 증거와 통합되어야 합니다. 중요하게도, DIO1–SK 분석법은 여러 검증 중심 연구(최적화/표준화, 예측성 평가, 견고성/정확도 분석)에서 평가되었으며, OECD 도입으로 진행됨에 따라 본 글에서는 추가 실험실 간 이전과 일관된 구현을 용이하게 하는 단계별 절차적 세부 정보를 제공합니다.
공개 사항
저자 K.S., N.H., D.F.-W., R.L.는 화학 회사인 BASF SE의 직원으로, 향후 DIO1 분석을 이용해 상업용 제품을 개발하고 등록할 수 있습니다.
감사의 글
저자들은 DIO1-SK 분석법 초기 구축 과정에서 그의 노고에 대해 Andreas Weber 박사에게 감사의 뜻을 전하고자 합니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1-티오-&베타;-D-포도당 나트륨 염 | 시그마-올드리치 | T6375-1G | CAS 10593-29-0 |
| 3,3',5'-트리이오도티로닌 (rT3) | 산타크루즈 바이오테크놀로지 | SC-209692 | CAS 5817-39-0 |
| 6-프로필-2-티오라실 (6PTU) | 수펠코 | P3755-10G | CAS 51-52-5 |
| 아세트산 | 써모피셔 | 9526-33 | CAS 64-19-7 |
| 분석 균형 | NA | NA | 0.1mg 가독성으로 최대 30g까지 정확히 측정할 수 있습니다 |
| 비소 산화나트륨 (NaAsO2) | 써모피셔 | 041533.AP | CAS 7784-46-5 |
| 분석판 (96웰 포맷) | 머크 | Z707902-108EA | 예: 조직 배양 플레이트, 96웰 플레이트, 평평한 바닥, 폴리스티렌, 0.34 cm2, 멸균, 108/cs, TPP |
| 오로티오글루코스 (ATG) | 시그마-올드리치 | A0606-5MG | CAS 12192-57-3 |
| 원심분리관 15번과 50번, mL | 머크 | Z707724-800EA, Z707716-320EA | 예: TPP 원심분리관, 용량 15 및 50 mL, 폴리프로필렌, 그리고 nbsp; |
| 마이크로타이터 플레이트용 스윙아웃 로터가 있는 원심분리기 | NA | NA | 96 깊이의 웰 플레이트와 그 위에 96 웰 필터 플레이트(최소 약 6cm 높이)를 설치할 수 있을 만큼 충분히 높아야 합니다 |
| 세륨 (IV) 황암모늄 (Ce(NH4)4(SO4)4) | 시그마-올드리치 | 22269-100G-F | CAS 10378-47-9 |
| CO2 인큐베이터 | NA | NA | 37도 온도를 유지할 수 있습니다; C, 5% CO2 및 등; 습도 90% |
| 딥웰 플레이트 (96웰 포맷) | 수펠코 | 575653-U | 예: SPE 96-깊이 사각형 우물 수집판, 웰 부피 2 mL, 폴리프로필렌 |
| 디메틸 설폭사이드 (DMSO) | AppliChem | A3672,0250 | CAS 67-68-5 |
| 디티오트레이톨 (DTT) | 시그마-올드리치 | D9779-1G | CAS 3483-12-3 |
| 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) | 시그마-올드리치 | APO456787707-500G | CAS 6381-92-6 |
| 필터 플레이트 (96웰 포맷) | 머크 | WHA77002810 | 예: 마이크로플레이트, 96웰, 투명 폴리스티렌, 800 및 마이크로; L, DNA 결합, 왓트맨 |
| 가스 밀폐 플레이트 실러 | 써모피셔 | 232698 | 예: 밀봉 테이프, 폴리에스터, 멸균, 밀봉 테이프, 폴리에스터, 멸균, Nunc |
| 젠장 | 판 바이오텍 | P05-01100 | CAS 7365-45-9 |
| 인간 간 미세체 | 바이오비트 | X008070 | 예: INVITROCYP 150-공여자 통합 인간 간 미세체 |
| 요오화 (IC 표준) | 수펠코 | 41271-100ML | 예: IC용 요오드 표준 기준, 물에 1000 mg/L, 시그마-알드리치 |
| Dowex 50WX2 같은 이온 교환 수지 | 로스 | 334.4 | CAS 12612-37-2; 메시 100-200 |
| 마이크로 원심분리기 튜브 1.5 & nbsp; mL | 머크 | EP0030120086-1PAK | 예: 에펜도르프 &; 세이프락 마이크로 원심분리기 튜브, 용량 1.5 mL, 천연 |
| 50에서 300m까지 공급할 수 있는 멀티채널 디스펜서; µ 한 걸음당 L. | NA | NA | NA |
| 10에서 100까지 공급이 가능한 다중 채널 피펫; µ 한 걸음당 L. | NA | NA | NA |
| 전극 및 교정 완충 장치가 포함된 pH 미터 | NA | NA | +/- 0.1 pH 단위를 읽을 수 있습니다 |
| 흡광도 측정용 광도계 | 테칸 트레이딩 AG | NA | 예: 선라이즈 흡광도 리더기, INSTSUN-3 |
| 1에서 10까지 공급할 수 있는 피펫; µ L | NA | NA | NA |
| 10개에서 100개까지 공급할 수 있는 피펫; µ L | NA | NA | NA |
| 100에서 1000/nbsp까지 공급할 수 있는 피펫; µ L | NA | NA | NA |
| 대용량용 피펫 | NA | NA | 혈청학적 피펫, 예: 10, 25, 50 mL |
| 플레이트 셰이커 | 써모피셔 | NA | 예: Thermo Scientific H+P MONOSHAKE VORTEXER MICROTITER PLATE, 직접 제어됨 |
| 리피터 피펫 | NA | NA | NA |
| 염화나트륨(NaCl) | 시그마-올드리치 | S9888-25G | CAS: 7647-14-5, 예: 염화나트륨, ACS 시약 등; 99.0 % |
| 통계 소프트웨어 | NA | NA | 분석법 특성을 반영하는 회귀분석을 수행하고 억제 농도를 계산할 수 있습니다. 예: GraphPad Prims 8, GraphPad |
| 황산(H2SO4) | 수펠코 | 1007311000 | CAS 7664-93-9 |
| 부피 플라스크 | NA | NA | 정의된 부피로 인증됨 |
참고문헌
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