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연구 논문

제2형 당뇨병 및 당뇨병 신장 질환에서 LINC00426의 진단적 가치와 신장 세포에 미치는 조절 효과

70 조회수

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DOI:

10.3791/70109

⸱

2026년 6월 26일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Tianyou Hospital, Wuhan University of Science and Technology, 2Department of Endocrinology, Changsha Central Hospital, 3Nephrology Department, Shanghai Putuo District People's Hospital, 4Cardiology Department, The Third Xiangya Hospital of Central South University, 5Health Clinic, General Office of Nanning Municipal People's Government

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

LINC00426의 하향 조절은 신장 세포에서 세포자멸사를 유도하고 염증을 증가시켜 당뇨병 신장 질환(DKD)의 진행을 촉진합니다.

초록

이 연구는 제2형 당뇨병(T2DM)과 당뇨병 신장질환(DKD)에서 LINC00426의 진단적 가치와 신장 세포에 미치는 조절 효과를 조사합니다. 연구에는 같은 기간 방문한 280명의 T2DM 환자(DKD 146건)와 건강한 대조군 186명이 포함되었습니다. 역전사 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)은 T2DM 및 DKD 환자에서 혈청 LINC00426이 하향 조절된다는 것을 확인했습니다. 수신자 운전 특성(ROC) 분석은 T2DM과 DKD에 대한 LINC00426의 진단 가치를 평가했습니다. 다변량 로지스틱 회귀 분석은 독립적인 DKD 위험 인자를 확인하였습니다. LINC00426 두 질환 모두에 대해 진단적 가치를 보여주었으며, 소변 알부민-크레아티닌 비율(UACR)과 음의 상관관계를 보였습니다. 이 하향 조절은 독립적으로 DKD 발병을 예측했습니다. 고포도당(HG) 환경은 HK-2 및 HGMC 세포에서 LINC00426 발현을 억제합니다. CCK8 분석, 유세포분석, 효소 연관 면역흡착 분석법 등에서 HG가 증식을 억제하고 세포자멸사와 염증을 촉진한다는 것이 확인되었습니다. 반면, LINC00426의 과발현은 HK-2와 HGMC 세포의 증식 능력을 높이고, 세포자사멸사를 억제하며, 염증 반응을 감소시킵니다. LINC00426의 하향 조절은 신장 세포(HK-2 및 HGMC)의 증식을 억제하고 세포자멸사(apoptosis)와 염증 반응을 촉진함으로써 DKD 진행을 악화시킬 수 있습니다.

서론

제2형 당뇨병(T2DM)은 만성 대사 질환1입니다. 보고서에 따르면 T2DM과 그 합병증은 인류 건강과 사회 발전에 위협이 되는 중요한 글로벌 공중보건 문제로 자리 잡고 있습니다. 시간이 지남에 따라 습관이 좋아진 건강하지 않은 생활습관으로 인해2형 당뇨병 유병률은 매년 증가하고있습니다. 당뇨병성 신병증(DN)은 2007년에 당뇨병 신장병(DKD)으로 명칭이 변경되었습니다 6,7. T2DM8의 흔한 합병증으로서, 당뇨병 환자의 발생률과 사망률은 매년 계속 증가하고 있습니다9. DKD는 오랜 기간 당뇨병 환자에게 잠복 상태로남아 있거나 갑작스럽게 나타나는 경우가 많습니다. DKD는 신장 기능 장애와 내피 손상을 일으킬 수 있습니다 12,13. DKD는 주로 신장 여과 시스템 손상 후 단백질과 같은 큰 분자가 요로 손실되는 현상으로 나타납니다14. 하지만 환자에게는 혈액 생화학적 지표(공복 혈당, 인슐린)가 T2DM 진단의 골드 스탠다드로 작용하지만, DKD는 여전히 발견이 어렵습니다. 기존 치료법은 DKD 진행을 신속히 식별하거나 평가하지 못합니다15. 따라서 질병에 대한 인식 제고와 새로운 진단 바이오마커 식별은 T2DM과 DKD 모두의 예방과 치료에 매우 중요합니다.

최근 몇 년간 장기 비암호화 RNA(lncRNA)가 면역16, 암 조절, 대사 등 다양한 기능에 관여하는 점이 점점더 주목받고 있습니다. 현재 축적되는 증거들은 조절 이상한 lncRNA 발현이 복잡한 만성 질환, 특히 DKD18,19의 병인에 연관됨을 시사합니다. 예를 들어, Zhang 등은 고처리량 시퀀싱을 통해 lncRNA evf-2가 hnRNP와 상호작용하여 세포 주기 관련 유전자와 염증 인자의 발현을 강화하여 DKD 발달을 촉진한다는 사실을 확인했습니다. DKD 쥐 모델에서 lncRNA USR0000B2476D이 면역 조절에 관여하는 것으로 확인되었다21. LINC00426은 염증 인자 조절에 중요한 역할을 하는 새로 발견된 lncRNA입니다22. 최근 비교 마이크로어레이 연구들은 LINC00426이 T2DM 발달의 바이오마커로서 잠재력을 지닐 수 있음을 시사합니다23. 더 나아가, 생물정보학 전략은 신세포암에서 면역 조절에 LINC00426의 관여를 포착했습니다24. 수많은 연구들이 당뇨병과 DKD에서 염증의 중요한 관여를 강조했습니다. 기존 연구에 따르면 2형 당뇨병26형과 당뇨 전단계 질환27, 대사 증후군28, 비만29, 심혈관 대사 심장질환30 등이 모두 높은 염증 부담과 관련이 있습니다. 또한, 신경병증31, 신병증32, 망막병증33과 같은 당뇨병성 미세혈관 합병증과 대혈관 합병증34도 모두 만성 염증 반응입니다. 따라서 LINC00426과 T2DM 및 DKD 간의 관계를 연구하는 것은 새로운 진단 지표를 발견하고 DKD의 기전을 밝히는 데 매우 중요합니다. 그럼에도 불구하고 LINC00426이 TD2M 및 DKD에서 차지하는 역할에 관한 현재 문헌은 제한적이며, 발현 패턴, 독립적인 위험값, 진단 효능에 대한 임상 근거는 명확히 하지 못합니다.

이 연구 공백을 메우기 위해 본 연구는 466명의 참가자를 등록하고, RT-qPCR을 통해 혈청 LINC00426 발현을 검출했으며, 로지스틱 회귀분석을 통해 DKD의 독립적 위험 인자를 확인하고, ROC 분석을 통해 T2DM과 DKD에 대한 LINC00426의 진단 잠재력을 추가로 평가하였습니다. 우리의 발견은 DKD에서 LINC00426의 발현 특성과 임상적 중요성을 예비적으로 명확히 하여, 기존 지식 공백을 메우고 DKD 발병 기전 및 바이오마커 탐구에 대한 새로운 통찰을 제공합니다.

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프로토콜

이 연구는 중앙남부대학교 제3상야병원 의학윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 환자와 그 가족들은 지지를 표명하고 서면 동의서에 서명했습니다.

샘플 수집
표본 크기는 G*Power 소프트웨어를 사용하여 계산되었습니다. 유의수준(α)은 0.05, 통계적 검정권(1-β)은 0.8, 효과 크기(f)는 0.25, 10%의 탈락률을 고려하였다. 계산 결과, 대조군, T2DM, DKD 집단을 연구할 때 그룹당 최소 123명의 참가자가 필요함을 나타냈습니다. 실제 연구에서는 대조군에 186명, T2DM 그룹에 134명, DKD 그룹에 146명이 포함되었습니다. 이들 모두 2022년 7월부터 2023년 6월까지 중앙남부대학교 제3상야병원에서 치료를 받은 자원봉사자입니다. 이 중 72명은 합병증이 없었고, 208명은 한 가지 이상의 합병증을 보였습니다. 합병증은 주로 당뇨병성 신경병증, 당뇨병성 망막병증, 당뇨병성 신장 질환(DKD)을 포함했으며, 146명의 환자가 DKD 진단을 받았습니다. 당뇨병 분류는 공복 시 인슐린과 공복 혈당 수치를 기준으로 결정되었으며; 진단적 모호성을 피하기 위해 제1형 당뇨병 환자는 제외되었습니다. 임신성 당뇨병 및 특수 당뇨병 질환은 제외되었습니다.

포함 기준은 다음과 같았습니다: 18세 ≥ 연령; 완전한 의료 기록과 문서가 제공됩니다; 2020년 중국 제2형 당뇨병 예방 및 치료 지침 준수37. 제외 기준에는 동반 정신질환, 인지 장애 또는 연구 협조 불가가 포함되었으며; 급성 감염 질환; 장기 부전; 그리고 악성 종양.

같은 기간 동안 정기 건강 검진을 받은 186명의 건강한 환자로 구성된 대조군이 선정되었습니다. 대조군 참가자는 다음 기준을 충족해야 합니다: 당뇨병 또는 기타 대사 질환 병력이 없음; 정상 공복 혈당(<6.1 mmol/L), 식후 2시간 혈당(<7.8 mmol/L), 그리고 당화 헤모글로빈(<5.7%); 신장 질환 또는 합병증 병력이 없으며, 신장 기능 지표(사구체 여과율, 소변 알부민/크레아티닌 비율)가 정상입니다.

당뇨병 관련 지표 검사
각 연구 참가자에 대한 기본 인구통계 정보가 입원 시 기록되었습니다. 다음 날 아침, 각 피실험자로부터 5mL의 정맥혈을 채취하여 금식 상태에서 생화학적 지표를 검사했습니다. 공복 혈당(FBG) 수치는 혈당 측정기35를 사용해 분석하였습니다. 당화 헤모글로빈(HbA1c)은 완전 자동화된 HbA1c 분석기로 측정되었습니다36. 소변 샘플은 연구 포함 후 24시간 이내에 수집되었습니다. 면역-황도계법38을 통해 단백질 분석기37을 사용하여 요청부 알부민 농도를 측정하였다. DKD 환자의 신장 기능 장애 정도는 DKD 3,39에서 초기 신손상 및 질병 진행을 평가하는 잘 확립된 지수인 요로 알부민-크레아티닌 비율(UACR)으로 평가되었습니다.

세포 배양 및 가공
인간 신장 상피세포 HK-2와 사구체 중간세포 HGMC 제품을 구입하였습니다. 구체적으로, HK-2 세포는 10% 태아 소 혈청이 포함된 K-SFM 배양지에 1% 항생제 용액을 보충하여 배양하였습니다. HGMC 세포는 1차 세포 완전 배양지에서 배양하였습니다. 세포는 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 유지되었습니다. 합류율이 70%를 초과할 때 전달 및 형질전환이 수행되었습니다. 고포도당(HG) 유도를 위해 세포는 6웰 플레이트에 시딩되어 웰당 2mL 배양지에 30 mM D-포도당에 48시간 동안 노출되었습니다(HK-240 및 HGMC 세포41). 저혈당 대조군은 5.5 mM D-포도당 + 24.5 mM 만니톨로 처리되었습니다.

LINC00426의 전체 길이 서열은 진핵생물 발현 플라스미드 pcDNA3.1에 클론되어 과발현 플라스미드LINC00426 pcDNA3.1을 구성하였습니다. 빈 pcDNA3.1 벡터가 음성 대조군으로 사용되었습니다. 세포 형질전환은 제조사의 지침에 따라 리포펙타민 3000 시약을 사용하여 수행되었습니다. 간단히 말해, HG 유도 HK-2 및 HGMC 세포를 6웰 플레이트에 시딩하고 70%–80% 합류 지점에서 형질전환했습니다. 각 웰마다 2.5 μg 플라스미드 DNA(pcDNA 3.1 또는 pcDNA3.1 LINC00426)를 5 μL 리포펙타민 3000 시약을 250 μL 옵티-MEM에 실온에서 15분간 혼합하였으며, 이전 연구10. 이후 형질전환 복합체는 완전한 배양 배지에서 세포에 점차 첨가되었습니다. 37 °C에서 6시간 배양한 후, 배양지는 신선한 배지로 교체되었고, 이후 실험 전에 추가로 42시간 동안 세포를 배양했다.

총 RNA 추출 및 역전사
남은 혈액은 3000 x g 에서 다시 15분간 원심분리되었고, 상청액은 -80°C에서 수집되어 보관되었다. 전체 RNA는 이전 연구에 따르면 트리졸-페놀-클로로포름 방법을 사용하여 혈청과 세포 샘플에서 추출되었으며, 동일한 부피의 에탄올로 침전되었습니다42. RNA 농도와 순도는 자외선 분광광도계를 사용해 평가하였습니다. 총 cDNA는 유전자 PCR 증폭기를 통해 RT 시약 혼합물을 사용하여 샘플에서 합성되었습니다. 반응 조건은 15분 동안 42°C, 이어서 5초 동안 85°C였다. 샘플은 4 °C에서 잠시 보관되었습니다.

역전사 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(RT-qPCR)
RT-qPCR은 SYBR qPCR 마스터 믹스를 사용하여 수행되었습니다. 혈청 LINC00426 발현은 정량적 PCR 기기를 통해 정량화되었습니다. 데이터는 내부 참조 유전자로 β-튜불린을 사용하여 2−ΔΔCt 방법으로 정규화되었습니다. β-튜불린의 평균 Ct 값은 약 25였으며, 모든 혈청 샘플에서 23에서 27 사이였다. CT 변동 계수(CV)는 2.5%였습니다. 일방향 ANOVA는 대조군, T2DM, DKD 그룹 간 β-튜불린 Ct 값에서 유의한 차이가 없음을 보여주어, 혈청 LINC00426 정규화의 내부 기준으로서 안정적인 발현과 적합성을 확인하였습니다. 반응에 관련된 시중제는 보충 표 1에 나열되어 있습니다. 반응 조건: 95 °C에서 10분간 전변성; 95 °C에서 10초, 60 °C에서 30초를 40주기 동안 진행; 60 °C에서 15초간 최종 연장.

서부 블롯 분석
웨스턴 블롯 분석은 우리가 정립한 실험 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 간단히 말해, 세포는 1% 프로테아제 억제제 혼합물을 보완한 RIPA 용해 버퍼로 용해하였습니다. 상온에서 30분간 배양한 후 단백질 정량 분석이 이루어졌습니다. 단백질 샘플은 95 °C에서 변성되었고, 30 μg 단백질을 SDS-PAGE로 같은 양 분리한 후 0.45 μm PVDF 막에 전기전이가 이루어졌습니다. 막은 무지방 우유로 실온에서 2시간 동안 막았습니다. Bax, Bcl-2, Caspase-3, IκBα, p-P65에 대한 1차 항체는 TBST에서 1:1000으로 희석되었고, β-액틴은 1:3000으로 희석되었습니다. 막은 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 동안 인베이브되었습니다. 이후 막을 상온에서 1시간 동안 해당 고추냉이 과산화효소 결합된 2차 항체와 함께 배양하였다. 단백질 밴드는 겔 영상 시스템의 ECL 기질을 사용하여 시각화되었습니다. 밴드 회색 값은 ImageJ 소프트웨어로 정량화되었습니다.

세포 계수 키트-8 (CCK8)
형질전환된 세포를 0.25% 트립신(EDTA 프리)으로 약 3분간 소화한 후, 800 x g 에서 원심분리하여 5분간 투여합니다. 펠릿을 수집하고 세포 배양 배지에 재현탁하세요. 100 μL 세포 현탁액(2 x 103 셀) 을 96웰 플레이트에 시딩합니다. 세포 침착을 위해 37°C에서 5%CO2 를 넣고 24시간 인큐베이팅한 후, CCK8 용액 10 μL을 추가합니다. CCK8 해의 초기 첨가는 0 h로 지정됩니다. 450 nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 리더기를 사용해 0, 24, 48, 72 h에서 측정합니다.

유세포 검사
형질전환이 세포 세포자멸사에 미치는 영향은 Annexin V-fluorescein isothiocianate(FITC)/프로피듐 아이오다이드(PI) 염색 용액을 사용하여 평가하였습니다. 형질전환 후에는 위에서 설명한 동일한 트립신 소화 절차를 통해 세포가 소화되었습니다. 세포들은 인산염 완충식염수(PBS)로 세척된 후 재현탁되었습니다. 세포 펠릿은 800 x g 에서 5분간 원심분리하여 수집했습니다. 100 μL(약 1 x 105 세포)을 유동 세포검사관에 옮기고, 800 x g 원심분리기에서 5분간 실온에서 사용한 후 상원액을 버립니다. 세포를 195 μL Annexin V-FITC 결합 버퍼에 재현탁합니다. 혼합물에 5 μL Annexin V-FITC 및 10 μL PI 염색액을 첨가한 후 완전히 혼합합니다. 실온에서 어두운 곳에서 20분간 배양하세요. 그 후 처리된 유세포검사 튜브를 얼음 목욕에 넣어 임시 보관합니다. 분석 전에 셀 현탁액을 200마이크론 메시 필터로 여과한 후 재현탁합니다. 488 nm/636 nm 여기 상태에서 유세포 측정 시스템을 사용하여 세포 신호를 수집합니다.

효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)
종양 괴사 인자 알파(TNF-α), 인터루킨-6(IL-6), IL-1 베타(IL-1β)에 대한 상용 ELISA 키트를 사용하여 세포 염증성 사이토카인을 측정하였습니다. 특정 검출 절차는 다음과 같습니다: 적절히 희석된 표준 100 μL을 표준 웰에 추가합니다. 모든 빈 웰에 100 μL 세포 기저 배지를 추가하세요. 샘플 웰에 세포 상정액 50 μL과 1 x 검출 버퍼 50 μL를 추가합니다. 그 후 검출 항체 용액 50 μL을 적절한 웰에 첨가합니다. 마이크로플레이트를 덮고 실온에서 2시간 배양하세요. 웰에서 액체를 버리고 세척 버퍼로 6번 세척하세요. 최적의 결과를 얻으려면 우물이 철저히 건조되도록 하세요. 각 웰에 다시 100μL 스트렙타비딘 작업 용액을 추가하고, 플레이트를 밀봉한 후 실온에서 45분간 배양합니다. 마지막으로 100 μL 염색 기질을 추가한 후 어두운 곳에서 20분간 배양합니다. 그 다음 100 μL 스톱 용액을 넣고 부드럽게 섞습니다. 용액은 이제 밝고 노란빛을 띠며 강도가 다양한 액체로 나타납니다. 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm와 630 nm에서 용액의 광 밀도(OD)를 측정합니다. 이 두 값의 차이는 샘플 내 염증 인자의 농도에 해당합니다.

통계 분석
데이터는 상업적으로 이용 가능한 통계 소프트웨어를 사용해 처리 및 분석되었습니다. 모든 실험 결과는 세 번의 유효한 반복 결과로 구성되었습니다. 집단 간 비교는 독립적인 표본 t-검정과 분산 분석(ANOVA)을 사용했습니다. 투키 방법을 사용하여 다중 비교가 수행되었습니다. ROC 곡선을 사용하여 T2DM과 DKD에 대한 LINC00426의 진단 가치를 평가하였습니다. 로지스틱 회귀분석을 통해 DKD의 위험 요인을 평가하였습니다. P < 0.05 는 해당 데이터 결과에 대한 통계적 유의성을 나타냅니다.

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결과

건강한 개인과 T2DM 환자 간의 기초 특성 비교
연구는 280명의 T2DM 환자와 186명의 건강한 환자를 대조군으로 등록하였습니다. 참가자들의 의료 기록 분석( 표 1 참조)에서 대조군의 평균 연령은 17.63세± 58.91세였으며, 이는 2형 당뇨병 환자의 59.50± 17.14세보다 높음을 확인하였습니다. 그러나 두 환자 그룹 간 성별이나 비만에는 유의미한 차이가 없었습니다. 추가 비교 결과, 대조군과 비교했을 때 제2형 당뇨병 환자들은 체질량지수(BMI), 중성지방, 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C), 혈압, 공복 혈당(FBG), 당화 헤모글로빈(HbA1c), 공복 인슐린 수치(P < 0.0001)가 유의하게 높았다. T2DM 환자는 고밀도 지단백 콜레스테롤(HDL-C) 수치가 현저히 감소한 것으로 나타났습니다.

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토론

DKD는 T2DM에서 심각한 미세혈관 합병증을 나타냅니다. 가장 초기 증상은 미세알부민뇨의 존재입니다; 초기 단계에서 이를 발견하면 DKD 진행이 지연될 수 있습니다. 그러나 미세알부민뇨는 일상적인 소변 분석에서 민감도가 낮아 자주 간과됩니다43. 이 연구는 LINC00426 2형 당뇨병 환자에서 하향 조절되며, 2형 당뇨병과 DKD 모두에 진단적 가치를 지닌다는 것을 발견했습니다. 더 나아가, LINC00426 HG 신장 상피세포의 세포자멸사를 줄이고 세포 염증 수준을 낮춤으로써 DKD를 예방할 수 있습니다.

이 연구 결과는 UACR의 DKD 예측 AUC가 0.917(0.890–0.944)이며, 민감도는 81.3%, 특이도는 87.6%임을 보여주었습니다. DKD 예측에 있어 LINC00426의 ROC는 0.856(0.816–0.895)였으며, 민감도는 79.59%, 특이도는 ...

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공개 사항

이 연구에는 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

해당되지 않습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.25% trypsinGibco25200056
Annexin V-FITC Apoptosis Detection KitBeyotimeC1062S
세포 배양용 항생제GibcoR-015-10
Aristo 특정 단백질 검출기GOLDSITEGPP-100
Bax 항체Cell signaling Technology2772
BCA 단백질 분석 키트BeyotimeP0013B
Bcl-2 (124) 마우스 단클론 항체Cell signaling Technology15071
beta-Actin (13E5) 토끼 단클론 항체Cell signaling Technology4970
혈당 모니터Yuwell710
Caspase-3 항체Cell signaling Technology9662
CCK-8 시약Sigma96992
ChamQ Universal SYBR qPCR Master MixVazymeQ711
클로로폼Sigma-AldrichC2432
Clarity Western ECL 기질Bio-Rad1705061
일정 온도 세포 인큐베이터SaiLunDHP-9032
D-GlucoseMedChemExpressHY-B0389
유체 세포계Beckman coultedCytoFLEX클로로폼
형광량 정량 PCR 기기RocheLight Cycler 96
태아 우 혈청Sigma-AldrichF0193
완전 자동화된 당화 헤모글로빈 분석기Hanyu medicalHLC-723G11페놀
유전자 PCR 증폭기Bio RadS1000
사구체 간질 세포, HGMCSunncell Biotechnology Co., Ltd.SNP-H252
인간 기본 IL-1 beta ELISA 키트InvitrogenECH002
인간 IL-6 ELISA 키트InvitrogenEH2IL6
인간 신장 상피 세포, HK-2Sunncell Biotechnology Co., Ltd.SNL-165
인간 TNF 알파 ELISA 키트InvitrogenKAC1751
IkappaB alpha (L35A5) 마우스 단클론 항체Cell signaling Technology4814
K-SFM 배지Invitrogen17005-042
Lipofectamine 3000 InvitrogenL3000015
만니톨Sigma-AldrichM9647
다기능 효소 결합 면역 흡수 분석기 리더TECANGENios Plus
NF-kappaB p65 (D14E12) 토끼 단클론 항체Cell signaling Technology8242
무지방 우유BiosharpBS102-500g
Opti-MEM™ I 저축 혈청 배지Invitrogen31985062
P3000 시약InvitrogenL3000-015
PBS 완충액Sangon BiotechE607080
페놀Sigma-AldrichP1037
Phospho-NF-kappaB p65 (Ser536) (93H1) 토끼 단클론 항체Cell signaling Technology3033
일차 세포 완전 배지Sunncell Biotechnology Co., Ltd.SNPM-H252
Prime Script RT 시약 키트TakaraRR037A
PVDF 멤브레인Merck Millipore SE1M003M00
로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일BeyotimeP1045
TrizolInvitrogen15596026CN
자외선 분광 광도계ThermoNanodrop 2000

참고문헌

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