방법 논문

류마티스 관절염 환자에서 원발성 섬유아세포 유사 접활세포의 분리 및 확인

531 조회수

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DOI:

10.3791/70116

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2026년 2월 24일

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1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 류마티스 관절염 환자의 유활 조직에서 고순도 일차 섬유아세포 유사 시노비오사이트(FLS)를 분리하고 식별하여 신뢰할 수 있는 질병 모델링 및 약물 선별 방법을 설명합니다.

초록

류마티스 관절염(RA)은 주요 병리학적 특징으로 놀이막 과형성과 진행성 관절 파괴를 특징으로 하는 만성 자가면역 염증 질환입니다. 섬유아세포 유사 접피세포(FLS)는 RA 발병 기전에서 핵심적인 세포 구성 요소로 인식되며, 공격적이고 종양과 유사한 행동으로 연골과 뼈 파괴를 매개합니다. 류마티스 관절염 섬유아세포 유사 시노비오사이트(RA-FLS)의 분리 및 정제는 질병 기전 조사와 잠재적 치료제 평가에 중요한 도구입니다. 여기서는 RA 환자의 무릎 치환술 중 절제된 활막 조직 샘플에서 원발성 인간 RA-FLS를 분리, 배양, 기능적으로 검증하는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 신선한 활막 조직을 활용하고, 트립신과 콜라겐제 II형을 이용한 순차적인 효소 소화 과정을 사용하여 조직 기질에서 RA-FLS를 극대화합니다. 마지막으로, 세포 식별은 비멘틴 면역형광과 유동세포검사를 통해 이루어지며, TNF-α 유도 증식에 대한 기능적 평가를 보완합니다. 이 프로토콜은 특정 표현형 특성과 염증 반응성을 가진 고순도 RA-FLS 배양을 획득할 수 있게 하여, 연구자들이 약물 스크리닝, 기전 연구, 조직 공학 응용에 적합한 단기 배양 환자 유래 RA-FLS를 신뢰성 있게 얻을 수 있는 방법을 제공합니다.

서론

류마티스 관절염(RA)은 말초 관절의 대칭적 다발성 관절염을 특징으로 하는 만성 자가면역 염증 질환으로, 전 세계적으로 약 0.5%-1%의 유병률을 가지고 있으며, 다양한 전신 및 관절 외 합병증을 유발할 가능성이 있습니다. 1,2,3,4,5. RA의 핵심 병리적 특징은 자가면역 반응에 의해 매개되는 만성 두막염으로, 이는 관절 연골과 연골하 골을 침식하는 침습성 판누스 조직의 형성으로 이어집니다. 이 중 활막염은 RA의 가장 초기이자 중심적인 병리학적 특징을 대표합니다. 섬유아세포 유사 시노비오사이트(FLS)는 유세포의 주된 거주 세포로서, 유활 염증과 골 파괴를 모두 조율하는 데 핵심적인 역할을 합니다 8,9. 류마티스 관절염의 방활 염증 반응 동안, 류마티스 관절염 섬유아세포 유사 시노구(RA-FLS)는 정상적인 '조절적' 표현형을 잃고 대신 '염증 촉진' 프로필을 보입니다10. 이 변화는 염증성 사이토카인의 대량 생산을 초래하며, 이는 관련 에너지 대사 경로를 활성화하여 세포 증식을 증가시키고 11,12,13의 활막 염증 연쇄 반응을 더욱 증폭시킵니다. 동시에 RA-FLS는 대식세포, T 세포, B 세포 등 다른 면역 세포와 상호작용하여 지속적인 만성 염증 상태를 유지합니다14,15. 더 나아가 RA-FLS는 향상된 이동 능력, 침습성, 통제되지 않은 증식, 세포자멸사 저항성 등 암과 유사한 특성을 보이며, 연골과 뼈 침식 과정에 적극적으로 관여합니다16.

최근 몇 년간 FLS는 RA와 같은 관절염 질환 연구를 위한 시험관 내 모델로 널리 활용되고 있으며, 이는 부분적으로 현재 1차 약물치료의 한계에 의해 촉진된 추세입니다17, 18, 19. 이들은 2D 배양, 3D 모델, 장기 온 칩 시스템에서 질병 기전 조사, 치료 표적 검증, 약물 스크리닝수행에 사용됩니다. 더 나아가, RAFLS는 DMARDs 반응을 예측하기 위한 환자 유래 유래 오가노이드를 포함한 첨단 응용의 기초 역할을 합니다; RA 진행에서 유전자 기능을 연구하기 위한 CRISPR/Cas9 유전자 편집; 기능적 활막 조직 이식편24, 25, 26을 위한 세포 공급원으로도 활용됩니다.

류마티스 관절염 환자의 접막 조직에서 단기 배양된 RA-FLS를 얻는 것은 많은 실험의 초기 단계입니다. FLS 세포주와 비교할 때, 단기 배양된 환자 유래 RA-FLS는 환자 간 이질성과 질병 특이적 특성을 유지하여 질병 관련 전사 인자와 경로 조절 차이를 보다 진정성 있게 표현할 수 있습니다. 따라서 세포 수율, 성장 속도, 기능 성능은 연령, 질병 기간, 약물 이력, 질병 활동 등 환자 특이적 요인에 의해 영향을 받을 수 있어 배치 간 변동성이 어느 정도 발생할 수 있습니다. 따라서 연구자들은 사용 전에 조직원의 임상적 배경을 평가하고, 초기 통과(P3-P7) 내에서 실험을 수행하여 세포의 표현형 안정성을 유지해야 합니다.

이 연구는 무릎 滑막 조직에서 RA-FLS를 추출하고 식별하는 간소화된 프로토콜을 상세히 설명합니다. 이 방법은 순차적인 효소 소화(트립신 후 타입 II 콜라겐제)와 부드러운 기계적 해리를 결합하여 사용합니다. 이러한 최적화된 다단계 효소 전략은 일반적으로 단일 효소 또는 비순차적 혼합효소 치료보다 더 우수한 성능을 보이며, 이는 세포 생존력과 표현형 27,28,29,30을 저해할 수 있습니다. 이에 비해 제시된 프로토콜은 고생존성, 고순도 RA-FLS의 보다 효율적이고 부드러운 분리를 가능하게 하여 세포 손상과 표현형 손실을 최소화하여 후속 기능 검사에 적합함을 보장합니다.

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프로토콜

이 연구는 중국-일본 우호병원에서 관절 치환 수술을 받는 류마티스 관절염 환자의 滑막 조직을 수집하였습니다. 모든 환자는 수술 전에 서면 동의서를 제공하였습니다. 수집된 정보와 생물학적 샘플은 환자의 프라이버시와 데이터 보안을 엄격히 보장하기 위해 취급되었습니다. 남아 있던 활막 조직 표본은 생물안전 규정에 따라 폐기되었습니다. 이 연구에서 류마티스 관절염 환자의 무릎관절 상활 조직 사용은 중일 우호병원 윤리위원회(승인 번호: 2025-KY-223)의 승인을 받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 滑막 조직의 획득 및 준비

참고: 수술 중 얻은 滑막 조직은 0.9% 식염수 용액 또는 PBS가 채워진 멸균 용기에 보관하여 수술실에서 생물안전 캐비닛으로 옮길 때 오염을 방지하세요. 세균 또는 곰팡이 오염을 예방하고 이후 실험의 성공을 보장하기 위해 에탄올 침수 후 페니실린-스트렙토마이신 용액으로 세척하는 것이 중요합니다.

  1. 신선한 접막 조직을 PBS가 들어 있는 50mL 원심분리관에 담근 후 생물안전 캐비닛으로 옮깁니다.
  2. 세포 조직을 75% 에탄올이 들어간 페트리 접시에 옮기고 30초간 담가 소독합니다.
  3. 멸균 수술용 가위와 겸자를 사용해 활막 조직에서 지방과 뼈 조직을 제거한 후, 남은 조직을 새로운 배양 접시로 옮깁니다.
  4. 얻은 활막 조직을 10% 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 PBS로 3번 세척합니다.

2. 활막 조직의 소화

참고: 트립신을 사용해 세포 접합부와 세포외 기질을 교란시켜 이후 분리를 진행하세요. II형 콜라게나제를 적용하여 세포외 기질 구조를 선택적으로 분해하여 세포가 기질에서 분리되도록 합니다. 유활 조직 박리에 필요한 모든 수술용 가위, 겸자, 세포 체는 사용 전에 오토클레이빙으로 멸균하세요. 소화 후 조직 조각은 느슨해지고 가장자리가 닳아 보이며, 배지는 약간 탁해질 수 있습니다. 소화되지 않은 조직은 여전히 조밀하고 불투명하게 유지됩니다.

  1. 가위로 조직을 반복해서 1mm × 1mm 조각으로 갈아내세요.
  2. 조직에 0.25% 트립신을 첨가하고 37°C에서 일정 온도 셰이커(100-150rpm) 또는 세포 인큐베이터에서 30분간 소화합니다.
  3. 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 사용해 10% 태아 소 혈청(FBS) 용액을 준비합니다.
  4. 조직을 조직 양에 따라 15 mL 또는 50 mL 원심분리관에 옮긴 후, 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함된 PBS로 중화하여 소화합니다.
  5. 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)로 가열한 후 상청액을 버리고 펠릿을 보관합니다.
  6. PBS에 펠릿을 다시 현탁하세요.
  7. 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)로 가열한 후 상원액을 버리고 펠릿을 보관합니다.
  8. 2형 콜라겐제 100mg을 50mL DMEM 배지에 첨가하여 2 mg/mL 2형 II 콜라겐제 용액을 만듭니다.
  9. 준비된 II형 콜라겐제 용액을 0.22 μm 막을 통해 여과하여 멸균합니다.
  10. 2 mg/mL 타입 II 콜라게나제를 추가하고 37°C 상온 셰이커(100-150 rpm)나 세포 인큐베이터에서 4시간 소화합니다.

3. 섬유아세포 유사 시노비오사이트의 분리 및 배양

참고: 모든 세포 배양 절차를 생물안전 캐비닛에서 멸균 조건에서 수행하며, 오염을 방지하기 위해 멸균 장갑을 착용하세요.

  1. DMEM 기저 배지를 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충하여 완전한 DMEM 배지를 준비합니다.
  2. 멸균된 페트리 접시 위에 100메시 세포 체를 놓고 소화된 활막 조직과 체액을 체에 부어줍니다.
  3. 잔류 조직이 있는 세포 체를 다른 멸균 페트리 접시로 옮기세요.
  4. 20mL 멸균 주사기 플런저 막대 끝을 이용해 남은 조직을 체에 갈아 흰색 섬유질 잔여물만 남게 하고 더 이상 세포 현탁액이 발현되지 않을 때까지 합니다.
  5. 체를 적절한 양의 완전한 DMEM 배지로 헹구세요.
  6. 모든 여과액을 수집하고, 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)를 사용해 상청액을 버립니다.
  7. 펠릿을 PBS에 다시 부유, 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)로 넣고 상청액을 버립니다.
  8. 세포를 완전한 DMEM 배지에 재현탁하세요.
  9. 세포 계수를 수행하고 세포를 배양 플라스크로 옮깁니다.
  10. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터(37 °C, 5% CO₂)에서 배양하세요.
  11. 48시간 후에 미디엄을 교체하세요.
  12. 세포가 완전히 융합될 때 트립신과 함께 1:3 비율로 소화하세요.

4. 비멘틴 면역형광 염색을 이용한 RA-FLS 식별

참고: 세포 세척에 사용되는 PBS 용액은 37°C에 설정된 물욕에서 미리 예열하세요. 이 절에서 지정한 모든 시약 부피는 48웰 플레이트 포맷에 맞게 표준화되어 있습니다. 다른 포맷의 플레이트를 사용할 때는 성장 면적에 비례하여 부피를 조정해야 합니다.

  1. 트립신으로 세포를 소화한 후 수확한 세포를 재현탁한 후 완전한 DMEM 배지를 사용해 1×10 4 세포/L로 희석합니다.
  2. RA-FLS를 48웰 플레이트에 200 μL의 웰당 용량으로 시딩합니다.
  3. 세포 배양 인큐베이터(37 °C, 5% CO₂)에 넣어 24시간 배양합니다.
  4. 배지를 버리고 미리 예열된 PBS로 세포를 세 번 세척하세요.
  5. 세포를 고정하기 위해 4% 파라포름알데히드를 10분간 추가하고, 고정제를 버린 후 PBS로 세 번 세척하세요.
  6. 웰당 PBS에 0.1% Triton X-100 용액 150 μL 준비합니다. 사용 전에 소용돌이 또는 부드러운 반전(gentle inversion)을 통해 완전한 혼합을 보장하세요.
  7. 웰에 0.1% Triton X-100 용액을 추가하고 10분간 배양하여 세포를 투과시킵니다.
  8. 0.1% Triton X-100 용액은 버리고 PBS로 세 번 세척하세요.
  9. 웰당 150 μL 동물성 차단액을 추가하고, 상온에서 1시간 배양합니다.
  10. 차단 솔루션을 버리세요. 각 웰에 150 μL 비멘틴 1차 항체 작용액(항체 희석제에 1:200 희석)을 추가합니다.
  11. 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
  12. 1차 항체는 버리고 세포를 PBS로 다섯 번 세척합니다.
  13. 웰당 150μL 알렉사 플루오르 488 결합 항토끼 IgG 2차 항체(범용 항체 희석제에 1:50 희석)를 첨가하고, 37 °C에서 빛으로부터 1시간 배양합니다.
  14. 2차 항체는 버리고 세포를 PBS로 세 번 세척합니다.
  15. 웰당 DAPI 함유 안티페이드 마운팅 매체 한 방울을 넣고, 어두운 곳에서 10분간 건조합니다.
  16. 20× 대물렌즈와 DAPI 및 FITC/GFP용 적절한 필터 세트가 장착된 역형 형광 현미경을 사용하여 이미지를 관찰하고 촬영합니다.
    참고: 세포를 PBS로 세척하려면 웰을 완전히 채우고 5분간 배양한 후 PBS를 제거하세요. 이 절차는 한 번의 세척 사이클을 구성합니다.

5. 유세포 측정을 이용한 RA-FLS 정량 및 순도 평가

참고: RA-FLS를 식별할 때 Vimentin과 CD90을 양성 마커로 사용하고, 면역 세포 오염을 배제하기 위해 음성 대조군으로는 CD68, CD14, CD11b를 적용하세요. 비멘틴은 주로 RA-FLS 세포질에 국한된 세포내 특이적 중간 필라멘트 단백질로 작용합니다. CD90은 RA-FLS에서 고도로 발현된 중요한 표면 표지자로서 면역 세포와 구별할 수 있게 합니다. CD68, CD14, CD11b는 대식세포, 단핵구, 골수세포에서 특이적으로 발현되지만, 면역 세포 오염을 배제하기 위한 음성 마커로 사용됩니다. 결합 특이성에 따라 세포 표면 마커에 플루오로크롬을 할당하고, 형광 채널 내 중복이 없도록 하세요. 예를 들어, 이 실험에서 CD90과 CD68은 동일한 형광색소를 공유합니다; 따라서 이들을 같은 원심분리기 튜브에 넣지 마세요. 비멘틴 항체로 배양하기 전에 고정제와 투과제를 첨가하여 세포막을 파괴합니다. 유세포계에 충분한 형광 채널이 있다면, CD90과 CD68과 같은 마커를 여러 채널에 할당하여 다색 동시 분석을 통해 검출 효율성과 정보 함량을 더욱 향상시킬 수 있습니다.

  1. EDTA 프리 트립신을 사용해 3세대 RA-FLS를 소화합니다.
  2. 완전한 DMEM 배지로 소화를 종료하고, 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)를 사용한 후 상원액을 버립니다.
  3. 펠릿을 PBS에 재현탁한 후 세포 계수를 수행하고, PBS를 사용해 세포 농도를 1× 10⁶ 세포/mL로 조절합니다.
  4. 세포를 세 개의 원심분리관에 분배하고, 각 관에 200 μL의 세포 현탁액을 추가합니다.
  5. CD11b 항체(범용 항체 희석제에 1:100으로 희석)를 최종 부피 100 μL로 튜브 1에 첨가합니다. 소용돌이를 섞으려고 합니다.
    1. 15분 배양 후 1 튜브에 1mL 고정/투과제를 넣고, 혼합을 위해 소용돌이를 넣은 후 빛을 차단한 상태로 30분간 배양합니다.
    2. 투과를 종료하기 위해 튜브 1에 고정/투과화 버퍼 1mL를 추가하고, 혼합할 와류를 넣은 뒤, 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)를 사용하고, 상원액을 버립니다.
    3. 비멘틴과 CD68 항체 칵테일 100 μL(각각 범용 항체 희석제로 1:100 희석)을 준비하고, 튜브 1에 넣고 보텍스를 섞은 후 빛을 차단한 상태로 30분간 배양합니다.
    4. 1번 튜브에 고정/투과화 버퍼 1을 넣고, 혼합물을 위해 와류를 넣은 뒤 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)를 넣고 상원액을 버립니다.
    5. 1번 튜브에 1번 튜브에 알렉사 플루오 488 결합 항토끼 IgG 2차 항체(범용 항체 희석제에 1:50 희석)를 첨가합니다. 보텍스를 섞어 30분 동안 빛으로부터 보호해 부양하세요.
    6. 1번 튜브에 버퍼 1mL를 넣고, 혼합할 와류를 넣은 뒤 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)하고 상원액을 버립니다.
    7. 튜브 1에 버퍼 300 μL을 추가하고, 로딩 샘플을 위해 소용돌이를 혼합합니다.
  6. CD90과 CD14 항체(각각 범용 항체 희석제에 1:100 희석)를 튜브 2에 추가하여 최종 부피 100 μL에 도달합니다. 튜브 3은 항체 없이 음성 대조군으로 남겨둡니다.
    1. 15분 배양 후 2번과 3번 튜브에 1mL PBS를 추가합니다.
    2. 원심분리기 튜브 2와 3(4 °C, 500 × g, 5분)에서 상청액을 버리고 버퍼 300 μL를 추가한 후 소용돌이를 통해 로딩 샘플을 혼합합니다.
  7. 준비된 샘플의 유세포분석(flow cytometry) 채취를 수행합니다.
  8. 유세포검사 데이터를 분석하고 호환 소프트웨어를 사용해 통계를 수행합니다.

6. MTS 분석법을 이용한 TNF-α 유도 RA-FLS 증식 측정

  1. EDTA 프리 트립신을 사용해 3세대 RA-FLS를 소화합니다.
  2. 완전한 DMEM 배지로 소화를 종료하고, 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)를 사용한 후 상원액을 버립니다.
  3. 완전한 DMEM 배지에 펠릿을 재현탁하고, 셀 카운팅을 수행한 후 1× 10⁵ 셀/L로 희석합니다.
  4. 재현탁된 세포를 100 μL의 96웰 플레이트에 시딩합니다.
  5. 세포 배양 인큐베이터에서 접착이 일어날 때까지 배양한 후, 블랭크 컨트롤 그룹과 개입 그룹으로 나눕니다.
  6. 중재군에는 10 ng/mL TNF-α을, 빈 대조군에는 동일한 양의 PBS를 추가합니다.
  7. 24시간 후 각 웰에 10 μL MTS 시약을 추가하고 세포 배양 인큐베이터에서 계속 배양합니다.
  8. 1시간 인큐베이션 후, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 490 nm 거리에서 흡광도(OD)를 측정합니다.
  9. 각 우물의 OD 값을 기반으로 세포 증식의 생존력을 계산합니다.

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결과

이 프로토콜을 사용하여 단기 배양 환자 유래 RA-FLS를 성공적으로 분리했습니다. 절차적 워크플로우의 개략도가 제공된다(그림 1). 광현미경 검사에서 RA-FLS는 주된 형태학적 표현형인 방추 모양의 불규칙한 다각형 세포를 보였다. 세포들은 광범위한 세포질 확장과 길쭉한 돌기로 나타났다. 세포 간 접촉 또는 겹치는 영역에서는 세포 경계가 다소 불분명하게 보였습니다. 대부분의 세포는 편광된 확장된 비교적 투명한 세포질을 보였습니다. 핵은 주로 타원형이거나 길쭉했으며, 대부분 세포 내 중앙 또는 편심 방향에 위치했다(그림 2A).

Vimentin에 대한 면역형광 염색 결과, 분리된 RA-FLS의 >98%가 강한 양성 발현을 보였으며, 특징적인 섬유형 세포골격 분포를 보였습니다(그...

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토론

이 프로토콜은 RA 환자로부터 RA-FLS를 분리하고 단기 배양하는 재현 가능한 방법을 확립하며, 높은 세포 생존성, 특징적인 표현형, 특이적 표지 발현, 염증 자극에 대한 기능적 반응성을 통해 성공을 입증합니다.

중요한 단계와 기술적 고려사항
이 방법의 신뢰성은 여러 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 신선한 활막 조직은 획득 후 4-6시간 이내에 효소 소화를 받아야 합니다. 조직은 일시적으로 -80 °C에 저장할 수 있지만, 최적의 활막 세포 생존성을 보장하기 위해 저장 기간을 길게 유지해서는 안 됩니다31. 둘째, 초기 조직 처리 과정에서 지방 및 골 조직을 세밀하게 제거하는 것이 지방세포와 골세포의 오염을 막는 데 매우 중요하며, 이러한 오염은 이후 세포 배양의 특성을 변화시킬 수 있습니다. 셋째, 트립신과 콜라겐제 II형을 이용한 ...

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공개 사항

저자들은 이 작업에 이해 충돌이 없다고 보고하며, Figure 1 생성에 Figdraw를 사용하는 것이 플랫폼의 라이선스 조건을 준수하고 있음을 확인했습니다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(82074223호, 8207141673호)과 중앙정부 핵심 프로젝트인 가치 있는 중의학 자원의 지속 가능한 이용 확립(2060302호)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Alexa Fluor 488-접합 항토끼 IgG중산 징차오 생명공학ZF-0511
0.25% 트립신-EDTA (1배)깁코25200-072
4% 파라포름알데히드솔라비오P1110
알렉사 플루어674 반인간 CD68바이오레전드562111
동물 없는 차단 솔루션세포 신호 전달 기술15019
APC 대인간 CD90바이오레전드559869
BD FACSDiva Software 8.0.2BD 생명과학657925
BD LSRFortessaBD 생명과학647177
BV605 항인간 CD11b비데겐트563015
CellTiter 96 AQueous One Solution 세포 증식 분석법(MTS)프로메가G358A
콜라게나제 II솔라비오C8150
DAPI 함유 형광 마운팅 배지중산 징차오 생명공학ZLI-9556
DAPI 함유 형광 마운팅 배지중산 징차오 생명공학ZLI-9556
둘벡코 변형 이글 미디엄(DMEM), 고혈당하이클론SH30022.01
태아 소 혈청-슈퍼파인 (FBS)상하이 중차오 신단 생명공학 유한회사.ZQ0500
FITC 반인간 CD14바이오레전드325604
PBS, 1× (pH 7.4) 인산염 완충 식염수서비스바이오G4202
페니실린-스트렙토마이신 혼합액 (이중 항생제) 100회 이상 투여;상하이 중차오 신단 생명공학 유한회사.CSP006
QuickBlock 범용 단백질 차단 및 항체 희석 완충제비요타임P0270-500ml
재조합 인간 TNF-&α;페프로텍300-01A
전사 인자 염색 버프e바이오사이언스00-5523-00
트리톤 X-100솔라비오T8200
트립신 용액 (EDTA 무첨가)베이징 라브직 테크놀로지 유한회사.BL526A

참고문헌

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