이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

도플러 심초음파를 이용한 박출률이 보존된 심부전 마우스 모델에서 관상동맥 혈류 예비력 평가

383 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70135

⸱

2026년 3월 24일

 ,  ,  , 
1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University, 2Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Nanjing University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 박출률이 보존된 쥐 모델에서 관상동맥 미세혈관 기능 장애를 신속하고 비침습적으로 평가하는 접근법을 설명합니다. 관상동맥 유량(CFR)은 도플러 초음파 유도 좌관동맥 위치 확인에 의해 결정되며, 이는 고풍기와 기저 관상동맥 유속의 비율로 계산됩니다.

초록

보존 박출률(HFpEF)을 동반한 심부전은 효과적인 치료법이 부족해 상당한 전 세계 보건 부담이자 주요 임상적 도전 과제이며, 기저 병태생리학은 여전히 불분명합니다. HFpEF 환자에서 매우 흔한 관상동맥 미세혈관 기능 장애(CMD)는 좌심실 이완기 및 수축기 기능 모두를 손상시키는 심근 허혈을 유발합니다. 미세혈관 기능 장애가 HFpEF의 핵심 특징인 점을 고려할 때, CMD는 현재 그 발병 기전에서 중요한 요인으로 간주됩니다. 관상동맥 혈류 예비량(CFR)은 최대 고혈기와 안정 시 혈류 속도의 비율로 정의되며, 심근허혈의 매우 중요한 지표입니다. 더 나아가, 관상동맥 및 미세혈관 관상동맥이 심근 관류에 미치는 복합적인 혈역학적 효과를 측정하여 관상동맥 혈관운동 장애의 포괄적인 지표 역할을 합니다. 이 프로토콜은 도플러 심초음파를 이용해 HFpEF 마우스 모델에서 CFR 변화를 평가하는 데 중점을 두었습니다. 이 연구에서 대조군 쥐는 이소플루란 유도 혈관 확장에서 안정 시의 혈관 확장이 있을 때 최대 관상동맥 혈류 속도가 2배 이상 증가한 반면, HFpEF 마우스에서는 이 반응이 유의하게 감소했습니다. HFpEF에서는 감소된 CFR이 부작용을 예측하고 기저 미세혈관 기능 장애를 반영하여 질병 진행 연구와 환자 선택을 안내하는 핵심 도구로 자리매김합니다.

서론

박출률이 보존된 심부전(HFpEF)은 HF의 주요 형태이며 예후가 좋지 않은 것과 관련이 있습니다. 그러나 이와 관련된 이환율과 사망률을 줄일 수 있는 입증된 치료법은 없습니다 1,2. 고령, 고혈압, 당뇨병, 지질이상, 비만 등 여러 위험 요인의 존재 가 HFpEF3의 복잡성과 이질성을 뒷받침합니다. 최근 몇 년간 누적된 증거에 따르면, 관상동맥 미세혈관 기능 장애(CMD)는 HFpEF의 동반 질환이 아니라 독립적이고 직접적인 위험 요인임이 밝혀졌습니다 4,5,6. 기능적 및 구조적 이상이 모두 동반되는 관상동맥 미세혈관 기능 장애가 HFpEF 7,8에서 심내막하 허혈, 확산성 간질성 섬유증, 좌심실 기능 장애의 근저입니다. CMD가 심혈관 질환에서 병리학적 역할을 하는 방대한 연구가 진행되었습니다 9,10. 임상 연구에서는 미세혈관 기능장애(CFR <2.0 기능 저하로 입증됨)가 좌심실 이완기 기능 저하와 직접적으로 연관되어 있으며, HFpEF11에서 유망한 치료 표적이 될 수 있음이 밝혀졌습니다. 보전된 박출률 심부전에서 미세혈관 기능 장애의 유병률에 대한 심초음파 평가(PROMIS-HFpEF 연구)에서 좌관상동맥의 CFR 측정을 바탕으로 HFpEF 환자의 75%가 CMD를 가지고 있음이 밝혀졌습니다12. 더불어, 비정상적인 CMD는 부작용 위험 증가와 상관관계가 있었으며, 여기에는 유의미하게 사망 위험도 증가했다13,14. 따라서 CMD를 동물 모델에서 핵심 바이오마커로 활용하면 HFpEF 병태생리학 연구가 크게 용이해지고 질병 표현형의 성공적인 복제 검증에 도움이 됩니다.

현재 관상동맥 미세혈관 기능 평가를 위한 방법들, 예를 들어 양전자 방출 단층촬영(PET), 심혈관 자기공명(CMR), 분수 유량 예비(FFR), 미세순환저항지수(IMR)는 동물의 크기가 작고 전용 영상 장비의 가용성이 제한적이기 때문에 설치류 연구에 적용하기 어렵습니다. 관상동맥 유량 예비(CFR)는 국제 지침에 의해 관상동맥 생리학을 조사하는 도구로 권장됩니다15,16. 더불어, CFR은 심장 허혈의 신뢰할 수 있는 지표이자 관상동맥 혈관 기능 장애의 척도, 심혈관 위험의 귀중한 예후 지표 역할을 합니다17. CFR 평가를 위한 도플러 심초음파는 전임상 설치류 모델에서 전반적인 관상동맥 혈관 기능을 평가하는 검증되고 재현 가능한 방법입니다. 이전 연구에서는 심근 허혈-재관류 손상의 마우스/쥐 모델에서 CFR의 사용이 보고되었으나, HFpEF 동물 모델에는 적용된 적이 없습니다. 더불어, 본 연구에서 설명한 CFR 평가 방법은 컬러 도플러 심초음파를 이용해 LCA를 신속히 찾아내며, 당뇨병성 심근병증, 고혈압성 심장병, 만성 염증성 또는 자가면역 질환 등 다양한 동물 모델로 확장할 수 있습니다. 본 연구에서는 마우스 모델에서 심외막 관상동맥 협착증이 없음을 감안할 때, 관상동맥 유량 예비력(CFR) 감소는 주로 심외막과 미세혈관 복합 기여보다는 관상동맥 미세혈관 기능 장애를 반영합니다. 따라서 CFR은 이 HFpEF 모델에서 CMD의 신뢰할 수 있는 대체 표지 역할을 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

모든 절차는 난징 드럼타워 병원 기관윤리위원회(승인번호 20011141)가 승인한 프로토콜을 준수했으며, 동물 연구: 생체 내 실험 보고(ARRIVE) 지침을 준수했다20. 본 연구에서는 6주에서 8주 된 수컷 C57BL/6J 마우스(BW, ~25g)에서 HFpEF 모델을 확립하였습니다. 실험 기간 내내, 쥐들은 특정 병원체가 없는 방에 보관되었으며, 온도(23 ± 1 °C), 습도(65%–70%), 12시간의 밝고 어둠 주기가 조절된 조건을 유지했습니다. 모든 동물은 자유롭게 음식과 물을 사용할 수 있었다. 연구 후 쥐들은 1.5% 이소플루란으로 마취하고 경추 탈구로 안락사되었습니다. 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. HFpEF 마우스 모델 구축

  1. 쥐를 무작위로 두 그룹으로 나눕니다: 대조군(CTRL) 그룹과 HFpEF 그룹, 각각 8마리의 쥐가 있습니다.
  2. 다음과 같이 확립된 프로토콜 21,22,23,24,25를 사용하여 HFpEF 마우스 모델을 유도합니다:
    1. 6주에서 8주 된 쥐에게는 고지방 식단(HFD, 지방 60%)을 먹이고, 0.5 g/L N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스터(L-NAME)를 8주간 식수에 녹여 제공한다.
      참고: L-NAME의 식수는 갈색 병에 담아 빛 노출을 피하고 2-3일마다 리프레시하세요.
  3. 연령에 맞는 쥐들에게 표준 정상 식단을 주고, 대조군과 같은 기간 동안 정기적으로 물을 마셔야 합니다.

2. 심초음파를 통한 관상동맥 혈류 예비력 평가

  1. 심초음파 평가 전에 마취실에서 1.5% 증발된 이소플루 란을 1.5–2.0 L/min 속도로 100% O₂ 유량으로 투여하여 마취합니다.
    주의: 이소플루란은 휘발성 마취제입니다. 운영 중에는 충분한 환기를 보장하세요. 액체 이소플루란을 베이퍼라이저에 추가할 때는 피부 접촉을 피하기 위해 니트릴 장갑을 착용하세요.
  2. 피부 꼬임과 발가락 또는 꼬리 자극에 반응이 없음을 확인한 후, 동물을 영상 플랫폼에 눕혀 눕히세요.
  3. 가스 마취 기계를 챔버에서 마스크 전달로 전환하고, 시술 내내 마취 농도를 1.5%로 일정하게 유지하세요.
  4. 영상 플랫폼의 구리판(ECG 전극)에 전도성 젤을 바르고 네 발을 테이프로 붙여 생리학적 데이터(심전도 및 호흡)를 획득하세요.
    참고: 유지 관리를 위해 이소플루란을 1.5%로 유지하고, 내장 온열 플랫폼을 사용해 체온을 37°C에 가깝게 유지하세요. 영상 촬영 중 생리적 안정성을 위해 분당 100–140회 목표 호흡 속도를 유지하세요.
  5. 면 팁 어플리케이터로 제모 크림을 발라 가슴털을 제거하세요.
  6. 영상 촬영을 위해 물에 적신 거즈로 과도한 크림과 느슨한 털을 닦아내세요.
    참고: 피부 자극이나 독성을 방지하기 위해 잔여 제모 크림을 완전히 제거하세요.
  7. 양쪽 눈에 멸균 윤활 안과 연고를 바르어 공막 건조를 방지하세요.
  8. 초음파 투과 젤을 심장 전방에 적용하고, 영상 플랫폼을 수평에 대해 대략 30°–45° 각도로 위치시킵니다.
    참고: 초음파 젤에 기포가 들어가지 않도록 주의하세요.
  9. 고주파 초음파 변환기를 천천히 흉골 측 선에 놓고 흉부와 평행하게 정렬하여 좌심실의 조정된 흉부 측 장축(PLAX) 뷰를 얻으세요(그림 1A).
  10. 탐침을 각도로 조절해 가슴 벽에 가볍게 닿도록 하여 압박을 피하세요.
  11. 밝은 모드 버튼을 눌러 밝기 모드 이미징으로 전환하세요.
  12. 탐침과 영상 플랫폼의 각도를 조정하여 좌관상동맥(LCA)을 찾으세요.
    참고: 음향 창 내에서 좌심실(LV), 좌심실(LA), 좌심실 전벽(LVAW), 좌심실 후벽(LVPW), 뇌실 중격(IVS), 대동맥(AO), 폐동맥(PA), 폐정맥(PV), 승모판(MV), 유두근을 식별하세요.
  13. 터치스크린의 컬러 도플러 버튼을 눌러 컬러 도플러 모드를 활성화하세요. 실시간 표시에서 대동맥판막에서 프로브 쪽으로 흐르는 혈류는 빨간색으로 나타납니다.
  14. 대동맥동에서 원위 가지 부위까지 전체 LCA를 시각화하면서도 폐정맥 흐름 간섭을 최소화하기 위해 탐침 각도와 위치를 조정하세요.
  15. 펄스파 도플러(PW) 모드를 활성화하세요. PW 측정 창을 LCA 혈류 방향과 평행하게 위치시키세요(그림 1B, C).
    참고: 인소네이션 각도를 60° 이하로 유지하고, 도플러 커서를 관상동맥 흐름과 평행하게 정렬하여 실시간 각도 보정을 적용하세요.
  16. 기본 LCA 흐름 속도 파형을 캡처하려면 클립 저장 을 선택하세요.
  17. 이소플루란 농도를 3%로 올리면 관상동맥 유속이 점진적으로 증가하는 것을 관찰합니다.
  18. 3% 이소플루란에 45초간 연속 노출된 후, 고생기 관상동맥 유속을 캡처하기 위해 Save Clip 을 선택하세요.
    참고: LCA 혈류를 지속적으로 모니터링하세요. 호흡기 또는 심장 운동으로 인해 PW 샘플 부피가 이동하면 채취를 일시정지하고, 컬러 도플러 모드로 돌아가 LCA를 재식별한 뒤, PW 게이트를 재배치한 후 PW 모드를 재개합니다.
  19. 완료 후에는 이소플루란 흡입을 중단하고 초음파 젤을 제거하세요. 쥐를 완전히 회복할 때까지 온열 패드 위에 올려놓은 뒤, 다시 케이지로 돌려놓으세요.

3. 통계 분석

  1. 분석 소프트웨어에서 3회 연속 심장 주기의 평균 측정값을 추적하여 기준선 및 최대 LCA 유속 속도를 산출했습니다. CFR을 고혈증 이완기 관상동맥 혈류 속도와 기저선 이완기 관상동맥 혈류 속도(CFV)의 비율로 계산합니다.
  2. 실험자와 데이터 분석가 간에 이중 맹측 설계를 구현하세요. 샤피로-윌크 검정을 사용하여 정상성을 평가합니다. 양측 무쌍 학생 t-검정을 사용하여 정규 분포 데이터를 분석합니다. 비정규 분포 데이터를 Mann–Whitney U 검정을 사용해 분석합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

이 연구에서는 16마리의 쥐(HFpEF, n = 8; CTRL, n = 8)가 사용되었습니다. 좌관상동맥은 흉골 측근 장축(PLAX) 뷰에서 컬러 도플러 유도 하에 확인되었고, 관상동맥 유속은 펄스파(PW) 도플러를 사용해 측정하였다. 각 마우스로부터 1.5%(기준선)와 3%(과호흡) 농도에서 충분히 재현 가능한 이미지를 획득한 후, 최소 3회의 연속 심장 주기에서 측정값을 평균하여26 CFR이 결정되었습니다; 대표적인 결과는 그림 2에 나와 있습니다. 동일한 영상 세션 동안 마우스당 단일 고풍기 자극만 수행되었습니다.

초기 평가는 관상동맥 미세혈관 기능 장애를 평가하기 전에 첨단 4개 심초음파를 이용한 HFpEF 마우스 모델의 성공적인 복제 여부를 확인하는 것이었습니다. 이 결과는 HFpEF 그룹에서 E/A 비율과 E/e'...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

본 연구는 HFpEF 동물 모델에서 거대 및 미세혈관 기능 장애를 평가하기 위해 비침습적이고 간단하며 재현 가능한 방법을 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 관상동맥 흐름 예비 평가를 위한 도플러 심초음파는 유럽 심장학회에서 검증되고 재현 가능한 방법으로 인정받고 있습니다15. C57BL/6J 마우스의 정상적인 생리학적 조건에서 관상동맥 유량 예비량은 ≥2.0으로 예상됩니다. 이 연구에서 CTRL 그룹과 비교했을 때, HFpEF 마우스는 CFR이 유의미하게 감소하여 관상동맥 미세순환 4,20,27 장애를 시사하였다.

실시간 동시 B-모드 및 펄스파 도플러 영상은 소형 선박 평가에 유용한 도구입니다. 그러나 펄스 반복...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적·상업적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 난징 우수 젊은 과학자 기금의 지원을 받았으며, 난징 보건부 의학과학기술개발재단(JQX22001) 지원 핵심 프로젝트; 중국 박사후 과학기금 (2023M731631); 난징대학교 의과대학 드럼타워병원 산하 임상시험 자금 지원(2024-LCYJ-PY-29); 장쑤성 보건가족계획위원회 연구재단(MQ2024049).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
동물 생리 모니터후지필름베보 3100심박수, 호흡수, 체온을 모니터링하세요
C57 마우스젬파마테크 주식회사
카메라캐논, 일본EOS R50영상 플랫폼과 초음파 프로브의 위치를 기록하세요
제모 크림비트, 프랑스어제모
거즈호기심CAR-6339-PK무미
이소플루란보상R510-22-10마취
N-니트로-L-아르기닌 메틸 에스터 (L-NAME)시그마-올드리치N5751HFpEF 마우스 모델 소개
연구 식단, 지방 60%   그리고 nbsp;리서치 다이츠, Inc. 그리고 nbsp; D12492고지방 식단
수술용 온도 정지 가열 패드글로벌레비오, 중국GE0-20W온도 조절
초음파 젤파커 연구소W60698L초음파 투과 젤
Vevo 3100 전임상 영상 플랫폼후지필름베보 3100심초음파
VevoLAB 소프트웨어후지필름VevoLAB 3.2.6심초음파 데이터 분석

참고문헌

  1. Redfield, M. M., Borlaug, B. A. Heart Failure With Preserved Ejection Fraction: A Review. JAMA. 329 (10), 827-838 (2023).
  2. Withaar, C., Lam, C. S. P., Schiattarella, G. G., de Boer, R. A., Meems, L. M. G. Heart failure with preserved ejection fraction in humans and mice: embracing clinical complexity in mouse models. Eur Heart J. 42 (43), 4420-4430 (2021).
  3. Borlaug, B. A. Evaluation and management of heart failure with preserved ejection fraction. Nat Rev Cardiol. 17 (9), 559-573 (2020).
  4. Paulus, W. J., Tschope, C. A novel paradigm for heart failure with preserved ejection fraction: comorbidities drive myocardial dysfunction and remodeling through coronary microvascular endothelial inflammation. J Am Coll Cardiol. 62 (4), 263-271 (2013).
  5. Shah, S. J., et al. Prevalence and correlates of coronary microvascular dysfunction in heart failure with preserved ejection fraction: PROMIS-HFpEF. Eur Heart J. 39 (37), 3439-3450 (2018).
  6. Lee, J. F., et al. Evidence of microvascular dysfunction in heart failure with preserved ejection fraction. Heart. 102 (4), 278-284 (2016).
  7. Freed, B. H., et al. Prognostic Utility and Clinical Significance of Cardiac Mechanics in Heart Failure With Preserved Ejection Fraction: Importance of Left Atrial Strain. Circ Cardiovasc Imaging. 9 (3), 191-200 (2016).
  8. Taqueti, V. R., et al. Coronary Flow Reserve, Inflammation, and Myocardial Strain: The CIRT-CFR Trial. JACC Basic Transl Sci. 8 (2), 141-151 (2023).
  9. Zhao, J., et al. Heart-gut microbiota communication determines the severity of cardiac injury after myocardial ischaemia/reperfusion. Cardiovasc Res. 119 (6), 1390-1402 (2023).
  10. Zhao, J., et al. Excessive accumulation of epicardial adipose tissue promotes microvascular obstruction formation after myocardial ischemia/reperfusion through modulating macrophages polarization. Cardiovasc Diabetol. 23 (1), 236(2024).
  11. Rush, C. J., et al. Prevalence of coronary artery disease and coronary microvascular dysfunction in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 6 (10), 1130-1143 (2021).
  12. Hage, C., et al. Association of coronary microvascular dysfunction with heart failure hospitalizations and mortality in heart failure with preserved ejection fraction: a follow-up in the PROMIS-HFpEF study. J Card Fail. 26 (11), 1016-1021 (2020).
  13. Allan, T., Dryer, K., Fearon, W. F., Shah, S. J., Blair, J. E. A. Coronary microvascular dysfunction and clinical outcomes in patients with heart failure with preserved ejection fraction. J Card Fail. 25 (10), 843-845 (2019).
  14. Kelshiker, M. A., et al. Coronary flow reserve and cardiovascular outcomes: a systematic review and meta-analysis. Eur Heart J. 43 (16), 1582-1593 (2022).
  15. Knuuti, J., et al. 2019 ESC Guidelines for the diagnosis and management of chronic coronary syndromes. Eur Heart J. 41 (3), 407-477 (2020).
  16. Vancheri, F., Longo, G., Vancheri, S., Henein, M. Coronary microvascular dysfunction. J Clin Med. 9 (9), 2880(2020).
  17. Zacchigna, S., et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 117 (1), 43-59 (2021).
  18. Guo, Z., et al. Dynamic assessments of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in mice. J Vis Exp. (198), e65492(2023).
  19. Kelm, N. Q., Beare, J. E., LeBlanc, A. J. Evaluation of coronary flow reserve after myocardial ischemia reperfusion in rats. J Vis Exp. (148), e59675(2019).
  20. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: Updated guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 18 (7), e3000410(2020).
  21. Schiattarella, G. G., et al. Nitrosative stress drives heart failure with preserved ejection fraction. Nature. 568 (7752), 351-356 (2019).
  22. Guo, Y., et al. iNOS contributes to heart failure with preserved ejection fraction through mitochondrial dysfunction and Akt S-nitrosylation. J Adv Res. 43, 175-186 (2023).
  23. Xiong, Y., et al. Inhibition of ferroptosis reverses heart failure with preserved ejection fraction in mice. J Transl Med. 22 (1), 199(2024).
  24. Chen, J., et al. Nitazoxanide protects against heart failure with preserved ejection and metabolic syndrome induced by high-fat diet (HFD) plus L-NAME "two-hit" in mice. Acta Pharm Sin B. 15 (3), 1397-1414 (2025).
  25. Lanzer, J. D., et al. Single-cell transcriptomics reveal distinctive patterns of fibroblast activation in heart failure with preserved ejection fraction. Basic Res Cardiol. 119 (6), 1001-1028 (2024).
  26. Lenzarini, F., Di Lascio, N., Stea, F., Kusmic, C., Faita, F. Time course of isoflurane-induced vasodilation: a Doppler ultrasound study of the left coronary artery in mice. Ultrasound Med Biol. 42 (4), 999-1009 (2016).
  27. Yang, J. H., et al. Endothelium-dependent and independent coronary microvascular dysfunction in patients with heart failure with preserved ejection fraction. Eur J Heart Fail. 22 (3), 432-441 (2020).
  28. Silvani, A., et al. Physiological mechanisms mediating the coupling between heart period and arterial pressure in response to postural changes in humans. Front Physiol. 8, 163(2017).
  29. Mohan, M., Anandh, B., Thombre, D. P., Surange, S. G., Chakrabarty, A. S. Effect of posture on heart rate and cardiac axis of mice. Indian J Physiol Pharmacol. 31 (3), 211-217 (1987).
  30. Franssen, C., et al. Myocardial microvascular inflammatory endothelial activation in heart failure with preserved ejection fraction. JACC Heart Fail. 4 (4), 312-324 (2016).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

문의하기
사서에게 추천하기

개인정보

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.