생체 내 쥐 모낭 주기 동안 모발 줄기, 멜라닌, 콜라겐의 동적 변화를 비침습적으로 관찰합니다

요약

본 연구는 2광자 현미경과 2차 고조파 발생 현미경을 이용한 비침습적 생 체 내 방법을 제시하여, 쥐의 모낭 주기 전체에 걸쳐 모발 형태, 멜라닌 역학, 피부 콜라겐 밀도를 종단적으로 모니터링하여 탈모 치료 연구를 위한 견고한 방법론적 틀을 제공합니다.

초록

전통적인 모낭 주기 평가는 침습적 조직학적 방법에 의존하여 연속적인 종단 관찰이 제한됩니다. 비침습적 광학 영상, 특히 2광자 여기형 형광(TPEF)과 2차 고조파 생성(SHG)이 여러 모낭 주기에 걸친 모발 간간, 멜라닌, 콜라겐의 생 체 내 동적 변화를 정확히 추적하고 정량화할 수 있다고 가설이 세워졌습니다. C57BL/6 마우스의 모발 줄기는 아나젠, 카타겐, 휴지기 동안 피부경, 사진 촬영, 전자현미경을 이용해 생 체 내에서 모니터링되었습니다. 구체적으로, 800nm 여기 이하의 TPEF와 영상 촬영을 사용해 멜라닌 역학을 정량화했고, 950nm 자극 하의 SHG를 사용해 여포 간 콜라겐 변화를 관찰하였습니다. 정확성을 보장하기 위해 생 체 내 광학 측정은 교차 검증되었습니다: 전체 조직 외관에 대한 피부 사진과 헤마톡실린 및 에오신(HE) 염색으로 모발 구근 발현을 확인했으며, 시리우스 레드 염색 절면에서 액정 편광 이미징 시스템을 이용해 섬유 밀도와 방향을 평가하여 콜라겐 변화를 검증했습니다. 연구 결과는 아젠 단계에서 모발 굵기와 멜라닌 생성이 점차 증가하는 반면, 모낭 간 콜라겐 밀도는 유의미하게 감소함을 보여주었습니다. 카타겐 및 휴지기에는 멜라닌 수치가 점차 감소하고 콜라겐 밀도가 점차 기초 수준으로 회복되었습니다. 이 프로젝트는 모낭의 포괄적인 역학을 평가하기 위한 검증된 비침습적 생 체 내 방법론을 확립하여, 탈모 치료를 위한 활성 약물의 전임상 평가를 위한 견고한 실험 틀을 제공합니다.

서론

C57BL/6 마우스의 모낭은 동기화성과 규칙성을 보여, 실험적 편의성을 제공하고 피부 질환 연구에 흔히 사용되는 동물 모델이 됩니다 ^1,2. 모낭은 C57BL/6 마우스³의 출생 후 7주차에 두 번째 휴지기로 들어갑니다. 인공적 개입이 없을 경우, 이 휴지기는 출산 후 12주까지 유지^됩니다. 이 긴 휴지기 기간은 모낭 성장 주기⁵를 동기화하는 연구에서 흔히 사용되는 시간점입니다. 생쥐의 인공 탈모 후 모낭은 즉시 아나^{겐 6단계}로 진입하기 시작합니다.

성장기에 들어간 후, 돌출 부위의 줄기세포는 증식하여 바깥 뿌리 피로 분화하고, 아래로 성장하여 난포 길이⁷. 모낭이 깊어질수록 모발 기부는 위로 뻗어 있습니다. 구근 내 줄기세포는 계속해서 모발 줄기와 내근 칼집으로 분화^{합니다. 9}. 피부 내 콜라겐과 멜라닌의 분비도 생애기 단계¹⁰ 동안 빠르게 변화하여 모낭 발달에 중요한 역할을 합니다^11,12. 탈모 관련 연구에서는 멜라닌 분비를 주로 피부색으로 평가하며, 정확한 정량화가 불가능합니다¹³. 현재까지 콜라겐 연구는 주로 발달과 노화에 초점을 맞추고 있으며, 정량화의 주기적 역학에는 관심이 많지 않습니다.

현재 모낭 주기와 재생 치료 평가의 주요 한계는 파괴적인 조직학적 종점에 의존한다는 점이며, 이는 특정 시점에 서로 다른 동물 집단을 안락사시켜야 한다는 점입니다¹⁴. 이로 인해 동일한 난포 미세환경을 여러 주기에 걸쳐 연속적이고 종단적으로 추적하는 것을 방지합니다. 더불어, 피부내시경과 같은 기존의 비침습적 기법은 깊은 모낭 변화를 시각화할 만큼 조직 침투가 충분하지 않으며(¹⁵), 거시적 관찰은 멜라닌을 정확히 정량화하지 못해 후기 퇴행 및 휴식기 동안 멜라닌 결핍 근원을 발견하기 어렵다^16,17. 콜라겐 섬유 평가를 위한 액정 편광법 ^20,21, 색소 관찰을 위한 피부 공초점 현미경^22,24, 피부 두께 측정을 위한 광학 코히어런스 단층촬영 등 다양한 광학 기술이 생체 내 관찰을 발전시켰습니다 25,26,27다광자 현미경은 독특하고 매력적인 해결책을 제공합니다. 2광자 여기 형광(TPEF)과 2차 고조파 생성(SHG)의 결합 사용은 뚜렷한 장점을 제공합니다: 표지 없이 고해상도 광학 절편을 진피 깊숙이 수행할 수 있게 하여, 외인성 염료 없이 멜라닌 자가형광과 콜라겐 섬유 구조를 동시에 생체 내에서 정량할 수 있게 합니다^28,29. 본 연구에서 저자들은 비침습적 TPEF/SHG 영상이 침습적 조직학적 금본위와 견줄 만한 정확도로 이러한 구조적 변화를 동적이고 정밀하게 정량화할 수 있다고 가설을 세웠습니다. 이 핵심 과학적 문제를 해결함으로써, 본 연구는 탈모 치료제의 비침습적 평가를 지원할 수 있는 견고하고 종단적인 생체 내 영상 프레임워크를 구축하는 것을 목표로^합니다.

프로토콜

척추동물 피험자를 사용하는 모든 방법은 기관 지침을 준수하여 수행되었습니다. 모든 동물 실험 절차는 중국의학과학원 실험연구센터 제도동물 관리 및 이용 위원회(프로토콜 코드: ERCCACMS11-2210-03)의 승인을 받았습니다. 이 연구에 사용된 모든 자료는 재료표에 나열되어 있습니다.

동물 조성 및 거시적 관찰
6주에서 7주 된 수컷 C57BL/6 마우스를 상업 공급자로부터 획득했으며, 몸무게는 20± 2g입니다. 쥐들은 조직학적 분석 코호트(n = 39)와 연속 생체 영상 코호트(n = 3)로 나뉘었습니다. 모든 쥐의 등털은 모낭 주기를 동기화하기 위해 제모되었습니다. 탈모 후 2일째부터 26일째까지 이틀에 한 번씩 모발 성장 상태를 검사하였다. 영상 코호트의 쥐 등은 26일차까지 이틀에 한 번씩 카메라로 촬영되었습니다. 고정된 초점 거리는 15cm로 유지되었고, 거시적 변화를 정확히 기록하기 위해 일관되고 표준 실험실 조명 조건이 유지되었습니다.

생체 내 TPEF 및 SHG 영상
영상 촬영은 제모 후 2일, 4일, 6일, 8일, 10일, 12일, 14일, 16일, 18일, 20일, 22일, 24일, 26일에 시행되었습니다. 쥐들은 이소플루란을 사용해 마취를 받았습니다. 호흡 속도를 관찰하고 발가락을 살짝 꼬집어 발 반사를 테스트함으로써 의식을 완전히 잃게 되었다. 마취된 쥐는 2광자 현미경 스테이지에 고정되었다. 멜라닌의 TPEF 이미징을 위해 현미경은 25배 수중 물에 담긴 대물렌즈(수치 구경 = 1.05)를 장착했고, 여기 파장은 800 nm로 설정되었습니다. 멜라닌 자가형광의 z-스택 스캔이 수행되어 총 스캐닝 깊이 45 μm에 도달했습니다. 스텝 크기는 2 μm, 이미지 해상도는 1,024 × 1,024 픽셀, 획득 속도는 4 μs/픽셀로 설정되었습니다. 콜라겐 섬유의 SHG 이미징을 위해 여기 파장은 동일한 25배 물 침수 대물렌즈를 사용하여 950 nm로 조정되었습니다. 진피 상면에서 총 45 μm의 스캐닝 깊이로 Z-스택 스캔을 시작했으며, 2 μm의 스텝 크기, 1,024 픽셀의 이미지 해상도× 1,024 픽셀, 4 μs/픽셀의 획득 속도를 유지했습니다. 영상 촬영 후, 쥐는 현미경 단계에서 조심스럽게 꺼내고, 이소플루란은 중단되었으며, 쥐는 완전히 의식을 회복할 때까지 온열 패드 위에 올려놓은 후 다시 집 우리로 돌아갔다.

조직 채취 및 조직학적 처리
조직학 그룹의 별도 3마리 마우스 집단이 2일차부터 26일차까지 격일로 안락사되었으며, 이는 종단 조직학 샘플링에 재사용되지 않도록 했습니다. 각 마우스 등 뒤의 수평과 수직 중간선이 만나는 지점에 정확히 중심을 둔 2cm × 2cm 전층 등 피부 조직 샘플을 외과적으로 절제하였습니다. 절제된 피부 조직은 가장자리 말림을 방지하기 위해 단단한 카드 위에 평평하게 놓고 즉시 4% 파라포름알데히드가 들어간 시험관에 담갔습니다. 고정된 조직은 탈수 후 삽입되어 두께 6μm 파라핀 절편을 준비했습니다. 왁싱 제거 전에 파라핀 부분은 슬라이드 워머 위에서 120분간 가열되었습니다. 해당 부위들은 제조사 지침에 따라 표준 염색 키트를 사용해 헤마톡실린과 에오신(HE), 그리고 시리우스 레드로 염색되었습니다. 절편들은 중성 접착제로 부착하고 역현미경으로 관찰했습니다. 액정 편광 이미징을 위해 왁스 제거와 시리우스 레드 염색 부분을 편광 광학 현미경으로 촬영했습니다. 편광기와 분석기를 정확히 90°로 교차시켜 최대 어두운 배경(소광 상태)을 만들어 통합 편광 각도를 설정했으며, 이 특정 각도는 이후 모든 이미지 캡처에서 일관되게 고정되었습니다.

생체 내 피부경 및 모발 간부 전자현미경
뽑기 전에 등쪽 모발 성장 부위는 임상 피부경을 20배 배율로 생 체 내에서 평가했습니다. 모발 재생은 모발 출현 및 밀도를 기반으로 표준 0–3 점수 체계를 사용하여 정량화되었습니다(0 = 모발이 보이지 않음; 1 = 드문 모발 출현; 2 = 중간 정도 모발 밀도; 3 = 밀도가 높고 완전한 모발 덮개). 편향 없는 샘플링을 위해 각 쥐의 등쪽 제모 영역은 시각적으로 네 개의 동일한 사분면으로 나뉘었습니다. 난수 생성기를 사용해 쥐당 두 개의 사분면을 선택했고, 멸균 겸자로 각 사분면에서 새로 자란 머리카락 다섯 개를 단단히 뽑았습니다. 발췌한 머리카락 줄기는 즉시 2.5% 글루터알데히드에 담근 후 0.1M 인산염 완충제(pH 7.4)에 4시간 동안 고정하여 초구조를 보존했습니다. 고정된 머리카락 줄기는 0.1M 인산염 완충제에서 세 차례 세척한 후, 각 농도별로 등급별 에탄올 시리즈(50%, 70%, 80%, 90%, 100%)를 순차적으로 탈수한 후, 액체_CO2를 이용한 임계점 건조가 이루어졌습니다. 말린 머리카락 줄기는 알루미늄 스텁에 부착된 전도성 양면 탄소 테이프에 수평으로 부착되었습니다. 샘플들은 전자 충전을 방지하기 위해 진공 스퍼터 코팅기를 사용해 60초간 10nm 금층으로 스퍼터 코팅되었습니다. 코팅된 샘플은 주사 전자현미경에 삽입되었고, 5.0 kV의 가속 전압을 사용해 머리카락 줄기를 관찰했습니다. 초미세경 형태학적 변화는 500배 및 1,000배 배율로 이미지를 촬영하여 체계적으로 평가했으며, 특히 모발 간간 직경과 큐티클 비늘의 구조적 완전성 및 배열을 문서화하였습니다.

데이터 및 통계 분석
이미지 매개변수는 일반 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 측정 및 정량화되었습니다. 모든 통계 분석과 그래픽 표현은 표준 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 동일한 동물을 대상으로 여러 시점에 걸쳐 얻은 연속 생체 내 모니터링 데이터에 대해, 분산 반복 측정 분석(RM-ANOVA)을 사용한 후 Bonferroni의 사후 검정을 통해 통계적 유의성을 산출하였습니다. 독립 동물 표본을 포함하는 조직학적 데이터의 경우, 일반적인 일원 ANOVA 후 Tukey의 사후 검 정을 사용하여 통계적 차이를 평가하였습니다. 모든 결과는 평균 ± 표준편차(SD)로 표현되었습니다. 통계적으로 유의한 차이는 *p < 0.05, p < 0.01, ***p < 0.001로 간주되었습니다.

결과

쥐털 관찰
쥐의 모발 성장에 대한 사진 관찰은 그림 1A에 제시되어 있습니다. 피부 표면을 통해 모발이 10일째에 나오기 시작했으며, 12일째부터 16일차까지 계속 발달이 유지되었습니다(p < 0.05). 이후 모발 덮개는 18일째부터 26일째까지 정체되었다(p > 0.05)(그림 1B). 더 나아가, 피부경 검사는 모발 성장 역학을 비침습적으로 체 내에서 관찰하는 데 도움을 주었습니다. 2일째에는 피부가 균일하게 분홍색에 털이 없어 보였습니다. 8일째에는 모발 줄기가 표피 바로 아래에서 보였고, 10일째에는 피부 표면을 통해 나오는 것이 관찰되었습니다. 모발 줄기는 10일째부터 16일째까지 점차 두꺼워져 16일째에 최대 직경에 도달했습니다. 26일째에는 피부가 다시 분홍색에 털이...

토론

C57BL/6 마우스 모델은 2차 휴지기가 7주차부터 12주차까지 안정적으로 지속되기 때문에 선택되었습니다. 26일 관찰 기간이 전적으로 이 정적 단계에 속하기 때문에, 관찰되는 심층적인 역동적 변화는 탈모로 인한 주기 진행에 의해 명확히 주도되며, 자연스러운 연령 관련 변동은 완전히 배제됩니다. 탈모가 휴지기(휴지기)에 시행되면 모낭은 즉시 아나겐 단계로 들어갑니다. 저자의 지식에 따르면, 이 연구는 2광자와 2차 고조파 발생 영상을 이용해 쥐 모낭 주기를 관찰하는 새로운 비침습적 생체 내 방법을 제시합니다^32,33. 모낭은 6일째에 아나젠 III 단계, 10일차에 아나젠 VI 단계에 있는 것으로 관찰되었습니다. 그들은 18일차에 카타겐 III 단계, 20일차에 카타겐 V 단계, 24일차에 휴지기 단계에 진입했다; 이 결과들은 전통적인 조직병리학적...

재료

```html

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C57BL/6 마우스,	북경 바이탈 리버 실험동물 기술	SCXK (Jing) 2021-0006	동물 모델에 사용
디지털 DSLR 카메라	Canon	EOS 80D	마우스 등 뒷면 사진 촬영에 사용
H&E 염색 키트	LtdSolarbio 과학 및 기술 유한공사	G1120	조직 절편 염색에 사용
역전 현미경	Olympus	BX51	사진 촬영에 사용
lsoflurane	RWD 생명 과학 회사	R510-22-16	동물 마취에 사용
Mai Tai DeepSee	SpectraPhysics	Mai Tai HP	생체 내 TPEF 및 SHG 이미지화에 사용
의료용 전자 피부 검사기	중국 츠앙홍 의료 기술 회사	CH-DSIS-2000	피부 색상의 생체 내 이미지화에 사용
편광 현미경	Olympus	BX51-P	시리우스 레드 염색 이미지화에 사용
스캐닝 전자 현미경 (SEM)	히타치 하이테크 주식회사	SU8010	모발 샤프트 미세 구조 관찰에 사용
시리우스 레드 염색 키트	Solarbio	G1472	콜라겐 섬유 염색에 사용
소형 동물 마취 기기	RWD 생명 과학 회사	R500	동물 마취에 사용

```