방법 논문

비강 주입을 통한 마우스 패혈증 유도 면역억제 모델 구축

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DOI:

10.3791/70150

⸱

2026년 6월 12일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Trauma Medical Center, Daping Hospital, State Key Laboratory of Trauma and Chemical Poisoning, Burns and Combined Injury, Army Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Daping Hospital, Army Medical University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 Klebsiella pneumoniae 를 비강 주입하여 마우스 패혈증 면역억제 모델을 구축하는 프로토콜을 제시하고, 다양한 지표를 통해 모델을 검증하였습니다.

초록

패혈증은 숙주의 부적절한 감염 반응으로 인해 발생하는 생명을 위협하는 장기 부전입니다. 폐렴이 패혈증의 주요 원인입니다. 동물 모델은 패혈증의 발병 기전을 연구하고 새로운 치료 전략을 평가하는 데 중요한 도구입니다. 이전의 패혈증 동물 모델들은 자연스러운 감염 경로가 부족해 임상 감염 과정을 정확히 반영하기 어려웠습니다.

이 연구는 자연스러운 호흡기 감염 경로를 시뮬레이션하기 위해 Klebsiella pneumoniae (KP)를 비강 주입하여 확립한 마우스 패혈증 면역억제 모델을 도입했습니다. 다양한 농도의 KP로 모델링한 후, 12시간 동안 사이토카인 인터루킨-6(IL-6) 수치를 평가하고, 24시간 동안 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT), 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제(AST), 크레아틴 키나아제(CK), 혈중 요소 질소(BUN) 수치에 대해 장기 손상을 평가하였다. 모델의 생존율은 7일 후에 분석되었습니다. 단핵구에서 림프구 및 백혈구 비율, 주요 조직적합성 복합체 클래스 II(MHC-II) 발현 비율, 그리고 CD4+ T 세포에서 IL-10과 TGF-β1의 평균 형광강도(MFI)를 관찰하여 마우스의 면역 억제를 평가하였습니다. 7일간의 모델링 후, Pseudomonas aeruginosa(PA)를 비강 내 주입하여 2차 감염을 시행하였습니다. 2차 감염 후 24시간 후 기관지폐포세척액(BALF) 내 세균 부하와 14일 이내의 사망률을 평가하여 모델의 면역 억제 효과를 추가로 평가하였습니다.

고농도 클렙시엘라 폐렴 을 코에 주입하면 면역 억제를 효과적으로 유도할 수 있습니다. 이 연구의 목적은 자연적인 호흡기 감염 경로에 의해 유발되는 패혈증을 시뮬레이션하고, 동물 대상 패혈증 연구의 표준 모델을 제공하는 것입니다.

서론

패혈증은 숙주가 감염에 부적절하게 반응하여 발생하는 생명을 위협하는 장기 부전입니다. 1,2,3. 중환자실(ICU)에서 사망 원인 중 가장 큰 원인 중 하나입니다. 전 세계적으로 연간 4,890만 건의 패혈증 사례가 발생하며, 1,100만 명이 사망합니다4. 항감염 치료와 장기 지원 기술의 최근 발전에도 불구하고, 패혈증의 병인기는 아직 완전히 이해되지 않았으며, 구체적인 치료 옵션도 부족합니다. 따라서 패혈증은 임상의학 연구에서 핵심 관심사이자 도전 과제가 되었습니다.

동물 모델은 기초 및 중개 의학 연구에서 대체 불가능한 역할을 하며, 패혈증 병인성 조사와 새로운 치료 전략 평가에 필수적인 도구입니다. 인간 패혈증의 병태생리학적 과정을 시뮬레이션함으로써 이 모델들은 면역 질환과 장기 기능 장애와 같은 주요 메커니즘 탐구를 촉진할 뿐만 아니라, 약물 선별과 개입 전략 개발을 위한 실험적 기반을 제공합니다. 다양한 동물 모델 중에서 쥐는 명확한 유전적 배경, 면역 체계에 대한 광범위한 연구, 그리고 조작의 용이성 때문에 패혈증 연구에 가장 많이 사용됩니다.

현재 내독소 모델, 박테리아 주입 모델, 맹장 결찰 및 천자(CLP) 모델, 대장 상승 스텐트 복막염(CASP) 모델5 등 다양한 패혈증 동물 모델이 존재합니다. 하지만 이러한 모델들은 자연스러운 감염 경로가 부족하여 임상 감염 과정을 진정으로 반영하기가 어렵습니다. 연구에 따르면 미국에서 폐렴이 패혈증의 주요 원인임을 보고했습니다. 따라서 자연 감염 경로를 모방하고 면역억제 특성을 보이며 높은 재현성을 가진 쥐 패혈증 모델을 구축하는 것은 패혈증의 면역 기전을 심층 연구하고 잠재적 개입 전략을 평가하는 데 매우 중요합니다.

클렙시엘라 폐렴(KP)은 병원 내 획득성 세균 감염의 3%에서 8%를 차지합니다 7,8,9. 이 박테리아는 호흡기, 위장관, 요로와 피부를 포함한 다양한 관로를 통해 체내에 침투할 수 있으며, KP로 인한 감염은 특히 면역 저하 환자에서 예후가 좋지 않습니다 7,10. 폐렴이 패혈증의 주요 원인이고 KP가 예후가 좋지 않은 일반적인 호흡기 병원체이기 때문에, KP는 임상적으로 적합한 패혈증 모델을 구축하기에 이상적인 후보입니다.

코 내 방법을 포함한 다양한 KP 감염 동물 모델이 이전에11개에 걸쳐 확립되었으나, 패혈증 관련 면역억제를 유도하기 위한 모델 최적화나 모델 확립을 위한 최적의 KP 농도를 정의하는 연구는 소수에 불과합니다. 이 격차는 패혈증으로 인한 면역 기능 장애 연구에 기존 KP 모델의 유용성을 제한합니다.

이 필요를 해결하기 위해 우리는 마우스에서 KP를 비강 주입하여 패혈증 유도 면역억제 모델을 구축하였습니다. 기존 모델과 비교할 때, 이 모델은 호흡기 감염의 자연 경로를 시뮬레이션합니다. 이 모델은 이후 연구를 위한 방법을 제공하기 위해 추가로 검증되었습니다.

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프로토콜

이 글에서 설명한 모든 실험 절차는 제3군사의과대학(SCXK(PLA)20120031 실험동물복지윤리위원회의 승인을 받았습니다.

1. 실험 동물

  1. C57BL/6 마우스, 수컷, 8-10주, 체중 23–28g 사용 (동물 허가 번호: SCXK (Xiang) 2019-0004). 쥐는 특정 병원체가 없는 환경(SPF)에 두고, 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있도록 하세요. 주거 조건은 다음과 같이 유지하세요: 실내 온도는 24± 2ºC, 습도는 50%–55%, 밝고 어두운 주기는 12시간/12시간입니다.

2. 박테리아 제제

  1. 적절한 품종을 사용하세요. 여기서는 Klebsiella pneumoniae American type culture Collection(ATCC) 균주 43816을 사용하세요.
  2. 적절한 배양 배지(루리아-베르타니 [LB] 육수)를 준비하세요.
  3. 박테리아를 주입할 준비를 하세요.
    1. 단일 군락을 골라 5mL의 LB 육수에 접종한 후, 37°C, 220rpm에서 셰이커에서 하룻밤(12시간) 배양합니다.
    2. 하룻밤 동안 배양된 박테리아를 신선한 LB 육수에 옮겨 3–4시간 배양하여 고밀도 성장 단계(600 nm [OD600] ≈ 0.8)에 도달합니다.
    3. 박테리아 용액을 희석한 후 100 μL을 고형 배양 배지 접시 바닥에 넣습니다. 37 °C 인큐베이터에 12시간 동안 넣고, 집락 수를 세어 KP 농도를 2 × 109 CFU/mL, 즉 OD600 ≈ 0.8로 측정합니다.
    4. 박테리아 농도를 0.9% NaCl 용액으로 조절하세요. 이후 사용을 위해 1 × 108 CFU/mL, 10 106 CFU /mL 1×, 104 CFU/mL 1× 10 박테리아 현탁액 3개를 준비합니다.

3. 비강 삽입 감염(그림 1)

  1. 2% 펜토바르비탈나트륨을 2 μL/g 용량의 복강내 주사로 쥐를 마취시킵니다(그림 1A,B).
  2. 마우스가 의식이 감소하지만 삼키는 반사가 남아 있을 때는 마이크로피펫을 사용해 세균 현탁액 50 μL(대조군은 0.9% NaCl 용액)를 흡인합니다.
  3. 엄지손가락을 목 앞쪽에 대고 쥐의 목을 부드럽게 잡고, 나머지 손가락으로 몸통을 부드럽게 잡으세요. 마우스의 머리를 뒤로 기울이세요(그림 1C).
  4. 피펫을 사용해 쥐의 콧구멍에 박테리아 부탁액을 천천히 주입합니다(약 5–10 μL 한 방울당 투여). 한 번에 한 코에 한 방울씩 주입하세요(그림 1D).
  5. 마우스가 현탁액을 흡입한 것을 관찰한 후, 빠르게 들어 올린 후 천천히 내려 현탁액이 기관지로 흡입되도록 유도합니다(그림 1E, F).
  6. 위 단계를 반복하며 다른 쪽 콧구멍에 번갈아 주입하여 쥐가 50 μL 박테리아 현탁액을 완전히 흡입할 때까지 반복합니다.
  7. 수술 중 쥐가 기침하거나 한숨을 쉬거나 박테리아 용액을 흡입하지 못하면 휴식을 취하고 관찰하도록 하세요. 상황이 안정된 후에는 쥐가 박테리아 용액(또는 0.9% NaCl)을 모두 흡입하도록 흡입 과정을 계속하세요.
  8. 마우스를 60°로 기울인 마우스 보드 위에 누운 자세로 고정하세요. 실내 온도가 낮으면 히터를 사용해 쥐가 회복할 수 있도록 도와주세요. 쥐가 마취에서 완전히 회복할 때까지 관찰한 후, 최적의 온도와 충분한 물, 먹이를 곁들인 우리로 다시 돌려보내세요.

4. 모델 평가

참고: 앞서 언급한 비강 주입법을 통해 네 개의 마우스 모델 그룹이 설정되었는데, 대조군(그룹 A, PBS 주입), 1 × 104 KP 농도군(그룹 B), 1× 106 KP 농도군(그룹 C), 그리고 1× 108 KP 농도군(그룹 D)입니다. 모델은 다음과 같은 방법으로 평가되었습니다:

  1. 12시간 염증 지표를 평가하세요.
    1. KP 비강 주입 후 12시간 후에 심장 천자를 통해 혈액(≥ 300 μL)을 채취합니다(그룹당 n = 5). 혈청을 원심분리(1000 × g, 10분)로 분리하여 사이토카인 인터루킨-6(IL-6)의 검출에 사용한다.
  2. 24시간 장기 손상 평가
    1. KP 비강 주입 후 24시간 후에 생화학적 지표 검출을 위해 혈청을 사용한다(그룹당 n = 5개). 이 지표들 중에는 간 손상을 평가하기 위해 알라닌 아미노트랜스퍼라제(ALT)와 아스파르트산 아미노트랜스퍼라제(AST), 근육 손상을 평가할 때 크레아틴 키나제(CK), 신장 손상을 위해 혈중 요소 질소(BUN)를 사용합니다.
  3. 증상 평가
    1. 쥐의 체중을 매일 모니터링하고, 털 상태, 활동 수준 및 기타 지표를 관찰하세요.
  4. 7일 사이토카인과 면역 세포
    1. 모델링 7일째(n = 10 [A/B], n = 15 [C], n = 40 [D])에 심장 천자를 통해 말초혈을 채취하여 유세포 분석을 위해 말초혈을 채취하여 림프구 비율, 단핵구에서 주요 조직적합성 복합체 클래스 II(MHC-II) 발현 비율, 평균 형광강도 MFI)의 IL-10 및 TGF-β1 및 CD4+ T 세포를 평가합니다.
    2. 조직 처리
      1. 혈액 샘플(100 μL)과 적혈구 용해 버퍼(300 μL)를 1:3 부피 비율로 혼합합니다. 상온에서 적혈구 용해를 15분간 한 후, 혼합물을 400 × g에서 5 분간 원 심분리한 후 상원액을 버립니다.
      2. 펠릿을 적혈구 용해 완충제 200 μL(부피비 = 1:2)에 재현탁한 후 10분간 2차 용해를 위해 배양합니다.
      3. 400 × g에서 5 분간 원 심분리한 후 상원액을 제거하고 펠릿을 100 μL 세포 염색 버퍼에 재현탁합니다.
      4. 각 유동 세포분석 항체를 샘플에 1 μL씩 첨가합니다. 간단히 말해, 림프구 염색을 위해 CD45를 추가하세요; MHC-II 검출을 위한 CD45, CD116, Ly6G, Ly6C, MHC-II 항체; IL-10과 TGF-β1 측정을 위한 CD45, CD3, CD4, CD4, CD8, CD25 항체. 위에 나열된 각 항체의 희석 비율은 1:100입니다.
      5. 모든 샘플은 4°C에서 어둠 속에서 30분간 배양하세요. 그 후 세포 염색 완충액 1mL를 추가한 후 400 × g에서 원심분리하여 5분간 보관합니다; 상정액을 버리세요.
      6. 림프구와 MHC-II 검출을 위해서는 유세포분석 전에 400 μL 세포 염색 완충제에 재현탁합니다.
      7. 이후 IL-10과 TGF-β1 검출 절차를 4.4.2.8–4.4.2.12단계에 따라 수행합니다:
      8. 고정 완충제 1mL를 추가하고 4ºC에서 어두운 환경에서 60분간 배양합니다.
      9. 1mL의 퍼름 버퍼를 추가한 후, 혼합물을 400 × g에서 5 분간 원 심분리한 후 상원액을 버립니다.
      10. 세포 펠릿을 100 μL 퍼름 버퍼에 재현탁한 후, Foxp3, IL-10, TGF-β1 항체를 각각 1 μL씩 첨가합니다. 샘플을 4°C에서 어둠 속에서 30분간 배양하세요.
      11. 다음으로 퍼름 버퍼 1mL를 넣고, 400 × g 에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 제거합니다.
      12. 마지막으로 세포를 400 μL 세포 염색 버퍼에 재현탁한 후 유동 세포분석으로 검출합니다.
    3. 게이팅 전략
      1. 림프구를 검출하려면 FSC-A/FSC-H 플롯에서 이물질과 이중항체를 제외합니다. 전체 백혈구를 CD45⁺ 사건으로 식별합니다. CD45⁺ 집단 내에서 낮은 FSC/SSC를 기준으로 림프구를 게이트합니다.
      2. MHC-II를 검출하기 위해 먼저 FSC-A/SSC-A에 게이트 백혈구를 삽입하여 잔해를 제거하고, 이어서 CD45⁺ 세포를 선별합니다. 골수종 세포를 CD11b⁺으로 식별하며, Ly6G 음성으로 인해 호중구가 배제됩니다. 고전적 단핵구를 Ly6G⁻ Ly6Chi 세포로 정의하고, 이 집단 내에서 MHC-II 발현을 평가합니다.
      3. IL-10과 TGF-β1을 검출하기 위해 FSC-A/SSC-A 및 FSC-A/FSC-H로 이중항체와 이중항체를 배제합니다. 전체 T 세포를 CD45⁺CD3⁺ 이벤트로 식별합니다. CD4⁺CD8⁻ 집단 내에서 Tregs는 CD25⁺FOXP3⁺ 세포로 식별됩니다. Treg 하위 집합의 TGF-β⁺ 세포를 정량하고, 모든 CD4⁺ T 세포에서 IL-10 발현을 평가합니다. 모든 양성 게이트는 FMO 제어로 설정하세요.
  5. 2차 감염 후 24시간 후 기관지폐포 세척액(BALF) 내 세균 수치
    1. 모델 구축 후 7일째(n = 5 [A/B], n = 10 [C], n = 40 [D]), 앞서 언급한 비강 주입법을 사용하여 쥐에게 50 μL 농도의 Pseudomonas aeruginosa (PA)(농도는 6.8 ×10 10 CFU/mL)를 비강 주입합니다.
    2. PA 2차 감염 후 24시간 후에 1.5mL의 기관지폐포 세척액(BALF)을 채취합니다. BALF를 연속적으로 희석하여 LB 액체 배지에 판팅한 후, 37°C의 일정 온도 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 군체 수를 세세요.
    3. BALF 수금을 위해 다음 단계를 따르세요.
      1. 쥐를 인도적으로 심부 마취(2.5 μL/g 2% 펜토바르비탈 나트륨) 또는 안락사(7.5 μL/g 2% 펜토바르비탈나트륨)하여 목을 과신전한 상태로 눕히세요.
      2. 기관을 노출시키기 위해 경추 중앙 절개를 하세요. 무딘 24-G 카테터를 기관에 삽입해 경추 바로 뒤쪽까지 고정하세요.
      3. 1mL 주사기로 멸균되고 얼음처럼 차가운 PBS(0.5mL)를 천천히 주입하고 부드럽게 빼냅니다. 이 세척 과정을 3–5번 반복하세요. 이 과정을 3회 반복하면 총 세척량은 1.5mL가 됩니다.
  6. 생존 분석
    1. 생존 분석에는 별도의 마우스 코호트(n = 10 [A/B/C], n = 40 [D])를 사용하세요.
    2. 감염 후 7일 이내의 생쥐 생존 상태를 기록하세요.
    3. PA에 대한 2차 감염 후 7일째부터 14일째까지 쥐들의 사망률을 관찰합니다.
    4. 관찰 후, 이소플루란(5%)으로 심하게 마취하고, 펜토바르비탈 나트륨(150 mg/kg) 복막 내 주사로 안락사시키며, 경추 탈구로 사망이 확정됩니다.
  7. 통계 분석
    1. 정량 데이터에 대해 정규성 검정과 분산 동질성 검정을 수행합니다.
    2. 그룹 간 비교를 위해서는 데이터가 정규분포이고 균질 분산을 보일 경우 일방향 분산분석(ANOVA)을 사용하세요; 그렇지 않으면 비모수 검정을 사용하세요.
    3. Kaplan-Meier 방법을 사용하여 생존 분석을 수행하세요. 혼합 효과 모델을 사용하여 서로 다른 시점에서 그룹 간 체중 변화 차이를 테스트하세요. 통계적으로 유의한 0.05≤ p-값을 고려해 보십시오.

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결과

비강 주입 후 12시간 후, 1 ×10 8 KP 그룹의 혈청 IL-6 수치가 유의하게 증가했습니다(p < 0.0001, n = 5)(그림 2A). 비강 주입 후 24시간 기준, 1× 108KP 그룹의 ALT(p < 0.01, n = 5)(그림 2B), AST (p < 0.01, n = 5)(그림 2C), CK (p < 0.01, n = 5)(그림 2D), BUN(p < 0.001, n = 5)(그림 2E)의 혈청 수치가 대조군보다 높았다. 1× 106 KP 및 1×10 8 KP 그룹의 쥐들은 1일째부터 3일째까지 눈을 감고 눈을...

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토론

패혈증은 복잡한 임상 증후군이며, 말기 면역억제 상태가 환자 사망의 주요 원인입니다12,13. 따라서 패혈증 유발 면역억제의 병태생리를 정확히 시뮬레이션하는 전임상 모델은 그 메커니즘을 심층적으로 탐구하고 새로운 치료법 개발에 매우 중요합니다. 본 연구에서는 KP를 비강 주입으로 유도하는 마우스 패혈증 모델을 성공적으로 확립하고 검증했으며, 임상 실무와 매우 관련된 면역억제 상태를 안정적으로 복제하는 핵심 특징을 갖추었습니다.

모델의 신뢰성과 재현성을 보장하기 위해 우리는 구축 과정에서 일련의 표준화된 설계를 채택했습니다. 표준 고병원성 균주인 Klebsiella pneumoniae ATCC 43816 (KPPR1)14,15

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공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

이 연구는 중국 국가자연과학기금(82222038 및 81970259), 국방생명공학 우수 청년 인재(2023-JCJQ-ZQ-001 및 01-SWKJYCJJ06), 충칭 우수 청년 학자 과학기금(CSTB2022NSCQ-JQX0017)의 지원을 받았습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생화학 인큐베이터YSEISHH-150L세균 배양
C57BL/6J 마우스Vital River Laboratories8-10주, 수컷
CD116bBioLegend101257흐름 항체 (Anti-Mouse)
CD25BD bioscience740447흐름 항체 (Anti-Mouse)
CD3BioLegend100203흐름 항체 (Anti-Mouse)
CD4BioLegend100544흐름 항체 (Anti-Mouse)
CD45BioLegend103116흐름 항체 (Anti-Mouse)
CD8BioLegend100752흐름 항체 (Anti-Mouse)
세포 염색 완충액 BioLegend420201
일정 온도 셰이커HonourHNY-100B세균 배양
흐름 세포계Beckman CoulterCytoFLEX흐름 세포 분석
고속 원심분리기Beckman CoulterAIIEGRA
IDEXX 촉매 하나IDEXXCatalyst One생화학 분석
IL-10BioLegend505026흐름 항체 (Anti-Mouse)
인슐린 주사기 WEGO1mL혈액 수집
Klebsiella pneumoniae ATCC 43816biobw.orgbio-81659
LB Broth (분말)SolarbioL1010LB 액체 배지
LB Broth (분말)SolarbioL1015LB 아가르 판
LY6CBioLegend128010흐름 항체 (Anti-Mouse)
Ly6GBioLegend127606흐름 항체 (Anti-Mouse)
MHC-IIBioLegend107622흐름 항체 (Anti-Mouse)
마이크로 피펫EppendorfP100
적혈구 용해 완충액SolarbioR1010
분광 광도계EppendorfEppendorf6131광학 밀도 측정
통계 소프트웨어GraphPad SoftwareGraphpad Prism10.0
무균 및 효소 프리 피펫 팁Biosharp200μL
TF 희석액 완충액BD Pharmingen51-90008101
TF 고정/투과 완충액BD Pharmingen51-90008100
TF 투과/세척 완충액BD Pharmingen51-90008102
TGF-β1BioLegend141406흐름 항체 (Anti-Mouse)
Varioskan LUX 다중 모드 판독기Thermo ScientificVarioskan LUX 
```

참고문헌

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