초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

Summary

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

Abstract

초해상도 현미경(SRM)은 기존 광각 현미경의 회절 한계를 극복하여 세포 내 구조의 나노 규모 시각화를 가능하게 합니다. 그러나 자극 방출 소모현미경(STED), 광활성화 위치 현미경(PALM) / 확률적 광학 재구성 현미경(STORM), 구조화 조명 현미경(SIM)과 같은 기법의 광범위한 채택은 높은 광독성, 특수 시료 준비, 복잡한 조작 등의 요인에 의해 제약을 받을 수 있습니다. 여기서는 다중화 초해상도 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 플랫폼을 활용한 종합 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 계산 처리와 결합되어 동일한 워크플로우 내에서 공초점 촬영과 초해상도 영상 간 간편한 전환을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 빠르고 고해상도이며 저광독성 이미징을 위한 사용자 친화적인 접근법을 제공합니다. 상세 방법은 다색 형광, 차동 간섭 대비(DIC), 3차원 Z-스택 재구성, 타임랩스 라이브 셀 이미징, 대면적 타일링, 그리고 다중화 배열 검출기가 제공하는 다양한 초해상도 모드를 포함한 다중 모달 영상 기능을 포함합니다. 체계적인 비교 결과, 초해상도 모드는 약 120 nm의 횡방향 해상도를 달성하며, 이는 기존 광야장 현미경의 회절 한계보다 약 2배 향상된 성능을 보여주며, 동일한 플랫폼에서 표준 공초점 작동 대비 해상도와 신호 대 잡음비(4-8배)에서 상당한 향상을 보입니다. 논의는 또한 이 기술의 지속 가능한 운영을 지원하는 데 필수적인 공유 자원 관리 모델의 핵심 사항도 다룹니다. 이 통합 가이드는 생명과학 연구에서 이 접근성 높은 고급 영상 기술을 도입하고 최대한 활용하고자 하는 신규 및 경험 연구자, 시설 관리자 모두에게 귀중한 자료로 활용됩니다.

Introduction

동적 세포 내 구조의 시각화는 생명과학 연구를 발전시키는 데 근본적입니다. 그러나 전통적인 광학 현미경의 해상도는 좌절로 약 200nm로 제한되어 동적 세포 내 과정을 해석하는 데 제한이 있습니다. 이 장벽을 극복하기 위해 다양한 초해상도 기법이 개발되었습니다. 그러나 STED 현미경, PALM/STORM, SIM과 같은 기법은 높은 광독성, 특수 형광포체 또는 샘플 준비의 필요성, 복잡한 정렬 절차, 집중적인 계산 처리 등 다중 사용자 환경에서 널리 채택되는 데 장애물이 되는 경우가 많습니다 ^1,2,3.

이와 관련하여, 다중화 배열 검출기를 갖춘 공초점 현미경 시스템은 다중 픽셀 검출과 계산 재할당을 통해 초해상도 영상을 가능하게 하여 기술적 임계^기준을 크게 낮출 수 있는 매력적인 대안을 제공합니다. 이 방법은 32원소 갈륨 비소인산물(GaAsP) 검출기 배열을 활용하여 각 스캔 지점에서 더 많은 광자를 수집합니다. 이후 지능형 디컨볼루션 알고리즘은 이 정보를 재할당하여 검출량을 효과적으로 줄입니다. 이 공정은 측면 약 120 nm, 축 방향 약 350 nm의 공간 해상도를 달성하며, 광시야 현미경의 회절 한계보다 약 2배 향상되고 동일한 기기 ^4,5,6 기준 표준 공초점 모드에 비해 신호 대 잡음비를 4-8배 증가시킵니다. 이러한 향상된 해상도, 우수한 신호 품질, 그리고 일반적인 형광 표지 및 프로토콜과의 호환성이라는 독특한 조합은 광범위한 적용에 있어 가장 큰 장점입니다.

따라서 이러한 접근 가능한 초해상도 현미경은 생명과학 연구에 널리 적용되어, 고정 및 생체 세포 모두에서 소기관 형태, 세포골격 역학, 바이러스-숙주 상호작용, 분자 공위치를 상세히 연구할 수 있게 되었습니다 ^7,8. 상대적으로 부드러운 특성 덕분에 라이브 샘플의 장시간 타임랩스 관찰에 특히 적합합니다.

이러한 첨단 시스템을 핵심 시설에 통합하는 것은 접근성 민주화에 매우 중요하지만, 지속 가능하고 효과적인 운영에는 뚜렷한 도전 과제가 있습니다. 저장대학교 의과대학과 같은 기관 핵심 시설에서는 최적의 성과와 영향력이 세 가지 축에 크게 의존합니다: (1) 표준화되고 재현 가능한 영상 프로토콜, (2) 엄격한 정기 유지보수, (3) 공유 접근을 위한 효과적인 관리 프레임워크. 초기 시스템⁹의 영상 방법이나 일반 시설 관리 원칙^10,11과 같은 특정 측면에 대한 귀중한 자원이 존재하지만, 검증된 공유 자원 관리 모델과 함께 현대 다중화 배열 검출기 플랫폼의 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 통합한 포괄적인 안내서는 현재 부족합니다. 이 프로토콜 기사는 이 간극을 메우는 것을 목표로 합니다.

궁극적인 목표는 공유 자원 환경에서 다중화 배열 검출기를 이용한 공초점 시스템을 효과적으로 구현하고 활용하는 포괄적이고 단계별 가이드를 제공하는 것입니다. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; 시설 관리자는 이러한 서비스를 구축하거나 최적화합니다. 여기서는 시스템 구성, 다중 모달 영상 프로토콜(다색, 3D, 라이브 셀, 타일링, 초해상도 모드를 포함), 그리고 검증된 공유 관리 모델을 체계적으로 상세히 설명합니다. 이 통합 가이드는 이 강력한 영상 기법의 잠재력과 접근성을 극대화하는 데 도움이 됩니다.

Protocol

생물학적 샘플을 이용한 모든 실험은 저장대학교 의과대학 핵심시설의 지침과 규정에 따라 수행되었으며, 기관 생물안전위원회(승인 증명서 번호)의 승인을 받았습니다. BSL20235710079).

참고: 세포 배양과 관련된 모든 절차는 별도 명시가 없는 한 Class II 생물학적 안전 캐비닛 내 멸균 조건 하에서 수행되어야 합니다. 이 프로토콜은 현미경 시스템이 설치되어 있고 레이저 출력이 보정된다는 가정 하에 진행됩니다. 주요 시약, 소모품, 장비(예: 이미징 접시, 커버 유리, 장착 매체)에 대한 상세 사양과 권장 공급업체는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 샘플 준비

참고: 성공적인 초해상도 영상은 최적의 샘플 준비에서 시작됩니다. 고품질, 두께 1.5(0.17mm) 커버 유리 기반 영상 접시의 사용은 고자연 순 오일 침수 대물렌즈의 보정 칼라를 맞추고 구형 수차를 방지하기 위해 필수적입니다. 모든 원심분리 단계는 별도 언급이 없는 한 300 × g 에서 5분간 수행해야 합니다.

1. 다색 초해상도 영상(예: COS7 셀)을 위한 고정 셀 샘플 준비
   참고: 이 프로토콜은 미세소관(Alexa Fluor 568)과 미토콘드리아(Alexa Fluor 488)에 대한 면역염색을 4',6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI) 핵 염색으로 설명하며, 그림 1에 나타난 것입니다.
   1. 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 10% 태아 소 혈청(FBS)을 보충한 Dulbecco의 변형 Eagle 배지(DMEM)에서 COS7 세포를 배양합니다.
   2. 35mm 유리바닥 영상 접시에 1.0 × 10⁵ 셀/접시의 밀도로 플레이트 셀을 부착합니다. 세포가 부착되어 60-70% 수합률(보통 24시간)까지 성장하도록 하세요.
   3. 배양지를 흡인한 후 미리 가열된(37°C) 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 세척합니다. 세포를 고정하여 4% 파라포름알데히드(PFA) 1mL를 PBS에 첨가하고 상온(RT)에서 15분간 배큐합니다.
   4. PFA 용액을 흡입하세요(유해 폐기물로 취급). 세포를 2mL PBS로 세 번 세척하고, 한 번 세척당 5분간 부드럽게 흔들며 배양합니다.
   5. 투과화 및 차단: 세포를 1mL 투과/차단 버퍼(0.1% v/v) Triton X-100, 1% (w/v) 소 혈청 알부민(BSA) PBS에 담아 30분간 RT 투여 상태로 인큐베이팅합니다.
   6. 1차 항체 배양: 항체 희석 완충제(PBS에 1% BSA)를 4°C(또는 RT에서 1-2시간 동안 RT)에서 α-튜불린(마우스 단클론)과 TOMM20(토끼 다클론)에 대한 1차 항체를 혼합하여 배양합니다. 유리 표면을 덮기 위해 접시당 300 μL를 사용하세요.
   7. 세척: 1차 항체 용액을 조심스럽게 흡입하세요. 세포를 0.05% Tween-20(PBST) 함유 PBS 2mL로 세 번, 한 번 5분씩 세척합니다.
   8. 2차 항체 및 핵 염색: 형광 2차 항체와 DAPI를 혼합하여 빛으로부터 보호하는 항체 희석 버퍼(1% BSA/PBS)에서 준비합니다.
      1. 당나귀 항쥐 IgG를 Alexa Fluor 568에 결합한 (1:500)과 당나귀 항토끼 IgG를 Alexa Fluor 488에 결합한 (1:500)를 사용하세요.
      2. 핵 염색을 위해 최종 농도인 1 μg/mL의 DAPI를 포함하세요. 이 혼합물 300 μL을 세포에 적용하고 어두운 환경에서 RT 1시간 배양합니다.
   9. 최종 세척: 염색액을 흡인한 후 세포를 2mL PBS로 세 번, 한 번 5분씩 세척합니다.
   10. 마운팅 매체 적용: 영상 접시에서 PBS를 조심스럽게 흡입하여 샘플을 약간 촉촉하게 남겨둡니다. 즉시 유리 바닥 부분에 경화된 페이드 방지 매운용 매체(예: ProLong Gold)를 소량(~20 μL)으로 바릅니다.
   11. 덮고 경화: #1.5 고정밀 커버 유리잔을 방울에 부드럽게 내려 기포를 피하세요. 마운트 오일을 RT에서 밤새 어두운 상태에서 경화시키거나, 더 빠른 경화가 필요하면 37°C에서 2-4시간 경화시키세요.
2. 타임랩스 영상을 위한 생세포 샘플 준비(예: 형광 단백질 태그를 발현하는 Hep3B 세포).
   참고: 이 프로토콜은 미토콘드리아를 표적으로 하는 형광 단백질(예: EGFP)을 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포의 영상을 설명합니다.
   1. 최소 필수 배지(MEM)에서 10% FBS를 보충한 Hep3B 세포를 배양합니다. 35mm 유리 하단 영상 접시(1.5 커버 유리)에 플레이트 셀을 접시당 0.8 × 10⁵셀로 덮습니다. 최적의 건강과 영상 밀도(보통 18-24시간)를 위해 세포가 약 70-80% 합류율까지 성장하도록 허용하세요.
   2. 영상 촬영 준비: 영상 촬영 당일, 표준 배양지를 부드럽게 2mL 전평형 상태(37°C, 5%_CO2 최소 30분 이상 사용), 페놀 적색 무첨가, 저형광 영상 매체에 10% FBS 및 필요 시 25 mM HEPES 완충제를 보충하여_CO2 인큐베이터 외부에서 pH 안정화를 수행합니다. 이로 인해 배경 형광이 최소화되고 영상 촬영 중 생리적 pH가 유지됩니다.
      참고: 온도, 초점, 세포 건강 안정화를 위해 타임랩스 획득을 시작하기 전에 접시가 환경 챔버 내 미리 가열된 현미경 스테이지에서 최소 30-45분 정도 적응시키도록 하세요.

2. 현미경 시스템 시작, 초기화 및 기본 정렬

1. 현미경 주 유닛, 레이저 발사 모듈(405, 488, 561, 640 nm 고체 레이저 포함), LED 광원, 제어 컴퓨터에 전원을 공급합니다.
   1. 레이저가 최소 15-20분 동안 예열되고 안정되도록 하세요. 이는 특히 정량적 또는 타임랩스 실험에서 안정적인 레이저 출력 출력에 매우 중요합니다.
2. 현미경 운영 소프트웨어를 실행하세요.
3. 메인 인터페이스에서 'Microscope' > 'Initialize'를 선택하거나 소프트웨어의 시작 마법사를 따라가세요.
4. 소프트웨어에서 '획득' 패널로 이동하세요. 대물렌즈 드롭다운 메뉴에서 'Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 오일 ' 또는 실험에 적합한 대물렌즈를 선택하세요.
5. 대물렌즈 전면 렌즈에 직접 침수 오일(굴절률 = 1.518)을 한 방울 바릅니다. 거품 도입은 피하세요.
6. 라이브 셀 영상 촬영의 경우, 영상 촬영 최소 45-60분 전에 환경 챔버와 능동 초점 안정화 시스템(예: 'Definite Focus' >)을 활성화하세요. 온도는 37°C,_CO2 는 5%, 습도는 >60%로 설정하세요. 시스템이 안정될 때까지 기다려 주세요. 챔버 센서로 안정성을 확인하세요.
7. 이제 시스템은 샘플 적재와 영상 매개변수 설정 준비가 완료되었습니다.

3. 다색 형광 영상

1. 준비된 샘플을 현미경 스테이지에 올려놓으세요. 무대를 조심스럽게 들어 올려 덮개 유리가 침수 오일에 닿게 하세요.
2. 획득 소프트웨어에서 '획득' 탭을 탐색하여 새 실험 생성을 선택하세요.
3. 사용한 형광체에 대응하는 여러 영상 트랙(채널)을 추가하세요. 그림 1의 예시에서 다음과 같이 구성하자:
   1. 트랙 1 (DAPI): 여기 405 nm, 검출 410-480 nm.
   2. 트랙 2 (Alexa Fluor 488): 여기 488 nm, 검출 495-550 nm.
   3. 트랙 3 (Alexa Fluor 568): 여기 561 nm, 검출 570-620 nm.
4. 각 트랙마다 공초점 핀홀 직경을 1 에어리 유닛(1 AU)으로 설정하세요.
5. 각 채널별로 다음 반복 과정을 사용하여 레이저 출력과 검출기 이득을 최적화합니다:
   1. 첫 번째 채널(예: DAPI)을 선택하세요. '실시간' 스캔 모드로 전환하세요.
   2. 초기 레이저 출력을 낮은 값(예: 0.1-0.5%)으로 설정하세요. 검파기 이득 을 선형 범위 내에서 중간 수준(예: GaAsP PMT의 경우 700 V)으로 설정하세요.
   3. 레이저 출력을 점차 증가시켜 실제 이미지에서 목표 구조물이 배경 위로 명확히 보일 때까지 진행합니다.
   4. 히스토그램 디스플레이를 열어. 픽셀 채도가 없는지 확인하세요(히스토그램이 오른쪽 가장자리에 쌓이지 않아야 합니다). 필요하다면 레이저 출력을 줄이세요.
   5. 검출기 이득을 조절하여 밝고 저잡음 이미지를 얻으세요. 과도한 잡음을 막기 위해 850V 이상의 이득을 피하세요.
   6. 나머지 모든 형광 채널에 대해 3.5.1-3.5.5 단계를 반복합니다.
      참고: 레이저 출력, 이득, 픽셀 잔류 시간을 균형 있게 조정하여 신호 대 잡음비를 극대화하고 광손상을 최소화하세요. 라이브 셀은 낮은 전력과 짧은 체류 시간을 우선시하세요.
6. 이미지 형식(픽셀 수)과 픽셀 체류 시간을 설정하세요.
   1. 픽셀 크기를 나이퀴스트 기준인 픽셀 크기 ≤(해상도 / 2.3)에 맞게 설정하세요. 표준 공초점 영상(측면 해상도 ~250 nm)의 경우, 픽셀 크기를 ≤108 nm로 설정하세요.
   2. 소프트웨어의 '나이퀴스트 ' 샘플링 버튼을 사용해 이 값이 자동으로 계산될 수 있다면,
   3. 픽셀 드웰 시간을 설정하세요. 더 높은 신호 대 잡음비를 위해 더 긴 체류 시간(예: 1.0-2.0 μs)을 사용하거나, 더 빠른 영상을 위해 더 짧은 체류 시간(예: 0.5-1.0 μs)을 사용하세요.
7. 트랙 간에 '순차 스캔(Sequential Scan)' 모드를 선택해 크로스토크를 최소화하세요.
8. '시작'을 클릭하면 단일 이미지를 획득할 수 있습니다. 관련 메타데이터와 함께 이미지를 저장하세요.

4. 차등 간섭 대비(DIC) 영상

1. 획득 소프트웨어의 '획득' 탭에서 '새 채널 추가 '를 선택하고 투과광 감지를 설정하세요.
2. 소프트웨어에서 적절한 투과광 검출기(종종 T-PMT(투과광 증배관) 또는 ESID(외부 시스템 인터페이스 검출기)라고 불림)를 선택하세요.
3. DIC 프리즘 및 편광자 구성:
   1. 하드웨어 제어판이나 소프트웨어 인터페이스에서 목표 화면에 맞는 DIC 프리즘을 선택하세요(예: 63배 대물렌즈의 경우 'DIC III').
   2. 선택한 프리즘을 빛 경로에 삽입하세요.
4. 편광 필터와 DIC 슬라이더를 최적의 대비로 조정하세요:
   1. 분석기(편광 필터)를 회전시켜 '라이브' 이미지의 배경이 어둡거나 매우 어두워 보일 때까지 반복합니다.
   2. 실시간 이미지를 관찰하면서 DIC 슬라이더 위치를 조금씩 천천히 조정하세요.
   3. 세포 특징(예: 막, 핵)이 중립적인 회색 배경에 뚜렷한 그림자 드리포스와 유사 3차원 부조로 나타날 때까지 최적화합니다.
5. DIC의 조명 파장을 가시광선 범위(예: 488 nm 또는 546 nm)로 설정하세요.
6. 투과된 빛 채널의 투과 강도(레이저 또는 램프 출력)와 검출기 이득을 조정하여 포화 없이 선명한 이미지를 얻으세요.
7. DIC 이미지를 확보하세요.

5. 3차원 재구성을 위한 Z-스택 획득

참고: Z-스택을 정의하기 전에, 3절에 설명된 것처럼 모든 영상 매개변수(레이저 파워, 게인, 핀홀, 픽셀 크기)를 단일 최적 초점면에 설정하세요. 이로 인해 모든 광학 섹션에서 일관된 설정이 보장됩니다.

1. '획득' 탭에서 'Z-스택' 모드를 선택하세요.
2. 관심 부피를 정의하세요:
   1. 빠른 실시간 스캔을 사용해 관심 있는 가장 상단 구조물에 집중하세요.
   2. '우선 설정'(또는 '상단')을 클릭하세요.
   3. 관심 있는 가장 아래 구조물에 주의 깊게 집중하세요.
   4. '마지막에 설정'(또는 '하단')을 클릭하세요. 소프트웨어가 전체 깊이를 표시합니다.
3. Z-단계 크기를 축 방향에서 나이퀴스트 샘플링 기준을 만족하도록 설정하세요. (일반적으로 D_r/2.3, 여기서 d_r 은 축 해상도입니다). 63배/1.4 NA 오일 대물렌즈의 경우, 0.3-0.4 μm을 사용하세요.
4. 또는 소프트웨어의 '최적' 또는 '나이퀴스트' 버튼을 사용해 스텝 크기를 자동으로 계산할 수도 있습니다.
5. 3절에 설명한 대로 각 채널별로 영상 매개변수(레이저 출력, 이득, 핀홀 = 1 AU)를 설정하세요. 약한 신호의 경우, 단일 2D 이미지에 비해 레이저 출력이나 이득을 약간 증가시키는 것을 고려해 보세요.
6. 전체 이미지 스택을 수집하기 위해 획득을 시작하세요.
   참고: 총 획득 시간 = (단일 슬라이스에서의 프레임 시간) × (슬라이스 수)
   특히 라이브 샘플을 위해 그에 맞게 계획을 세우세요.
7. 3D 재구성 및 시각화:
   1. 소프트웨어의 'Processing' 모듈(예: 3D 투사 기능)을 사용하거나 ImageJ/Fiji 같은 전용 소프트웨어에서 이미지 스택을 열어보세요.
   2. 모든 초점 맞춘 신호를 단일 2D 이미지에서 보기 위해 최대 강도 투영(MIP)을 생성합니다.
   3. 진정한 3D 표현을 위해서는 볼륨 렌더링을 적용하세요. 밝기, 불투명도, 조명을 필요에 따라 조절하세요.
   4. 축 방향 범위와 정규 위치를 검사하기 위해 직교 뷰(XZ 및 YZ 단면)를 생성합니다.

6. 생세포의 타임랩스 영상

1. 1.2절에 설명된 대로 생세포를 준비합니다. 그리고 접시를 환경 챔버 내 미리 예열된 현미경 스테이지에 장착합니다.
2. 샘플이 2.6절에 설명된 대로 최소 45-60분 정도 적응시켜 안정화를 보장합니다.
3. 건강하고 적절한 간격의 셀이 있는 시야로 이동하여 섹션 3.5에 최적화된 매개변수를 사용하여 단일 고품질 스냅샷을 획득하세요.
4. 능동 초점 안정화 시스템(예: Definite focus 또는 유사)을 작동시키세요. 이는 열적 드리프트를 보상하기 위한 장기 실험에서 절대 양보할 수 없는 조건입니다.
5. '획득' 탭에서 '시계열 모드'를 선택하세요.
6. 속도, 해상도, 광독성 간의 균형을 바탕으로 적절한 영상 모드를 선택하세요:
   1. 덜 동적인 과정에서 최대 공간 해상도를 얻으려면 'SR'(초해상도) 모드를 선택하세요.
   2. 많은 소기관 역학에 적합한 균형을 위해 'SR 2 Y ' 또는 'SR 4 Y '(가속 초분해상 모드)를 선택하세요.
   3. 초해상도 없이 매우 고속 촬영을 원한다면 '공초점' 또는 'Co 2 Y' 모드를 선택하세요.
7. 실험 타임라인을 정의하세요: 실험의 총 시간과 연속된 프레임 사이의 시간 간격(Δt)을 설정하세요. (예: 미토콘드리아 운동성은 5-30초)
8. 광손상을 최소화하기 위한 영상 파라미터 최적화:
   1. 감지 가능한 신호를 내는 가장 낮은 레이저 출력부터 시작하세요.
   2. 검출기 이득을 선형 범위(600-850 V) 내에서 조정하여 실제 신호 레벨을 맞추고, 레이저 출력 증가보다 이득을 선호합니다.
   3. 이미지 품질 요구사항에 부합하는 가장 빠른 스캔 속도(가장 짧은 픽셀 체류 시간)를 사용하세요.
9. 타임랩스 획득 시작. 처음 몇 프레임은 초점 안정성과 세포 건강 상태를 모니터링하세요.

7. 대면적 타일 스캔 영상

1. '획득' 탭에서 '타일 스캔' 모드를 선택하세요.
2. 타일링리전을 두 가지 방법 중 하나로 정의하세요:
   1. 레이아웃 기반: X와 Y 방향의 타일 수를 지정합니다(예: 3 x 3).
   2. ROI 기반: '라이브' 이미지 위에 수동으로 직사각형을 그려 관심 영역을 정의합니다. 소프트웨어가 자동으로 필요한 타일 수를 계산합니다.
3. 인접한 타일 간 겹침을 10-15%로 설정하세요.
   참고: 이 겹침은 소프트웨어의 스티칭 알고리즘이 매끄러운 합성 이미지를 생성할 수 있도록 충분한 정보를 제공합니다.
4. 정적 이미지처럼 단일 타일에 대해 레이저 출력, 이득, 해상도 등 영상 파라미터를 설정하세요.
   참고: 매우 큰 타일 영역의 경우, 전체 획득 시간을 실용적으로 유지하고 광표백을 최소화하기 위해 더 빠른 스캔 모드(예: 'Co 2 Y')를 사용하는 것을 고려하세요.
5. 타일링 획득을 시작하세요. 소프트웨어가 자동으로 타일을 획득하고 스티칭합니다.
6. 획득 후에는 특히 타일 경계 부분에서 스티칭된 이미지를 꼼꼼히 살펴보세요. 필요하다면 소프트웨어의 수동 스티칭 조정 도구를 사용하세요.

8. 다중화 배열 검출기를 이용한 초해상도 영상

1. '획득' 탭에서 모드 선택기로 이동해 '스마트 설정' 을 클릭한 후 'Airyscan' 모드를 선택하세요. 그 다음 다중화 배열 검출기의 작동 모드로 '슈퍼 해상도(SuperResolution)'를 선택하세요.
2. 실험 우선순위에 따라 구체적인 획득 모드를 선택하세요:
   1. 'SR' 모드: 가능한 최고의 공간 해상도(~120 nm 횡방향)를 위한 모드입니다. 고정 샘플에 사용됩니다.
   2. 'SR 2 Y' 모드: 해상도와 속도 사이의 균형을 제공합니다.
   3. 'SR 4 Y' 모드: 가장 빠른 초해상도 모드(이론상 최대 ~25fps 라인 속도)로, 라이브 셀 이미징에 최적화되어 빛의 선량을 최소화합니다.
   4. 'Co 2 Y' 모드: 초해상도가 필요 없을 때 공초점과 유사한 영상 속도와 향상된 신호 대 잡음비를 제공합니다.
      참고: 해상도 값(예: 120 nm)은 이상적인 조건¹²에서의 시스템 사양입니다. 실제 해상도는 시료 준비, 신호 대 잡음비, 올바른 처리에 따라 달라집니다.
3. 레이저 출력, 검출기 이득 등 영상 파라미터를 설정하세요.
   1. 라이브셀 이미징의 경우, 광손상을 줄이기 위해 공초점 모드보다 낮은 레이저 출력으로 시작하세요.
   2. 어둡고 고정된 샘플의 경우, 충분한 신호대잡음비를 달성하기 위해 더 높은 레이저 출력과/또는 이득이 필요할 수 있습니다.
   3. '라이브' 모드에서 깨끗하고 대비가 높은 이미지를 얻을 수 있는 최소 레이저 파워를 찾으세요.
4. 픽셀 크기와 드웰 시간을 설정하세요.
   1. 향상된 해상도를 캡처하려면 픽셀 크기를 나이퀴스트 기준(픽셀 크기 ≤(원하는 해상도 / 2.3)을 만족하도록 설정하세요. SR 모드(목표 120 nm)의 경우 픽셀 크기를 ≤~52 nm로 설정하세요.
   2. 소프트웨어의 '최적' 또는 '나이퀴스트' 버튼을 사용해 가능하다면 자동으로 계산하세요.
5. 이미지를 확보하세요. 원시 데이터는 다중화된 신호를 포함하고 있으며 아직 초해석되지 않았습니다.
6. 획득된 데이터를 처리하여 초해상도 달성:
   1. 소프트웨어의 처리 모듈로 이동하세요.
   2. 데이터셋을 선택하고 '초해상도 처리(SuperResolution Processing)' 기능을 선택하세요.
   3. '자동' 설정부터 시작하세요. 저SNR 데이터의 경우, '강도'와 '노이즈 필터'를 수동으로 조정하여 아티팩트를 유발하지 않고 선명도를 높이세요.
   4. (선택 사항) 특히 3D 스택에서 최고 충실도를 위해 추가적인 조인트 디컨볼루션(jDCV) 단계를 적용하세요.
   5. 처리 실행 처리된 시점과 처리되지 않은 시각을 비교하여 실제 세부사항의 향상을 검증하세요.
7. (선택 사항) 모드 간 신호대잡음비(SNR)의 정량적 비교를 위해:
   1. 동일한 샘플을 다양한 모드로 촬영하세요.
   2. 분석 소프트웨어에서는 균일한 구조에 관심 영역(ROI)을 정의하고 평균 신호 강도를 측정합니다.
   3. 배경 ROI를 정의하고 배경 강도의 표준편차를 측정합니다.
   4. SNR = (평균 신호) / (배경 표준편차)를 계산합니다.
8. (선택 사항) 형광 구슬을 이용한 경험적 시스템 해상도 측정을 위해:
   1. 100nm 형광 구슬 샘플을 준비하세요.
   2. 나이퀴스트 샘플링을 통해 SR 모드의 고립 비드의 Zstack을 획득합니다.
   3. 스택을 초해상도와 (선택적으로) jDCV로 처리합니다.
   4. 소프트웨어의 'PSF 측정' 도구를 사용해 3D 가우시안을 맞추고 전체 폭을 반높이(FWHM) 값으로 기록하세요.

Results

다색 형광 영상
고정된 COS7 세포에 대한 다색 형광 영상은 3절에서 설명한 대로 수행되었습니다. α-튜불린(미세소관)과 TOMM20(미토콘드리아)에 대한 항체가 DAPI 핵 변색과 함께 사용되었습니다. 그림 1에 나타난 바와 같이, 핵(파란색), 미토콘드리아(녹색, Alexa Fluor 488), 미세소관(빨간색, Alexa Fluor 568)이 높은 특이도와 최소한의 스펙트럼 교차로 명확하게 구분되어 순차 스캔의 효과와 최적화된 검출 설정이 검증되었습니다.

형광과 차등 간섭 대비(DIC) 통합
형광 채널과 DIC 영상의 겹쳐 보면 상황적 형태학적 정보를 제공하였다(섹션 4). 그림 2는 형광 신호와 정확히 겹쳐진 세포 특징의 그림자 부조를...

Discussion

여기 제시된 통합 프로토콜은 다중화 배열 초해상도 검출기가 장착된 현대 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 기능을 지속 가능한 공유 자원 프레임워크 내에서 구현하기 위한 포괄적인 로드맵을 제공합니다. 이 섹션에서는 이 방법의 중요한 측면, 실용적 구현, 그리고 바이오이미징 분야에서의 위치를 종합적으로 정리합니다. 이 프로토콜의 성공적인 실행은 여러 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 꼼꼼한 샘플 준비가 기본입니다; 고해상도 호환 기판(예: #1.5 커버 글라스)과 최적화된 면역염색 프로토콜의 사용은 초^{해상도 처리에} 필요한 신호 무결성과 낮은 배경 효과를 달성하는 데 필수적입니다. 획득 과정에서는 라이브 피드백과 나이퀴스트 샘플링 기준에 따라 레이저 전력, 검출기 이득, 픽셀 주류 시간을 세심하게 균형 맞추는 것이 신호 대 잡음비를 극대화하고 광손상을 최소화하는 데 매우 중요하며, 이는 특히 라이브 셀 응용에서 매우 중요한 고려...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
그리고 nbsp; COS7 셀	ATCC(또는 유사)	CRL-1651	아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포주 다색 초해상도 영상을 위한 고정 셀 샘플 준비에 사용됨;
그리고 nbsp; 당나귀 항생쥐 IgG, Alexa Fluor 568 켤레	인비트로젠(또는 유사)	A10037	미세소관 염색을 위한 2차 항체. 1:500 희석 시 사용
그리고 nbsp; 둘벡코 s 변형 이글 미디엄(DMEM), 고포도당	깁코(또는 유사)	11965092	COS7 세포용 표준 배양지에 10% FBS를 보충합니다.
그리고 nbsp; 태아 소 혈청(FBS), 열 비활성화	깁코(또는 유사)	10082147	혈청 보충제는 모든 세포 배양 배지에서 10%(v/v) 용량으로 사용됩니다.
그리고 nbsp; 유리 바닥 이미징 디시(35mm, µ-접시, #1.5 폴리머 커버슬립, 두께 0.17mm)	이비디(또는 유사)	81156	세포 플레이트 및 영상 촬영을 위한 기판입니다. 고NA 오일 침지 물물렌즈와의 호환성에 매우 중요합니다.
그리고 nbsp; 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (ZEN 모듈)	칼 자이스 AG	젠 3.5 (파란색)	3D 재구성, 초해상도 처리(예: Airyscan 처리), PSF 측정, SNR 분석에 사용됩니다.
그리고 nbsp; 이미지J / 피지	오픈 소스	해당 없음	추가 3D 재구성, 직교 뷰 생성, 일반 이미지 분석에 사용됩니다.
그리고 nbsp; 침수유 (굴절률 = 1.518)	칼 자이스(또는 유사)	444960-0000-000	오일 침지 대물렌즈(예: 63x/1.4 NA)와 함께 사용.
그리고 nbsp; 다중화 배열 검출기가 장착된 레이저 스캐ning 공초점 현미경 시스템(예: Airyscan 2가 탑재된 ZEISS LSM 900)	칼 자이스 AG	LSM 900 (에어리스칸 2)	프로토콜에 설명된 모든 공초점 및 초해상도 모드에 사용되는 주요 영상 플랫폼입니다.
그리고 nbsp; 얼과 함께하는 최소 필수 매체(MEM) s 염	깁코(또는 유사)	11095080	Hep3B 세포용 표준 배양 배양지에 10% FBS를 보충합니다.
그리고 nbsp; 마우스 항-알파;-튜불린 단클론 항체 (클론 DM1A)	시그마-올드리치(또는 유사)	T6199	미세소관 표지용 1차 항체. 1:500 희석 시 사용
그리고 nbsp; 파라포름알데히드(PFA), PBS 내 4%	그리고 nbsp; 진판  (또는 유사함)	TBS5083	세포 고정제. 실온에서 15분간 사용하세요. 적절한 예방 조치를 취하세요.
그리고 nbsp; 페놀 적색 없는 영상 배지	깁코(또는 유사)	21063029	저자가형광 배지로 생세포 영상에 사용됩니다. 5% CO2 37° 상태로 예비평형; 사용 전 C.
그리고 nbsp; 인산염 완충 식염수(PBS), 1X, pH 7.4	셀월드(또는 유사)	C0162-311	프로토콜 전반에 걸쳐 세척 및 희석 완충제로 사용되었습니다.
그리고 nbsp; 프로롱 골드 안티페이드 마운턴트	인비트로젠(또는 유사)	P36930	고정된 시료에서 형광을 보존하기 위한 경화 마운팅 매체.
그리고 nbsp; 트리톤 X-100	시그마-올드리치(또는 유사)	T8787	세포 투과에 0.1%(v/v)로 사용됩니다
그리고 nbsp; 트윈-20	시그마-올드리치(또는 유사)	P9416	항체 인큐베이터 후 세척 단계에 PBS(PBST)에서 0.05%(v/v)로 사용됨.
소 혈청 알부민(BSA), 분획 V	시그마-올드리치(또는 유사)	A7906	PBS에서 1%(w/v) 용량으로 차단 및 항체 희석 완충제의 성분으로 사용됨.
다피 (4', 6-디아미디노-2-페닐린돌)	시그마-올드리치(또는 유사)	D9542	핵 카운터 스테인. 최종 농도는 1 및 마이크로로 사용; g/mL.
당나귀 안티-래빗 IgG, 알렉사 플루오르 488 접합체	인비트로젠(또는 유사)	A21206	미토콘드리아 염색을 위한 2차 항체. 1:500 희석 시 사용
형광 미세구(비즈), 직경 100 nm	Invitrogen(예: TetraSpeck&trade) 또는 유사 제품입니다	T7279	시스템의 경험적 측정에 사용됨' 점 분산 함수(PSF)와 해상도를 모두 포함합니다.
EGFP-미토콘드리아를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포	임모셀	IM-H367	인간 간종 세포주가 미토콘드리아 기질에 표적된 EGFP를 안정적으로 발현하도록 설계되었습니다. 라이브 셀 타임랩스 영상에 사용됩니다.
HEPES 완충액, 1 M	깁코(또는 유사)	15630080	CO2 인큐베이터 외부에서 라이브 영상 시 pH 안정화를 위해 최종 농도 25 mM에서 영상 배지에 사용되었습니다.
고정밀 커버글라스 (#1.5, 두께 0.17 mm)	마리엔펠트(또는 유사)	107052	고정 샘플 장착에 사용됩니다.
현미경 운영 소프트웨어(예: ZEN 블루 에디션)	칼 자이스 AG	젠 3.5 (파란색)	시스템 제어, 이미지 획득, 기본 처리에 사용됩니다.
대물렌즈: 플랜-아포크로맷 63x/1.40 NA 오일 DIC	칼 자이스 AG	421462-9900-000	고해상도 영상 촬영에 주로 사용되는 목적입니다.
토끼 항-TOMM20 폴리클론 항체	Abcam(또는 유사)	AB186735	미토콘드리아 표지용 1차 항체. 1:1000 희석 비율로 사용됨;