초해상도 영상 및 공유 관리: 다중화 검출이 포함된 공초점 현미경 프로토콜

Summary

이 프로토콜은 고해상도 셀룰러 및 아셀룰러 이미징을 위한 다중화 배열 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 응용과 공유 자원 관리를 상세히 설명합니다. 이 워크플로우는 단일 플랫폼 내에서 공초점에서 초해상도(~120 nm)까지 다중 모달 이미징을 가능하게 하여 나노스케일 시각화를 더욱 쉽게 접근할 수 있게 합니다.

Abstract

초해상도 현미경(SRM)은 기존 광각 현미경의 회절 한계를 극복하여 세포 내 구조의 나노 규모 시각화를 가능하게 합니다. 그러나 자극 방출 소모현미경(STED), 광활성화 위치 현미경(PALM) / 확률적 광학 재구성 현미경(STORM), 구조화 조명 현미경(SIM)과 같은 기법의 광범위한 채택은 높은 광독성, 특수 시료 준비, 복잡한 조작 등의 요인에 의해 제약을 받을 수 있습니다. 여기서는 다중화 초해상도 검출기와 통합된 레이저 스캐닝 공초점 플랫폼을 활용한 종합 프로토콜을 제시합니다. 이 시스템은 계산 처리와 결합되어 동일한 워크플로우 내에서 공초점 촬영과 초해상도 영상 간 간편한 전환을 가능하게 합니다. 이 프로토콜은 빠르고 고해상도이며 저광독성 이미징을 위한 사용자 친화적인 접근법을 제공합니다. 상세 방법은 다색 형광, 차동 간섭 대비(DIC), 3차원 Z-스택 재구성, 타임랩스 라이브 셀 이미징, 대면적 타일링, 그리고 다중화 배열 검출기가 제공하는 다양한 초해상도 모드를 포함한 다중 모달 영상 기능을 포함합니다. 체계적인 비교 결과, 초해상도 모드는 약 120 nm의 횡방향 해상도를 달성하며, 이는 기존 광야장 현미경의 회절 한계보다 약 2배 향상된 성능을 보여주며, 동일한 플랫폼에서 표준 공초점 작동 대비 해상도와 신호 대 잡음비(4-8배)에서 상당한 향상을 보입니다. 논의는 또한 이 기술의 지속 가능한 운영을 지원하는 데 필수적인 공유 자원 관리 모델의 핵심 사항도 다룹니다. 이 통합 가이드는 생명과학 연구에서 이 접근성 높은 고급 영상 기술을 도입하고 최대한 활용하고자 하는 신규 및 경험 연구자, 시설 관리자 모두에게 귀중한 자료로 활용됩니다.

Introduction

동적 세포 내 구조의 시각화는 생명과학 연구를 발전시키는 데 근본적입니다. 그러나 전통적인 광학 현미경의 해상도는 좌절로 약 200nm로 제한되어 동적 세포 내 과정을 해석하는 데 제한이 있습니다. 이 장벽을 극복하기 위해 다양한 초해상도 기법이 개발되었습니다. 그러나 STED 현미경, PALM/STORM, SIM과 같은 기법은 높은 광독성, 특수 형광포체 또는 샘플 준비의 필요성, 복잡한 정렬 절차, 집중적인 계산 처리 등 다중 사용자 환경에서 널리 채택되는 데 장애물이 되는 경우가 많습니다 ^1,2,3.

이와 관련하여, 다중화 배열 검출기를 갖춘 공초점 현미경 시스템은 다중 픽셀 검출과 계산 재할당을 통해 초해상도 영상을 가능하게 하여 기술적 임계^기준을 크게 낮출 수 있는 매력적인 대안을 제공합니다. 이 방법은 32원소 갈륨 비소인산물(GaAsP) 검출기 배열을 활용하여 각 스캔 지점에서 더 많은 광자를 수집합니다. 이후 지능형 디컨볼루션 알고리즘은 이 정보를 재할당하여 검....

Protocol

생물학적 샘플을 이용한 모든 실험은 저장대학교 의과대학 핵심시설의 지침과 규정에 따라 수행되었으며, 기관 생물안전위원회(승인 증명서 번호)의 승인을 받았습니다. BSL20235710079).

참고: 세포 배양과 관련된 모든 절차는 별도 명시가 없는 한 Class II 생물학적 안전 캐비닛 내 멸균 조건 하에서 수행되어야 합니다. 이 프로토콜은 현미경 시스템이 설치되어 있고 레이저 출력이 보정된다는 가정 하에 진행됩니다. 주요 시약, 소모품, 장비(예: 이미징 접시, 커버 유리, 장착 매체)에 대한 상세 사양과 권장 공급업체는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 샘플 준비

참고: 성공적인 초해상도 영상은 최적의 샘플 준비에서 시작됩니다. 고품질, 두께 1.5(0.17mm) 커버 유리 기반 영상 접시의 사용은 고자연 순 오일 침수 대물렌즈의 보정 칼라를 맞추고 구형 수차를 방지하기 위해 필수적입니다. 모든 원심분리 단계는 별도 언급이 없는 한 300 × g 에서 5분간 수행해야 합니다.

1. 다색....

Results

다색 형광 영상
고정된 COS7 세포에 대한 다색 형광 영상은 3절에서 설명한 대로 수행되었습니다. α-튜불린(미세소관)과 TOMM20(미토콘드리아)에 대한 항체가 DAPI 핵 변색과 함께 사용되었습니다. 그림 1에 나타난 바와 같이, 핵(파란색), 미토콘드리아(녹색, Alexa Fluor 488), 미세소관(빨간색, Alexa Fluor 568)이 높은 특이도와 최소한의 스펙트럼 교차로 명확하게 구분되어 순차 스캔의 효과와 최적화된 검출 설정이 검증되었습니다.

형광과 차등 간섭 대비(DIC) 통합
형광 채널과 DIC 영상의 겹쳐 보면 상황적 형태학적 정보를 제공하였다(섹션 4). 그림 2는 형광 신호와 정확히 겹쳐진 세포 특징의 그림자 부조를.......

Discussion

여기 제시된 통합 프로토콜은 다중화 배열 초해상도 검출기가 장착된 현대 공초점 현미경 시스템의 첨단 영상 기능을 지속 가능한 공유 자원 프레임워크 내에서 구현하기 위한 포괄적인 로드맵을 제공합니다. 이 섹션에서는 이 방법의 중요한 측면, 실용적 구현, 그리고 바이오이미징 분야에서의 위치를 종합적으로 정리합니다. 이 프로토콜의 성공적인 실행은 여러 중요한 단계에 달려 있습니다. 첫째, 꼼꼼한 샘플 준비가 기본입니다; 고해상도 호환 기판(예: #1.5 커버 글라스)과 최적화된 면역염색 프로토콜의 사용은 초^{해상도 처리에} 필요한 신호 무결성과 낮은 배경 효과를 달성하는 데 필수적입니다. 획득 과정에서는 라이브 피드백과 나이퀴스트 샘플링 기준에 따라 레이저 전력, 검출기 이득, 픽셀 주류 시간을 세심하게 균형 맞추는 것이 신호 대 잡음비를 극대화하고 광손상을 최소화하는 데 매우 중요하며, 이는 특히 라이브 셀 응용에서 매우 중요한 고려.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
그리고 nbsp; COS7 셀	ATCC(또는 유사)	CRL-1651	아프리카 녹색 원숭이 신장 섬유아세포주 다색 초해상도 영상을 위한 고정 셀 샘플 준비에 사용됨;
그리고 nbsp; 당나귀 항생쥐 IgG, Alexa Fluor 568 켤레	인비트로젠(또는 유사)	A10037	미세소관 염색을 위한 2차 항체. 1:500 희석 시 사용
그리고 nbsp; 둘벡코 s 변형 이글 미디엄(DMEM), 고포도당	깁코(또는 유사)	11965092	COS7 세포용 표준 배양지에 10% FBS를 보충합니다.
그리고 nbsp; 태아 소 혈청(FBS), 열 비활성화	깁코(또는 유사)	10082147	혈청 보충제는 모든 세포 배양 배지에서 10%(v/v) 용량으로 사용됩니다.
그리고 nbsp; 유리 바닥 이미징 디시(35mm, µ-접시, #1.5 폴리머 커버슬립, 두께 0.17mm)	이비디(또는 유사)	81156	세포 플레이트 및 영상 촬영을 위한 기판입니다. 고NA 오일 침지 물물렌즈와의 호환성에 매우 중요합니다.
그리고 nbsp; 이미지 처리 및 분석 소프트웨어 (ZEN 모듈)	칼 자이스 AG	젠 3.5 (파란색)	3D 재구성, 초해상도 처리(예: Airyscan 처리), PSF 측정, SNR 분석에 사용됩니다.
그리고 nbsp; 이미지J / 피지	오픈 소스	해당 없음	추가 3D 재구성, 직교 뷰 생성, 일반 이미지 분석에 사용됩니다.
그리고 nbsp; 침수유 (굴절률 = 1.518)	칼 자이스(또는 유사)	444960-0000-000	오일 침지 대물렌즈(예: 63x/1.4 NA)와 함께 사용.
그리고 nbsp; 다중화 배열 검출기가 장착된 레이저 스캐ning 공초점 현미경 시스템(예: Airyscan 2가 탑재된 ZEISS LSM 900)	칼 자이스 AG	LSM 900 (에어리스칸 2)	프로토콜에 설명된 모든 공초점 및 초해상도 모드에 사용되는 주요 영상 플랫폼입니다.
그리고 nbsp; 얼과 함께하는 최소 필수 매체(MEM) s 염	깁코(또는 유사)	11095080	Hep3B 세포용 표준 배양 배양지에 10% FBS를 보충합니다.
그리고 nbsp; 마우스 항-알파;-튜불린 단클론 항체 (클론 DM1A)	시그마-올드리치(또는 유사)	T6199	미세소관 표지용 1차 항체. 1:500 희석 시 사용
그리고 nbsp; 파라포름알데히드(PFA), PBS 내 4%	그리고 nbsp; 진판  (또는 유사함)	TBS5083	세포 고정제. 실온에서 15분간 사용하세요. 적절한 예방 조치를 취하세요.
그리고 nbsp; 페놀 적색 없는 영상 배지	깁코(또는 유사)	21063029	저자가형광 배지로 생세포 영상에 사용됩니다. 5% CO2 37° 상태로 예비평형; 사용 전 C.
그리고 nbsp; 인산염 완충 식염수(PBS), 1X, pH 7.4	셀월드(또는 유사)	C0162-311	프로토콜 전반에 걸쳐 세척 및 희석 완충제로 사용되었습니다.
그리고 nbsp; 프로롱 골드 안티페이드 마운턴트	인비트로젠(또는 유사)	P36930	고정된 시료에서 형광을 보존하기 위한 경화 마운팅 매체.
그리고 nbsp; 트리톤 X-100	시그마-올드리치(또는 유사)	T8787	세포 투과에 0.1%(v/v)로 사용됩니다
그리고 nbsp; 트윈-20	시그마-올드리치(또는 유사)	P9416	항체 인큐베이터 후 세척 단계에 PBS(PBST)에서 0.05%(v/v)로 사용됨.
소 혈청 알부민(BSA), 분획 V	시그마-올드리치(또는 유사)	A7906	PBS에서 1%(w/v) 용량으로 차단 및 항체 희석 완충제의 성분으로 사용됨.
다피 (4', 6-디아미디노-2-페닐린돌)	시그마-올드리치(또는 유사)	D9542	핵 카운터 스테인. 최종 농도는 1 및 마이크로로 사용; g/mL.
당나귀 안티-래빗 IgG, 알렉사 플루오르 488 접합체	인비트로젠(또는 유사)	A21206	미토콘드리아 염색을 위한 2차 항체. 1:500 희석 시 사용
형광 미세구(비즈), 직경 100 nm	Invitrogen(예: TetraSpeck&trade) 또는 유사 제품입니다	T7279	시스템의 경험적 측정에 사용됨' 점 분산 함수(PSF)와 해상도를 모두 포함합니다.
EGFP-미토콘드리아를 안정적으로 발현하는 Hep3B 세포	임모셀	IM-H367	인간 간종 세포주가 미토콘드리아 기질에 표적된 EGFP를 안정적으로 발현하도록 설계되었습니다. 라이브 셀 타임랩스 영상에 사용됩니다.
HEPES 완충액, 1 M	깁코(또는 유사)	15630080	CO2 인큐베이터 외부에서 라이브 영상 시 pH 안정화를 위해 최종 농도 25 mM에서 영상 배지에 사용되었습니다.
고정밀 커버글라스 (#1.5, 두께 0.17 mm)	마리엔펠트(또는 유사)	107052	고정 샘플 장착에 사용됩니다.
현미경 운영 소프트웨어(예: ZEN 블루 에디션)	칼 자이스 AG	젠 3.5 (파란색)	시스템 제어, 이미지 획득, 기본 처리에 사용됩니다.
대물렌즈: 플랜-아포크로맷 63x/1.40 NA 오일 DIC	칼 자이스 AG	421462-9900-000	고해상도 영상 촬영에 주로 사용되는 목적입니다.
토끼 항-TOMM20 폴리클론 항체	Abcam(또는 유사)	AB186735	미토콘드리아 표지용 1차 항체. 1:1000 희석 비율로 사용됨;