방법 논문

네트워크 약리학 및 분자 도킹 분석을 표준화하기 위한 신약 발견을 위한 재현 가능한 계산 워크플로우

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DOI:

10.3791/70171

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2026년 4월 24일

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1National Institute of TCM Constitution and Preventive Treatment of Disease, Wangqi Academy of Beijing University of Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 2School of Traditional Chinese Medicine, Beijing University of Chinese Medicine, 3School of Traditional Chinese Medicine, Southern Medical University, 4Sunsimiao Hospital, Beijing University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 표준화된 프로토콜은 네트워크 약리학과 분자 도킹을 신약 개발을 위한 분자 동역학(MD) 시뮬레이션과 통합합니다. 공개 데이터셋을 활용한 다중 표적 약물 스크리닝에 적합한 정량적 스크리닝 기준과 재현 가능한 단계를 설정하고 결과 신뢰성을 향상시킵니다.

초록

네트워크 약리학과 분자 도킹은 신약 개발에 널리 적용되지만, 분산된 워크플로우와 일관성 없는 작업은 결과 재현성을 자주 저해합니다. 여기서는 이러한 접근법을 약물 스크리닝과 메커니즘 탐색을 위한 재현 가능한 프레임워크로 통합한 표준화된 프로토콜을 설명하며, 워크플로우는 데이터 준비, 계산 분석, 검증의 세 단계로 순차적으로 구성되어 있습니다. 준비 단계에서는 공개 데이터베이스의 화합물 라이브러리를 경구 생체이용률, 약물 유사성, 독성 예측 등 흡수, 분포, 대사, 배설, 독성(ADMET) 기준으로 필터링하며, 잠재적 치료 표적은 표적 예측과 질병 관련 데이터베이스 통합을 통해 약물-질병 상호작용 후보를 포괄적으로 식별합니다. 계산 분석 단계에서는 겹치는 표적들이 유전자 온톨로지(GO) 및 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 풍부 분석 및 단백질-단백질 상호작용 네트워크 위상 분석을 거쳐 핵심 표적을 식별합니다; 분자 도킹은 두 가지 표준화된 선택 전략으로 구성되어 뚜렷한 장점이 있습니다. 2단계 점진적 전략은 AutoDock Vina를 사용하여 화합물 라이브러리의 고처리량 예비 스크리닝을 수행하고, YASARA와의 정밀 재도킹을 통해 고처리량 스크리닝에서 거짓 양성을 제거하고, 이후 YASARA 분자 동역학(MD) 시뮬레이션과 호환되는 단백질-리간드 복합체를 생성하여 소프트웨어 간 포맷 변환으로 인한 구조적 편차를 방지합니다. 1단계 전략은 YASARA만으로 전체 도킹 과정을 완료하여 작업 흐름을 단순화하고 실험 효율성을 높이며 특정 연구 목표에 완전히 적용할 수 있습니다. 검증 단계에서는 표준화된 MD 시뮬레이션이 평균평균근편차(RMSD)와 평균제곱근 변동(RMSF)이라는 핵심 지표를 통해 리간드-단백질 복합체 안정성을 평가합니다. 이 통합되고 재현 가능한 파이프라인은 네트워크 약리학 및 도킹 연구의 신뢰성을 높이고, 계산 신약 발견에서 교차 연구 비교를 용이하게 합니다.

서론

네트워크 약리학은 전체론적 네트워크 관점에서 약물과 유기체 간 상호작용 패턴을 해독하는 연구 접근법을 나타냅니다. 약물-성분-표적-질병-생물학적 경로를 포함하는 상호작용 네트워크를 구축하고 분석함으로써, 약물이 효과를 발휘하는 주요 분자, 핵심 경로, 시너지 메커니즘을 정량적으로 규명합니다. 이 분석 프레임워크는 다중 오믹스 데이터 통합과 위상적 네트워크 분석을 강조하는 국제 네트워크 약리학 표준과 일치하며, 궁극적으로 약물의 전반적인 치료 효과를 명확히 하고, 잠재적 부작용을 예측하며, 신약 개발을 위한 체계적 지침을 제공합니다. 이러한 전략은 COVID-19에 대한 비스테로이드 항염증제(NSAIDs) 표적 단백질과 관련된 신호전달 경로를 해독하고, 골육종과 제2형 당뇨병(2,3,4)과 같은 질병 치료 기전 탐구 등 다양한 분야에서 성공적으로 적용되었습니다. 이러한 이점은 현대 약리학에서 단일 표적에서 다중 표적 신약 발견으로의 패러다임 전환을 이끌고 있습니다.

분자 도킹은 알고리즘 모델링을 사용하여 소분자 화합물과 생물학적 고분자 표적 간의 공간적 호환성과 상호작용 강도를 평가하여 최적의 결합 구성을 예측하는 계산 시뮬레이션 기법입니다. Morris 등은 AutoDock4와 AutoDockTools4를 도입하여 선택적 수용체 유연성을 가진 자동 도킹을 가능하게 합니다; 이 도구들은 분자 역학과 분자 기하학에 기반하며, 분자 간 에너지 차이를 계산하여 결합 안정성과 친화도를 평가합니다. AutoDock과 같은 고전적 도구는 반유연 리간드-수용체 모델링을 사용하며, 이러한 시뮬레이션에서 결합 친화도를 평가하는 금본위가 되었습니다7.

신약 개발에서는 네트워크 약리학 스크리닝 기법이 주요 구성 요소를 식별하는 데 자주 사용되며, 이를 분자 결합을 통해 표적 단백질과의 결합을 평가하여 약물과 질병 간의 관계를 확립합니다. 그러나 현재 응용 분야는 일관성 없는 실험 설계, 비표준화된 운영 절차, 검증 단계의 누락 등의 어려움을 겪고 있습니다. 한약 관련 네트워크 약리학 연구에 대한 체계적 평가는 데이터베이스 간 데이터 이질성과 불충분한 실험 검증이 재현 불가능한 결과를 초래한다는 점을 문서화했습니다. 이러한 한계는 연구 결과의 재현성과 신뢰성을 저해할 뿐만 아니라, 계산 예측을 실험적 검증으로 전환하는 데에도 장애를 줍니다. 실험적 검증이 부족하거나 임의의 매개변수가 있는 단편화된 도킹 워크플로우가 없는 고립된 네트워크 약리학 연구와 달리, 이 프로토콜은 표준화된 임계값과 단계별 연산으로 두 접근법을 통합합니다. 이 프레임워크는 주관적인 매개변수 선택을 없애어, 다양한 운영자가 일관된 결과를 내며 워크플로우를 재현할 수 있도록 보장합니다.

따라서 네트워크 약리학 스크리닝을 통해 잠재적 약물 표적과 경로를 식별하는 표준화된 운영 절차를 확립하고, 분자 도킹을 결합하여 약물-표적 결합 활성을 검증하는 것은 약물 작용 기전 연구와 후보 약물 스크리닝에 실험적 증거를 제공할 수 있습니다.10. 이 프로토콜은 공개된 오믹스, 화학, 단백질 구조 데이터베이스를 이용한 약물 성분 및 합성 소분자의 다중 표적 약물 스크리닝에 특히 적합하며; 결정 구조가 해체되지 않은 표적이나 알려진 질병 관련 상호작용 네트워크가 없는 단일 표적 고아 약물 스크리닝에는 적용되지 않습니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 공개된 데이터베이스의 계산 분석만을 포함하며, 인간 피험자, 척추동물, 생물학적 조직을 사용하지 않습니다. 이 섹션에서 설명된 모든 요약 워크플로우는 그림 1에 나와 있습니다.

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그림 1: 워크플로우 요약. 녹색 직사각형은 대체 약물 성분을, 빨간색 직사각형은 질병을, 노란색 타원은 사용된 웹사이트와 소프트웨어를 나타내고, 주황색 사각형은 획득한 파일이나 데이터와 주요 단계를 나타내며, 보라색 다이아몬드는 최종 요구된 결과를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 약물 성분 및 표적 획득

  1. PubChem 데이터베이스(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 화학 이름을 키워드로 사용하여 해당 SMILES(Simplified Molecular-Input Line-Entry System) 문자열을 검색하세요.
  2. ADMETlab 3.0 웹사이트(https://admetlab3.scbdd.com/)에 접속하여 서비스 탭에서 ADMET 평가 옵션을 선택한 후 SMILES 문자열을 입력한 후 제출 버튼을 클릭하세요.
  3. ADMET 결과를 흡수, 분포, 대사, 배설, 독성, 의약화학, 독성포어 규칙을 기준으로 필터링합니다. 각 지표에 대해 사전에 정의된 모든 임계 기준을 충족하는 화합물만 유지합니다(표 1).
  4. ProTox 3.0 웹사이트(https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)에 접속해 필터링된 화합물의 SMILES 문자열을 입력하고, TOX PREDICTION 모듈을 선택한 후 원하는 모든 예측 옵션(예: 장기 독성, 발암성)을 체크한 후 예측을 실행하세요.
  5. ProTox 3.0 결과를 바탕으로 사전 정의된 안전 임계값을 초과하는 독성 예측 화합물을 선별합니다(표 2).
  6. ADMET와 ProTox 3.0 스크리닝을 모두 통과한 화합물을 구성하여 화합물명, SMILES, 스크리닝 상태를 나타내는 컬럼을 포함한 구조화된 약물 성분 데이터베이스(예: 엑셀 또는 CSV 형식)에 정리합니다.
  7. SwissTargetPrediction 웹사이트(https://swisstargetprediction.ch/)에 접속하고, 생물체 드롭다운 메뉴에서 Homo sapiens 를 선택하고, 약물 성분 데이터베이스의 SMILES 문자열을 입력하고, Predict targets 버튼을 클릭하면 확률 점수가 0인 모든 예측 대상을 수집하세요.
  8. SEA(유사도 앙상블 접근법) 웹사이트(https://sea.bkslab.org/)에 접속하여 위에서 사용된 동일한 SMILES 문자열을 입력하고, 결과를 필터링하여 _Human로 끝나고 p-값이 0.05 미만인 항목만 포함하도록 필터링합니다.
  9. SwissTargetPrediction과 SEA에서 얻은 표적 목록을 단일 약물-작용 표적 라이브러리로 결합합니다. 중복 표적을 제거하고 Uniprot(https://www.uniprot.org/)을 통해 표적 이름을 공식 유전자 심볼(예: HGNC 가이드라인 사용)로 표준화합니다.
    참고: 약물작용 표적 라이브러리는 나중에 사용하기 위해 CSV 파일로 저장할 수 있습니다.

표 1: ADMETlab 3.0 약물 안전성 선별을 위한 임계 기준. 표는 주요 물리화학적 특성, ADME 매개변수, 대사 상호작용, 독성 평가 지표, 독성 경로, 독성 포어 규칙에 대한 권장 컷오프 값과 분류 범위를 요약합니다. 예측은 확률 값(< 0.3, 0.3 - 0.7, > 0.7)이나 정량적 범위를 기반으로 세 가지 위험 수준(낮음, 중간, 높음)으로 분류되어 초기 신약 발견 시 화합물 안전성 프로파일을 체계적으로 평가할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

표 2: 신약 개발에서 독성 예측을 위한 ProTox-3.0 임계 기준. 표는 ProTox 3.0이 예측한 주요 독성 평가 지표를 요약하며, 초기 신약 발견 시 약물 안전성 평가에 중요한 매개변수에 중점을 둡니다. 각 평가 지표는 활성 또는 비활성 이진 분류와 확률 점수(0-1)를 반환하며, 활성화는 잠재적 독성 위험을 나타냅니다. 장기 독성(간독성, 심장독성), 독성 평가점(발암성, 돌연변이성, 면역독성), CYP 대사 억제에 우선순위를 두어야 하며, 이들은 임상 소멸의 주요 원인입니다. 여러 지표 간 활성 효과는 광범위한 독성 잠재력을 시사하며 화합물 우선순위 하하가 정당화됩니다. 급성 독성은 예측된 LD50과 GHS 등급을 통해 평가되며, 클래스 1부터 3(< 300 mg/kg)은 매우 독성이 높은 것으로 간주됩니다. 확률 점수는 각 예측에 대한 신뢰 수준을 제공합니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하세요.

2. 질병 표적 획득

참고: 데이터베이스를 선별할 때는 명명법 차이로 인한 누락을 방지하기 위해 표적 유전자 명명 규칙을 표준화해야 합니다.

  1. 다섯 개의 질병 관련 데이터베이스에 접근하세요: OMIM(https://www.omim.org/), Disgenet(https://disgenet.com/), TTD(https://ttd.idrblab.cn/), GeneCards(https://www.genecards.org/), PharmGkb(https://www.pharmgkb.org/). 다음 데이터베이스별 선별 기준을 적용하세요: GeneCards의 경우, Relevance 점수 1.0≥ 항목을 필터링; DisGeNET의 경우, 대상 질병과 관련된 항목을 선택; PharmGKB의 경우, Gene 옵션을 선택하여 유전자 관련 항목으로 결과를 제한합니다; TTD의 경우, Disease 열이 목표 질환과 일치하는 항목을 유지합니다.
  2. 각 데이터베이스에 대해 표적 질병(예: 알츠하이머병)의 공식 명칭을 검색용으로 사용하여 관련 모든 표적을 검색합니다.
  3. 다섯 개 데이터베이스의 표적 목록을 하나의 스프레드시트로 통합하세요. 목록 간 유전자 기호를 비교하여 중복된 표적을 제거하세요.
  4. 남은 모든 표적 이름을 Uniprot을 통해 공식 유전자 기호로 표준화하여 명명법 불일치를 해결합니다. 표준화된 중복 제거 목록을 질병 표적 라이브러리(CSV 또는 Excel 형식)로 저장하세요.
    참고: 질병 표적 라이브러리는 약물 작용 표적 라이브러리(Step 1.9)와 함께 저장하여 이후 Step 3에서 사용할 수 있습니다.

3. 공통 약물-질병 표적 획득

  1. Venny 2.1.0 웹 도구(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)에 접근하세요. 약물-작용 표적 라이브러리(Step 1.9)와 질병 표적 라이브러리(Step 2.4)를 Venny 2.1.0의 두 입력 필드에 불러와, 두 표적 집합 간의 겹침을 보여주는 벤 다이어그램을 만듭니다.
  2. 벤 다이어그램 결과에서 교차 표적을 추출합니다. 이들을 공통 약물-질병 표적(잠재적 상호작용 지점)으로 라벨링하고 CSV 파일로 저장하세요.

4. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크 구축 및 핵심 표적 분석

  1. STRING 데이터베이스에 접속하세요 (https://cn.string-db.org/). 드롭다운 메뉴에서 Homo sapiens 를 유기체로 선택하세요.
  2. 일반적인 약물-질병 표적(Step 3.2)을 STRING 입력란에 가져오세요. 최소 필요 상호작용 점수 매개변수를 높음(0.700)으로 설정하고 PPI 데이터를 생성하기 위해 검색을 클릭하세요. PPI 데이터를 TSV(탭 분리 값) 파일로 내보내세요.
  3. CytoNCA 플러그인이 미리 설치된 Cytoscape 소프트웨어를 엽니다. 파일 메뉴에서 네트워크 >가져오기 > PPI TSV 파일을 Cytoscape에 가져오세요.
  4. CytoNCA 플러그인을 실행하려면 CytoNCA > Open> 앱을 클릭하세요. 핵심 표적 선별을 위한 다섯 가지 기준 지표를 선택하세요: 간도(Betweenness), 밀도(Closeness), 도수(Degree), 고유벡터(Eigenvector), 그리고 LAC.
    참고: 사용되는 다섯 가지 주요 위상 지표는 다음과 같습니다: 간간성(Betweenness, 네트워크 내 모든 최단 경로에 타겟이 나타나는 빈도를 측정), 근밀성(Closeness Centrality, 타겟에서 네트워크 내 다른 모든 타겟까지의 평균 최단 경로 길이를 반영), 디그리너(Degree, 국소 연결 도, 타겟과 다른 타겟 간 직접 상호작용 수를 정량화), 고유벡터(Eigenvector 중심성, 타겟 자체의 연결성과 연결된 타겟의 중요성을 모두 가중치), LAC(국소 평균 연결성, 타겟의 직접 인접 노드 간 연결 밀도 평가).
  5. 네트워크 분석을 시작하려면 도구 > 네트워크 분석 메뉴를 클릭한 후 확인 버튼을 클릭하세요. 분석 결과를 CSV 테이블로 내보내세요.
  6. 다섯 가지 지표의 중앙값을 계산하고, 중앙값을 충족하거나 초과하는 목표를 유지하세요. 4.5단계를 여러 번 반복하여 10개에서 20개의 목표가 남을 때까지 반복합니다.
  7. 나머지 타겟을 Degree 지표(높음부터 낮음)로 순위를 매기고, 예비적으로 상위 10개 타겟을 핵심 유전자로 선정하세요. 핵심 유전자 목록을 CSV 형식으로 저장하세요.
    1. 거짓 양성을 줄이고 구조적으로 적합한 표적만 도킹에 성공하도록 하기 위해, 구조적 타당성과 약물 가능성에 대한 추가 평가를 수행하세요: PDB 데이터베이스에서 고해상도 결정 구조(≤ 2.5 Å)를 확인하거나 신뢰할 수 있는 상동 모델 구축 가능 여부를 평가합니다; 적절한 결합 부위의 존재를 확인하기 위해 포켓 예측 도구를 사용하고; 문헌 또는 기능 데이터베이스와 교차 조회하여 질병 경로에 대한 문서화된 관련성을 검증합니다.
    2. 구조적 가용성, 약물 사용 가능한 주머니, 질병 관련성이 없는 표적은 도킹 연구에 우선순위를 낮춥니다. GO 및 KEGG 농축 분석은 구조 정보가 필요 없으므로 이 단계의 전체 핵심 표적 목록을 사용하여 수행할 수 있습니다.
      참고: 4.6단계와 4.7단계의 유전자 수는 필요에 따라 변경할 수 있습니다. 일반적으로 4.6단계 이후에는 10개에서 20개의 목표가 남아 있으며, 4.7단계에서 최소 10개의 핵심 유전자를 유지하는 것이 신뢰할 수 있는 GO 및 KEGG 농도 분석과 일관된 시각화 추세를 위해 충분한 데이터 양을 확보하는 것이 권장됩니다.

5. GO와 KEGG 농축 분석 및 시각화

참고: 이 부분은 세포 구성 요소, 기능적 및 세포 내 경로 수준에서의 유전자 기능을 명확히 합니다.

  1. DAVID 웹 도구(https://davidbioinformatics.nih.gov/home.jsp)에 접근하세요. 입력 유형으로 유전자 목록을 선택하고 핵심 유전자를 입력 필드로 불러옵니다.
  2. 식별자를 OFFICIAL_GENE_SYMBOL으로 설정하고 '종 선택'에서 호모 사피엔스 를 선택하세요. 그 다음 ' 목록 제출' 을 클릭하여 핵심 유전자를 업로드하세요.
  3. GO 농축 분석에서는 GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT, GOTERM_MF_DIRECT 범주를 선택하세요.
  4. KEGG 농축 분석을 위해 KEGG_PATHWAY 범주를 선택하세요. GO와 KEGG 분석 모두에서 유의의 임계값을 p < 0.05로 설정하세요.
  5. 기능 주석 차트를 클릭하면 풍부화 결과를 생성할 수 있습니다. GO와 KEGG 결과를 CSV 파일 형식으로 내보내세요. R Studio 소프트웨어를 ggplot2와 함께 사용해 상위 10개의 풍부 용어/경로에 대해 막대 차트나 버블 플롯을 만듭니다.
    참고: 표시되는 용어/경로 수는 요구사항에 따라 조정할 수 있습니다.

6. Autodock Vina를 이용한 분자 도킹

참고: 6단계와 7단계는 모두 분자 도킹 단계입니다. 6단계는 AutoDock Vina 1.1.2 소프트웨어를 사용하며, 7단계는 YASARA 10.3.16을 사용합니다. YASARA를 사용하면 이후 YASARA 분자 역학 시뮬레이션이 용이해집니다. AutoDock Vina의 도킹 결과가 필요하다면, YASARA의 도킹 결과는 AutoDock Vina와 일치해야 합니다. 이는 소프트웨어 전환으로 인한 불일치를 방지하고, 분자 역학 시뮬레이션 검증 결과의 신뢰성을 보장하며, 자세한 방법을 사용합니다: LigPlot+(버전 2.3)로 Step 6.31의 "result.pdb" 결과를 열어 2D 상호작용 다이어그램을 생성하고, 리간드와 상호작용하는 키 잔기들을 식별한 후 YASARA 도킹 단계 7.18에서 키 잔기를 선택하고, 박스 크기를 결합 포켓을 덮도록 설정하여 Vina와 YASARA 간 도킹 부위의 일관성을 극대화합니다. 이후 Step 7.19에서 최적의 도킹 결과를 선택할 때, 리간드와 수용체 간의 주요 상호작용 잔기가 AutoDock Vina 결과에서 식별된 것과 일치하도록 보장합니다. 이 일관성 요구사항은 정확한 원자 대응보다는 필수 상호작용 패턴의 보존에 중점을 둡니다; 힘장 매개변수화와 사이드체인 유연성의 차이로 인해 주변 잔기체 구조에 약간의 변동이 예상됩니다. 주요 활성 부위 잔류물과의 중요한 상호작용이 보존되어 있다면, 도킹 결과는 교차 검증 목적에서 일관된 것으로 간주될 수 있습니다. AutoDock Vina 도킹(Step 6)이 필요하지 않은 경우, Step 7을 직접 수행할 수 있습니다.

  1. PubChem 데이터베이스에서 해당 SMILES 문자열을 검색하여 ligand.sdf라는 약물 화합물의 SDF(구조 데이터 파일)를 얻으세요(Step 1.1).
  2. Chem3D 소프트웨어를 사용해 SDF 파일을 엽니다. 계산 옵션에서 MM2 를 선택하고 에너지 최소화 를 클릭하여 화합물 구조의 자유 에너지 최소화를 수행합니다.
  3. 최소화된 구조를 선택 파일 > 다른 이름으로 저장하여 리간드.mol2 파일로 저장하세요. RCSB PDB 데이터베이스에서 receptor.pdb라는 이름의 핵심 유전자의 단백질 수용체에 대한 PDB(단백질 데이터 뱅크) 형식을 얻으세요(https://www.rcsb.org/; PDB ID 또는 유전자명으로 검색 가능).
    1. 해상도가 2.5 Å≤ 구조와 가능하다면 해소된 결합 부위를 우선순위로 지정하세요. 구조를 선택할 때는 항목의 완전성(예: 모든 예상 도메인 존재, 큰 미해결 루프 부재), 리간드 결합에 영향을 줄 수 있는 돌연변이, 기능적으로 중요한 보조인자(예: 헴, 금속 이온) 또는 공결정 리간드가 포함되는지 여부를 검토합니다.
    2. 알려진 올리고머 조립체를 가진 표적의 경우, 단량체 형태가 연구 질문에 적합한지 고려하세요; 이량체 또는 고차 상호작용이 관련되면 생물학적 조립체를 다운로드할 수 있습니다. 선택한 구조는 이후 단계에서 추가 준비를 거치므로, 초기 검사가 후속 문제를 피하는 데 도움이 됩니다.
  4. PyMOL 소프트웨어를 사용해 receptor.pdb를 엽니다. 명령줄에서 remove organic을 입력하고 Enter 버튼을 눌러 단백질 구조에서 소분자 리간드를 제거합니다.
    참고: 결합 부위를 정의하기 위해 공동결정화된 리간드를 사용할 경우, 먼저 리간드의 3D 중심 좌표를 기록한 후 PyMOL 명령줄에서 remove organic 입력을 입력하고 Enter 키를 눌러 공동 결정화된 소분자를 삭제합니다; 그렇지 않으면 직접 remove organic 명령을 실행하여 공동결정화된 소분자를 제거합니다.
  5. 명령줄에서 'remove solvent'를 입력하고 Enter 키를 눌러 단백질 구조에서 자유수 분자를 제거합니다; 명령어 선택 metal_cofactor인 resn [표적 보조인자 잔기명]을 사용하여 기능적으로 중요한 금속 이온 또는 보조인자(예: HEM, Zn2⁺, Mg2⁺)를 식별하고 구조 내 보존을 확인합니다.
  6. PyMOL에서 정리된 수용체를 파일 > '분자 내보내기' 저장 > 클릭하여 receptor_clean.pdb로 내보내세요.
  7. UCSF Chimera 1.19에서 receptor_clean.pdb를 엽니다. Tools > Sequence > Sequence 를 클릭하여 바인딩 부위 인접한 누락된 루프를 검사하세요(누락된 영역은 빨간 윤곽선 박스로 표시됩니다). 누락된 루프가 있으면 시퀀스 창 메뉴에서 Structure > Modeller(루프/정제) 를 선택하고 비 터미널 누락 구조를 선택하고, 적절한 모델 수(예: 5개)를 설정한 후 계산을 진행합니다. 완료 후 가장 합리적인 모델을 선택합니다.
  8. 키메라에서 구조를 최적화합니다. 선택한 잔기에 대해 Rotamers 도구(던브랙 라이브러리)를 사용하여 측쇄를 최적화하고, 평가를 위해 컬럼 메뉴를 통해 충돌과 H-결합을 추가하여 충돌이 최소화(0 - 1 선호됨)와 유리한 H-결합을 가진 구조를 선택합니다. 그 후 수소를 첨가하고 Dock Prep(AMBER ff14SB)를 사용해 전하를 할당합니다. 마지막으로, Minimize Structure 도구로 에너지 최소화를 수행하며, 골격 원자를 선택(sel @ca, c, n, o)으로 고정하고, 선택을 반전하여 고정 원자를 활성화합니다. File > Save PDB를 선택하여 처리된 구조를 receptor_optimized.pdb로 저장합니다.
    참고: 잘 정렬된 잔기의 사이드체인 최적화는 건너뛰세요. 도크 프렙은 프로톤화를 자동으로 처리합니다. 최소화는 백본이 고정된 상태에서 수행해야 합니다.
  9. PyMOL에서 receptor_optimized.pdb를 다시 열고 정준 결합 부위를 정의합니다. 공동결화된 리간드가 있다면, 그 좌표를 사용해 그리드를 중앙에 위치시키고, 리간드 중심을 기록한 후 유기물 제거로 제거하세요. 공동결정 리간드가 없으면, 문헌에서 알려진 주요 잔기(예: 선택 binding_site, resi XXX-XXX)를 기반으로 결합 부위를 정의하거나, 포켓 예측 도구를 사용해 시각적 평가를 검증하기 위해 추정되는 결합 포켓을 시각적으로 식별합니다. 그리드 박스 구성을 위해 정의된 부위의 3D 중심 좌표(x/y/z)를 기록하세요.
    참고: 여기에 기록된 좌표는 AutoDock Vina 그리드의 중심을 맞추는 데 사용됩니다. 잔기 기반 정의를 위해서는 선택된 잔기의 기하학적 중심을 계산해야 하며; 시각적 또는 예측 도구로 식별된 포켓의 경우, 공동의 중심을 사용합니다. 결합 부위를 정의할 때는 의도한 도킹 전략이 직립(활성) 부위를 목표로 하는지 아니면 알로스테릭 부위를 목표로 하는지 고려해야 합니다. 정조 타겟팅의 경우, 결합 부위는 문헌에서 보고된 공형성 리간드 또는 보존된 활성 부위 잔기들을 기준으로 정의되어야 합니다. 알로스테릭 타겟팅의 경우, 특히 알려진 알로스테릭 조절을 가진 표적에 대해 포켓 예측 도구를 사용하여 잠재적인 알로스테릭 부위를 식별할 수 있습니다. 사전 정보가 없는 경우, 전역 도킹과 예측된 결합 핫스팟의 클러스터링을 통해 잠재적인 알로스테릭 부위 식별에 도움이 될 수 있습니다. 이러한 유연성 덕분에 프로토콜은 교정 및 알로스테릭 신약 개발 캠페인 모두를 수용할 수 있습니다.
  10. PyMOL에서 파일( File > Export Molecule > 저장)을 클릭하여 receptor.pdb로 최종 최적화된 구조를 내보내세요.
  11. AutoDock Tools 4.2.6에서 'File > 읽기 분자를 클릭하여 receptor.pdb를 엽니다. 유연한 잔기(flex residues)를 정의하세요. 유연한 잔기(Flexible Residues) > 편집 클릭> 잔기(residues)를 선택 하고, 리간드 결합 시 구조 변화가 예상되는 결합 부위 잔기(10개 잔기)를 선택하세요(10개의 잔기≤ 선택).
    참고: 이 단계는 도킹 중에 선택된 사이드 체인이 움직일 수 있게 하여 유도된 적합 효과를 고려할 수 있게 합니다.
  12. 유연한 잔기와 함께 수용체를 PDB 파일로 저장하세요. 파일 > 저장을 클릭하고, 드롭다운 메뉴에서 PDB 작성 을 선택하세요. Available PDB 기록 창에서 ATOM과 CONECT를 체크하고, ADD를 클릭한 후 확인을 클릭하세요. 파일을 receptor.pdb로 저장하세요.
    참고: 이 PDB 파일은 유연 잔기에 관한 정보를 포함하고 있으며, PDBQT 파일을 생성하는 데 사용됩니다.
  13. 대분자를 도킹 준비하세요. Grid > Macromolecule > Choose를 클릭하고, receptor.pdb 파일을 선택한 후 Select Molecule을 클릭하세요. File > Save As 버튼을 클릭해 수용체를 PDBQT 파일로 저장하고 receptor.pdbqt로 이름을 설정하세요.
    참고: AutoDock 도구는 전하와 원자 유형을 할당하여 수신기를 AutoDock의 기본 PDBQT 형식으로 저장하여 그리드 박스 생성 및 도킹 계산에 사용할 수 있도록 합니다.
  14. 리간드 메뉴를 클릭하고 입력을 선택한 후 열기를 클릭하세요. 리간드.mol2를 선택하고 확인 버튼을 클릭하세요. 리간드 메뉴를 클릭하고 토션을 선택한 후 토션 감지를 클릭하세요. AutoDock 도구는 리간드 구조 내에서 회전 가능한 결합(예: 알킬 사슬의 단일 결합, 펩타이드 결합을 제외한 아마이드 결합)을 자동으로 식별합니다.
  15. 토션 선택 창에서 검출된 회전 가능한 결합을 검증합니다(유효한 회전 가능한 결합은 모두 유지하고, 방향족 고리 결합과 같은 강체 결합은 제외). 비틀림 정의를 확인하려면 설정을 클릭한 후 닫기를 클릭하세요.
    참고: 유효한 회전 결합을 유지하면 리간드가 도킹 중에 다양한 구조(유연한 리간드)를 채택할 수 있으면서도 수용체는 강하게 유지됩니다 — 이것이 AutoDock Vina에서 반유연 도킹의 핵심입니다.
  16. 다시 Ligand 메뉴를 클릭하고, Output을 선택한 후 Save as PDBQT를 클릭하세요. 파일 이름을 ligand.pdbqt로 지정하고 receptor.pdbqt와 같은 디렉터리에 저장하세요.
  17. 디스플레이 메뉴를 클릭하고, 2차 구조를 선택하세요. 디스플레이 전용을 클릭한 후 라인을 선택한 후 언디스플레이를 눌러 단백질 뷰를 단순화하세요.
  18. 그리드 메뉴를 클릭하고 그리드 박스를 선택하세요. x, y, z(중심 좌표)와 간격(Å) 값을 조정하여 박스를 단백질의 활성 부위 위에 위치시키세요.
    참고: 결합 부위가 알려지지 않은 경우, CASTp, DoGSite와 같은 포켓 예측 도구를 사용하여 추정되는 결합 포켓을 식별하십시오. 단백질 전체를 덮으면 오탐과 계산 비용이 크게 증가하므로 권장되지 않습니다.
  19. 파일 > 닫기, 현재 저장을 클릭한 후, 그리드 > 출력> GPF 저장을 눌러 그리드 박스 설정을 Grid.gpf로 저장하세요.
  20. 텍스트 편집기로 Grid.gpf를 열고 그리드센터(x, y, z 값)와 npts(크기 x, y, z 값)를 파일에 기록하세요.
  21. Config.txt라는 이름의 새 텍스트 파일을 만들고 다음 내용을 입력하세요:
    수용체 = 수용자.pdbqt
    리간드 = 리간드.pdbqt
    center_x = [그리드센터 x Grid.gpf의 값]
    center_y = [Grid.gpf에서 얻은 그리드센터 y 값]
    center_z = [Grid.gpf의 gridcentre z 값]
    size_x = [npts x Grid.gpf 값]
    size_y = [Grid.gpf에서 npts y 값]
    size_z = [Grid.gpf에서 npts z 값]
    energy_range = 5
    num_modes = 10
    괄호 안의 텍스트를 Grid.gpf 값으로 대체하세요 (Step 6.19).
    참고: energy_range 매개변수는 최적 결합 모델에 대한 최대 허용 에너지 차이로 설정해야 하며, 단위는 kcal/mol로 해야 합니다. 예를 들어, 5로 설정하면 AutoDock Vina는 최적 모델과의 에너지 차이가 5 kcal/mol에 도달하면 계산을 종료합니다. 또한 num_modes는 생성할 바인딩 모델 수를 지정하는데, 보통 10으로 설정됩니다.
  22. vina_split.exe와 vina.exe 파일을 receptor.pdbqt, ligand.pdbqt, Config.txt와 같은 디렉터리에 배치하세요.
  23. 윈도우 시스템 콘솔을 열고 cd 명령어(예: cd C:\DockingFiles)를 사용해 디렉터리로 이동하세요.
  24. 다음 명령을 입력하고 Enter를 누르세요: vina.exe --config config.txt --log log.txt --out output.pdbqt
  25. 도킹이 완료될 때까지 기다립니다(지속 시간은 시스템마다 다름). 두 개의 파일이 나타납니다: log.txt(도킹 결과)와 output.pdbqt(최저 에너지 리간드 구조). 재현성을 보장하기 위해 서로 다른 무작위 시드로 세 번의 독립적인 도킹 실행이 수행됩니다. 상위 포즈에서 RMSD < 1.0 Å는 일관성을 확인시켜 줍니다.
    참고: 경험적 참고로, AutoDock Vina 결합 에너지(kcal/mol)는 다음과 같이 해석할 수 있습니다: ≤ -7 (높은 친화도, 잠재적 활성 구조), -7에서 -5 (중간 친화도), ≥ -5 (낮은 친화도). 이 임계값은 시스템에 따라 다르며 실험 데이터로 검증되어야 합니다.
    1. 특정 표적에 대한 도킹 정확도와 구별 능력을 평가하기 위해 두 가지 상호 보완적인 검증 접근법이 권장됩니다. 결정학적 리간드를 이용한 재도킹 검증을 사용하여 프로토콜이 실험적으로 관찰된 결합 모드를 재현할 수 있는지 평가하며, RMSD < 2.0 Å를 표준 수용 기준으로 사용합니다.
    2. 공개 벤치마크 데이터셋(예: DUD-E)을 활용한 농축 분석을 사용하여 프로토콜이 진정한 활성 화합물과 속성 일치 미끼를 구별하는 능력을 평가합니다; 여기에는 ROC 곡선(분류 성능을 전반적으로 측정하는 지표)과 EF1%와 같은 농축 계수 계산(상위 분획의 활성 농축 정량화)이 포함됩니다. 이러한 검증 단계들은 적절한 친화도 기준을 설정하고 관심 대상 군에 대한 신뢰할 수 있는 스크리닝 성능을 보장하는 데 도움을 줍니다.
  26. PyMOL 소프트웨어를 열어. 파일 > 열기(File Open)를 클릭하여 output.pdbqt와 receptor.pdbqt를 불러와. 파일 > 함께 저장하여 결합된 구조를 result.pdb로 저장하세요.
  27. PyMOL 작업 공간을 ' 새 세션' > 클릭하여 정리한 후 result.pdb를 다시 열어 리간드-단백질 복합체를 시각화하세요.

7. YASARA를 이용한 분자 도킹

참고: 이 단계는 이후 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 위한 정확한 재도킹 및 전처리 역할을 하며, 6단계의 고처리량 예비 스크리닝 결과를 점진적으로 검증하는 과정입니다. 6단계는 고처리량 가상 스크리닝의 골드 스탠다드 도구인 AutoDock Vina를 사용하여 화합물 라이브러리에서 우수한 결합 친화도를 가진 후보 분자를 신속히 스크리닝합니다. 이 단계는 도킹에 YASARA를 채택하는데, 도킹 모듈은 YASARA MD 시뮬레이션 플랫폼과 완벽히 호환되어 파일 형식 변환 및 소프트웨어 전환으로 인한 구조적 편차를 피하고 이후 MD 시뮬레이션을 위한 표준화된 초기 복합 구조를 제공합니다. 6단계에서 AutoDock Vina가 스크리닝한 모든 후보 분자에 대해, 이 단계에서 얻은 도킹 결과(활성 주머니에서의 결합 자세 및 주요 아미노산 상호작용 포함)는 AutoDock Vina의 결과와 일치해야 하며, 결합 친화도의 상대적 순위도 MD 시뮬레이션으로 넘어가기 전에 동일한 추세를 유지해야 합니다. 절대 도킹 점수는 계산 알고리즘 차이로 인해 두 소프트웨어 간에 직접 비교할 수 없습니다. 이러한 일관성 요구사항은 소프트웨어 차이로 인한 오탐 결과를 제거하고, 후보 분자의 결합 특성 안정성을 보장하며, 이후 MD 시뮬레이션 검증의 신뢰성과 논리적 연속성을 보장합니다.

  1. OpenBabel을 이용해 ligand.sdf 파일을 ligand.pdb 파일로 변환하세요.
    참고: OpenBabel은 여기서 형식 변환에만 사용됩니다. 분자 역학을 위한 리간드의 실제 매개변수화는 이후 단계에서 YASARA에 의해 자동으로 수행됩니다.
  2. YASARA 소프트웨어를 실행하세요. 파일 > 로드 를 클릭하고 리간드를 가져오기 위해 ligand.pdb 를 선택하세요. 리간드의 구조적 결함을 제거하려면 Edit > Clean > All을 클릭하세요.
    참고: 이 단계는 기본적인 기하학적 정리를 수행합니다. YASARA는 내장 AutoSMILES 기술을 사용하여 리간드에 힘장 매개변수를 자동으로 할당하며, 일반 AMBER 힘장(GAFF)과 AM1-BCC 전하를 적용하여 단백질에 사용되는 AMBER14 힘장과의 호환성을 보장합니다. 이 매개변수화는 도킹과 MD 시뮬레이션 모두에서 정확한 에너지 계산에 필수적입니다.
  3. 기본 pH> 옵션을 클릭하고 적절한 pH(예: 생리학적 조건은 7.4)를 선택한 후 확인을 클릭하세요.
  4. 도 킹 힘장> 클릭하여 도킹 힘장을 설정하여 이후 MD 시뮬레이션과의 매개변수 일관성을 보장합니다.
    참고: AMBER14 단백질 매개변수 커버리지를 제공하고 표준 MD 시뮬레이션 프로토콜과 완전 호환되기 때문에 YASARA 10.3.16에서 이 신약 개발 워크플로우에 권장되는 힘장입니다. 표준 단백질 잔기의 경우, 힘장의 내장 템플릿에서 매개변수가 자동으로 할당됩니다. 소분자 리간드의 경우, YASARA는 내장 AutoSMILES 기술을 사용하여 자동으로 매개변수화를 수행하며, 이 기술은 GAFF(일반 AMBER 힘장) 원자 유형과 AM1-BCC 전하를 할당합니다. 이로 인해 단백질과 리간드 매개변수 간의 호환성이 보장되어, 도킹과 MD 시뮬레이션 모두에서 정확한 에너지 계산이 가능합니다. 실제 사용된 YASARA 버전과 시스템의 구체적 특성에 따라 더 적합한 힘장을 선택할 수 있습니다.
  5. 시뮬레이터 > 모든 원자를 중심으로 시뮬레이션 셀 >을 정의 하여 작업 경계를 설정하세요. 주기적 경계 조건을 가능하게 하기 위해 시뮬레이터> 셀 경계> 주기를 클릭하세요.
  6. 옵션 > 에너지 최소화 > 실험 선택 후 Run을 클릭해 리간드의 에너지를 최소화하세요.
  7. 파일 > 저장 지점을 클릭하고, 파일 이름을 ligand.pdb로 지정한 뒤, 확인을 눌러 원본 리간드 PDB 파일을 덮어쓰세요. 파일 > 새 파일을 눌러 작업 공간을 지우고, 파일 > 로드를 클릭한 후 receptor.pdb 파일을 선택하세요.
  8. 단백질 수용체에 대해 7.2부터 7.7까지 단계를 반복하며, 처리된 파일을 새로운 receptor.pdb 파일로 저장합니다.
  9. 파일 > 새로 찾은 후 파일 > 로드를 클릭한 후 ligand.pdb와 receptor.pdb를 모두 선택하세요. 7.3부터 7.5까지 단계를 반복하여 pH를 설정하고, 시뮬레이션 셀을 정의하며, 복합체의 주기적 경계를 활성화하세요.
  10. 프로세서 > CPU 설정 버튼을 클릭하고 사용할 CPU 코어 수를 선택하세요. 프로세서 > GPU 설정 버튼을 클릭해 계산 가속을 위해 GPU 장치를 선택하세요.
  11. 파일 > YASARA 씬> 저장 버튼을 클릭하고, 파일 이름 sce\nesult.sce(존재하지 않으면 SCE 폴더를 생성함)한 뒤 확인 버튼을 누르세요.
  12. 매크로&무비 > 옵션을 클릭> 타겟 설정, sce\nesult.sce를 선택한 후 확인(OK)을 클릭하세요. 매크로> Macro&Movie > 재생 매크로를 클릭하고, dock_run.mcr 매크로 파일을 선택한 후 확인(OK)을 클릭하세요.
  13. 시 뮬레이터 > 선택한 원자 주위에 시뮬레이션 셀 정의 > 7.5를 반복한 후 계속 을 클릭해 도킹을 시작하세요.
  14. 도킹 완료를 기다려라. yob 접미사가 붙은 파일이 생성될 것이다; name.log 결합 에너지와 접촉 수용체 잔기(Contacting Residues)를 포함한다.
    참고: 분자 역학 시뮬레이션 검증의 합리성을 보장하기 위해, YASARA에서 AutoDock Vina의 도킹 결과와 일치하는 도킹 결과를 선택하십시오.

8. 분자 역학 시뮬레이션

  1. 파일 > 새로 시작을 클릭하여 작업 공간을 비우세요. 그 다음 파일 > YASARA 객체 로드> 클릭하고 result.yob를 선택하세요.
  2. SCENE CONTENT 패널(오른쪽)에서 모든 Mol 항목을 펼칩니다. Split > Object > Edit를 클릭하고, Sequence 패널에서 모든 Mol 콘텐츠를 선택한 후 확인(OK)을 클릭하세요.
  3. Edit > Join > Object를 클릭하고, 첫 번째와 마지막 항목(리간드)을 제외한 모든 Mol 성분을 선택한 후 확인(OK)을 클릭하세요. 첫 번째 Mol 항목을 선택한 후 다시 확인(OK)을 눌러 단백질을 다시 연결하세요.
  4. 성분 번호를 재번호 매기기로 진행하세요. 편집 아래에서 재번호 를 선택하고 객체를 클릭하세요. 이 과정에서 두 부분이 생성됩니다: 첫 번째는 단백질-수용체 복합체이고, 두 번째는 소분자 리간드입니다.
  5. 전송 > 편집을 클릭한 후 드롭다운 목록에서 객체 옵션을 클릭하세요. 서열 패널에서 먼저 해당 항목을 클릭하여 소분자 리간드 성분을 선택하세요. 그 다음 단백질 수용체 항목을 클릭해 선택한 후 확인 버튼을 눌러 선택 쌍을 확인하세요.
  6. 다음 팝업 창에서 전송 중 화면에 원자 수정으로 시작하는 옵션을 선택하고 확인을 클릭하세요.
  7. 7.2부터 7.5까지 단계를 반복한 후, Simulator > Temperature 를 클릭한 후 298K를 선택하세요. 파일 > YASARA 씬> 저장 버튼을 클릭하고, 파일 이름 sce\nesultrun.sce를 선택한 후 확인을 클릭하세요.
  8. 작업 공간 > 새 파일을 클릭하세요. 그 다음 매크로&무비 > 옵션 > 타겟 설정, sce\nesultrun.sce를 선택한 후 확인 버튼을 누르세요.
  9. 7.4단계에서 선택한 힘장이 MD 시뮬레이션에도 사용되는지 확인하세요; md_run.mcr 매크로는 일반적으로 현재 힘장 설정을 계승합니다. 매 크로&무비 > 재생 매크로> 옵션을 클릭한 후 md_run.mcr 매크로 파일을 선택한 후 확인 을 클릭하여 분자 역학 시뮬레이션을 시작합니다.
  10. 단백질-리간드 복합체에 대해 서로 다른 초기 속도로 세 개의 독립적인 MD 시뮬레이션(3 x 100 ns)을 수행하고, 결과의 신뢰성을 보장하기 위해 세 경로에 대한 통계적 분석을 수행합니다. 작업 중에 시뮬레이션 형식의 파일이 생성됩니다. 예를 들어, 경로가 100 ps마다 저장된다면, 100 ns 시뮬레이션에서는 sim 접미사가 붙은 1000개의 파일이 생성됩니다.
  11. 8.10 단계가 완료되면 매 크로&무비 > 옵션 > 타겟 설정, sce\nesultrun.sce 파일을 선택한 후 확인 버튼을 누르세요.
  12. 매크로&무비 > 재생 매크로> 옵션을 클릭한 후 md_analyze.mcr, md_analyzebindenergy.mcr, md_analyzeres.mcr을 선택한 후 확인 버튼을 누르세요.
  13. 세 가지 분석이 모두 완료된 후에는 해당 데이터 파일 result_run_analysis.tab, result_run_bindenergy.tab, result_run_analysisres.tab이 생성됩니다.
  14. 먼저, 10개의 핵심 매개변수를 제공하는 result_run_analysis.tab을 분석합니다: 에너지(전체 시스템 에너지), 본드(결합 에너지), 각도(결합 각도 에너지), 이면체(이면체 각도 에너지), 평면성(평면 에너지), 쿨롱(정전기 에너지), VdW(반데르발스 에너지), CA(단백질 RMSD의 Cα RMSD), 백본(단백질 백본 RMSD), 그리고 헤비원자(중원자 RMSD).
  15. 시간(ns) 열과 해당 매개변수 열을 추출하여 시스템이 에너지 평형에 도달하는지 평가합니다. 초기 10-20 ns의 좁은 변동 범위 내에서 위치 에너지를 안정화하여 시스템 안정성을 확인합니다. Cα 원자, 단백질 골격, 무거운 원자의 평균평균근편차(RMSD)를 모니터링하여 구조 안정성을 평가합니다. 이 RMSD 값들이 정체기에 도달하자 시뮬레이션은 구조적으로 안정된 것으로 간주되었습니다.
  16. 전형적인 크기의 단백질-리간드 복합체에 대한 경험적 기준점으로서, Cα와 2.5 Å 이하의 골격 RMSD 값이 정체된 것, 그리고 3.5 Å 이하의 무거운 원자 RMSD는 구조 안정성을 지지하는 지표로 간주될 수 있습니다. 중요한 것은, 이 수치값에만 엄격히 따르기보다는 RMSD 궤적에서 명확한 정체 단계가 존재하는 주요 기준과 필수 기준을 사용하는 것입니다.
    참고: 이 임계값은 경험적 결과이므로 특정 단백질 크기와 유연성의 맥락에서 해석되어야 합니다. 수렴의 결정적 지표는 지속적인 정체기로, 구조가 일관된 구조 집합체를 중심으로 안정화되었음을 나타냅니다.
  17. 다음으로, 시뮬레이션 궤적에 따라 리간드와 표적 간의 결합 에너지를 제공하는 result_run_bindenergy.tab을 분석합니다. 전체 시뮬레이션 기간 동안 평균 결합 에너지를 계산합니다. YASARA의 MM-PBSA 구현에서는 양수일수록 결합이 더 강함을 나타냅니다. 중간 강도이자 안정적인 상호작용은 일반적으로 평균 결합 에너지가 양수이고 충분히 크며(특정 수치값은 시스템 의존적이지만 알려진 결합제나 실험 데이터에 대비한 보정 가능), 표준 편차가 평균에 비해 작음(예: <변동계수가 50 - 60%)으로 표시되며, 이는 시뮬레이션 중 제한된 변동을 반영합니다.
    참고: 이 단계에서 보고된 결합 에너지는 엄격한 MM-PBSA 방법을 사용하여 계산되며, 기본 YASARA 결합 에너지 매크로는 더 빠른 근사(BoundaryFast)를 사용합니다. 기본 근사는 빠른 스크리닝이나 상대 비교에 적합하며, MM-PBSA 방법은 더 정확한 절대 결합 자유 에너지를 얻는 데 권장됩니다. 저자가 YASARA 매크로 헤더에서 명시적으로 밝힌 대로: 양의 에너지가 많을수록 결합이 더 좋다는 의미이고, 음의 에너지는 결합이 없음을 의미하지 않습니다. 따라서 사용자는 양수 값을 더 강한 결합을 나타내며, 수치 크기는 특정 단백질-리간드 시스템에 따라 다르다고 해석해야 합니다.
  18. 마지막으로, result_run_analysisres.tab 파일을 분석하는데, 이 파일은 잔기 ID, RMSD, 백본 RMSD, 헤비원소 RMSD, RMSF 등 잔기별 데이터를 제공합니다. 분석은 확인된 안정 생산 단계에 집중합니다. 먼저, 표적 활성 부위 내 잔기(예: 리간드 5 Å 이내)를 식별합니다. 그 다음 시뮬레이션 중 개별 활성 부위 잔기의 구조 안정성을 평가합니다.
    참고: 단백질-리간드 복합체 내 안정 활성 부위 잔기의 경험적 기준점으로서, RMSF 값이 1.0 Å 미만이고 안정상 동안 RMSD 변동이 1 - 1.5 Å 이내인 경우 일반적으로 국소 구조가 잘 유지되고 있음을 나타냅니다. RMSF가 2.0 Å를 초과하는 잔기는 더 큰 유연성을 나타낼 수 있습니다; 이러한 잔기는 기능적으로 관련 있는 유연한 영역(예: 루프 또는 표면적)에 해당하는지, 아니면 결합 주머니 내 잠재적 불안정성을 나타내는지 판단하기 위해 3차원 구조에 매핑되어야 합니다. 이 수치 지침은 절대적인 규칙이 아닙니다; 주요 기준은 큰 구조 드리프트의 부재이며, 이는 전체 시스템 수렴과 함께 평가되어야 합니다.
  19. 데이터 파일이 정리되면, 정리된 데이터를 Prism에 불러와 해당 플롯을 생성합니다.

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결과

로라타딘의 알레르기성 비염(AR)에 대한 네트워크 약리학 분석 이후, 로라타딘과 PTGS2 간의 상호작용이 분자 도킹 및 MD 시뮬레이션 프로토콜의 단계별 적용을 보여주는 대표적인 사례 연구로 선정되었습니다. 이 예시는 특정 상호작용의 생물학적 검증을 제공하기보다는 워크플로우 실행 및 데이터 해석을 시연하기 위한 것입니다. 실험 데이터에 대한 정량적 평가를 위해, 사용자는 공개 데이터베이스에 알려진 결합 친화도를 가진 잘 특성화된 시스템에 프로토콜을 적용할 것을 권장합니다.

목표 식별 및 중복 분석
총 127개의 로라타딘 관련 표적이 공개 데이터베이스에서 획득되었습니다. AR 관련 표적은 여러 질병 데이터베이스에서 수집되어 2,620개의 표적을 얻었습니다. 벤 다이어그램(그림 2)에서 보듯, 로라타딘과 알레르기성 비염 사이에 겹치는...

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토론

의의 및 중요한 단계
이 프로토콜은 네트워크 약리학, 분자 도킹, 분자 동역학 시뮬레이션을 결합하여 독립적인 방법이나 이중 조합 워크플로우에 비해 뚜렷한 장점을 제공하며, 현재 신약 발견의 주요 비효율성과 신뢰성 격차를 해결하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 전체 과정은 신뢰성을 보장하는 세 가지 핵심 단계에 의존하며, 각각 계산 약물 스크리닝의 핵심 과제를 해결합니다. 첫째, 다중 데이터베이스 통합(예: 소분자 구조용 PubChem, 질병 표적용 5개 데이터베이스, 생물학적 메커니즘 및 경로 주석을 위한 GO 및 KEGG) 및 ADMET 속성 필터링은 단일 데이터베이스 의존의 편향을 피하여 생체 내 잠재력 진보를 가진 구성 요소만 보장합니다4. 둘째, 여러 지표(간도, 근접성, 정도, 고유벡터, LAC)를 이용한 구성 요소-표적-질병 네트워크의 위상학적 분석은 치료 관련성이 최소한인 말초 표...

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공개 사항

모든 저자는 이해 충돌이 없다고 선언합니다.

감사의 글

중국 국가 중계 중계 연구개발 프로그램(2024YFC3506300, 2024YFC3506301), 국가중의학관리청-전통 중화체법의학 고수준 중화학 중의학 중계 중의학 중계 분야 프로그램(No.zyyzdxk-2023251), 중국 국가자연과학기금 일반 프로그램(82204948), 중국 교육부 기초 및 학제간 분야 돌파구(JYB2025XDXM612), 후베이성 주요 과학기술 특별 프로젝트(2023BCA005), 후베이 시전연구소 수석 과학자 연구 프로젝트(HSL2024SX0002)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ADMETlab 3.0상하이 의약학연구소(SIMM), 중국과학원해당 없음ADMET(흡수, 분포, 대사, 배설, 독성) 특성 예측을 위한 온라인 플랫폼; 리간드의 약동학 및 독성학 프로파일 평가에 사용됨 (URL:  https://admetlab3.scbdd.com/)
오토독 도구 (오토독 4)스크립스 연구소오토독 4.2.6분자 도킹 시뮬레이션용 소프트웨어 제품군; 도킹을 위한 AutoDock 4와 단백질 및 리간드 입력 파일 준비(수소 추가, 전하 할당, 회전 결합 설정), 도킹 그리드 정의, 도킹 결과 분석을 위한 AutoDockTools(ADT)를 포함합니다.
오토독 비나스크립스 연구소AutoDock Vina 1.1.2오픈소스 분자 도킹 소프트웨어; 소분자 리간드와 단백질 수용체 간의 결합 친화도와 포즈를 예측하는 데 사용됩니다
켐3D퍼킨엘머 인포매틱스Chem3D 2024분자 모델링 소프트웨어; 소분자 리간드의 3D 구조를 구성, 최적화 및 시각화하는 데 사용됩니다
사이토스케이프사이토스케이프 컨소시엄 (시스템 생물학 연구소)사이토스케이프 3.10.3생물학적 네트워크를 시각화하고 분석하는 오픈소스 소프트웨어; 유전자/단백질 상호작용 네트워크 구축 및 편집에 사용됩니다
DAVID (주석, 시각화 및 통합 발견을 위한 데이터베이스)미국 국립 알레르기 및 감염병 연구소(NIAID)해당 없음함수 주석 및 풍부 분석을 위한 온라인 도구; 목표 유전자의 GO(유전자 온톨로지) 및 KEGG(교토 유전자 및 게놈 백과사전) 경로 풍부화 분석을 수행하는 데 사용된다 (URL:  https://david.ncifcrf.gov/)
DisGeNET 데이터베이스바르셀로나 슈퍼컴퓨팅 센터 (BSC)해당 없음유전자-질병 연관 데이터베이스; 특정 질병과 관련된 유전자를 식별하는 데 사용됩니다 (URL:  https://disgenet.com/)
GeneCards 데이터베이스와이츠만 과학 연구소해당 없음인간 유전자 통합 데이터베이스; 포괄적인 유전자 정보(예: 발현, 기능, 질병 연관성) 검색에 사용됨 (URL:  https://www.genecards.org/)
리그플루스유럽 분자생물학 연구소-유럽 생물정보학 연구소 (EMBL-EBI)리그플러스 2.33D 좌표 파일로부터 2D 단백질-리간드 상호작용 다이어그램을 자동으로 생성하는 소프트웨어입니다. 수소 결합, 소수성 접촉, 결합 부위 잔기등을 도식적으로 묘사합니다. 학술 이메일 등록 시 at 로 확인 가능; https://www.ebi.ac.uk/thornton-srv/software/LigPlus/ 
OMIM 데이터베이스존스 홉킨스 대학교 의과대학 (NCBI와 협력)해당 없음온라인 멘델 유산의 인간; 유전 질환 및 관련 유전자에 관한 정보를 검색하는 데 사용됩니다 (URL:  https://www.omim.org/)
오픈바벨OpenBabel 개발 팀해당 없음오픈 소스 화학 도구 상자; 분자 파일 형식(예: .mol2에서 .pdb로)을 서로 다른 소프트웨어 플랫폼 간에 변환하는 데 사용됩니다
PharmGKB 데이터베이스스탠퍼드 대학교해당 없음약물유전체학 지식 기반; 유전자-약물 상호작용 및 약물유전체체 변이에 관한 정보를 검색하는 데 사용됩니다 (URL:  https://www.pharmgkb.org/)
프리즘그래프패드 소프트웨어프리즘 9과학적 그래프 작성, 데이터 분석(예: 결합 에너지 분포 곡선 그리기, 오차 바 분석) 및 출판용 품질 수치 생성에 사용됩니다.
프로톡스 3.0Charité - 대학교; 츠메디진 베를린, 독일해당 없음소분자의 독성학적 종말을 예측하는 온라인 도구; 후보 리간드의 잠재적 독성 평가에 사용됨 (URL:  https://tox.charite.de/protox3/index.php?site=home)
퍼블켐 데이터베이스미국 국립생명공학정보센터(NCBI)해당 없음화학 정보 공개 데이터베이스; 2D/3D 구조와 소분자 리간드의 물리화학적 특성을 검색하는 데 사용됩니다 (URL:  https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)
파이몰슈르둸름; 딩거, LLCPyMOL 2.6.1분자 시각화 소프트웨어; 단백질-리간드 복합체의 고품질 이미지 조회, 편집 및 생성에 사용됩니다
R 스튜디오포싯, PBCRstudio 2025.09.1+401R 프로그래밍을 위한 통합 개발 환경(IDE); 생물학적 데이터의 통계 분석 및 GO/KEGG 플롯 생성에 사용됩니다
RCSB PDB 데이터베이스구조생물정보학 연구 협력체 (RCSB)해당 없음단백질 구조 데이터베이스; PDB 형식(URL:  https://www.rcsb.org/)
SEA (유사성 앙상블 접근법)스크립스 연구소해당 없음화학적 유사성을 기반으로 한 표적 예측을 위한 온라인 도구; SwissTargetPrediction을 보완하여 리간드 타겟을 확인하는 데 사용됨 (URL:  https://sea.bkslab.org/)
스트링스트링 컨소시엄 (EBI, SIB 등)해당 없음알려진 및 예측된 단백질-단백질 상호작용 데이터베이스; 유전자/단백질 상호작용 네트워크 구축에 사용됨 (URL:  https://string-db.org/)
스위스타겟 예측스위스 생물정보학 연구소(SIB)해당 없음소분자의 잠재적 단백질 표적을 예측하는 온라인 서버; 리간드의 후보 수용체를 식별하는 데 사용됨 (URL:  http://swisstargetprediction.ch/)
TTD 데이터베이스쑨산대학교 신약개발연구소(IDRBL)해당 없음치료 표적 데이터베이스; 검증된 약물 표적과 잠재적 약물 표적에 대한 정보를 검색하는 데 사용됩니다 (URL:  https://db.idrblab.net/ttd/)
UCSF 키메라캘리포니아 대학교 샌프란시스코 캠퍼스의 생명컴퓨팅, 시각화 및 정보학 자원(RBVI)UCSF 키메라 1.19분자 시각화 및 분석 소프트웨어; 단백질 구조 준비에 사용되며, 여기에는 누락된 루프 재구성(Modeller 인터페이스를 통해), 사이드체인 최적화(Dunbrack 로타머 라이브러리), 양성자 상태 조정, AMBER ff14SB 힘장을 이용한 에너지 최소화가 포함됩니다. 버전 1.19(2025년 3월 출시)는 PDB 구조 가져오기 기능을 수정합니다. 비상업적 용도로 무료로 제공 at  https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ 
UniProt 데이터베이스유니프로트 컨소시엄 (EBI, SIB, PIR)해당 없음단백질 서열 및 기능에 대한 포괄적인 데이터베이스; 단백질 서열, 구조 및 기능적 주석을 검색하는 데 사용됩니다 (URL:  https://www.uniprot.org/)
Venny 2.1.0국립생기술센터; a (CNB-CSIC), 스페인해당 없음벤 다이어그램 생성을 위한 온라인 도구; 유전자 집합 간 중복을 시각화하는 데 사용됩니다(예: 서로 다른 데이터베이스의 표적 유전자) (URL:  https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)
야사라야사라 바이오사이언스야사라 2016년 3월 10일분자 모델링 및 시뮬레이션 소프트웨어; 분자 도킹(Step 3.7) 및 이후 도킹 결과를 검증하기 위한 분자 역학 시뮬레이션에 사용됩니다

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