시험관 내 식물유래 분자가 기존 살생물에 미치는 증강 효과 평가

요약

이 프로토콜은 박테리아 활성 모델링과 조합적 상호작용 분석법을 사용하여 식물화학물질이 전통적 살균제의 살균 효과를 어떻게 증진할 수 있는지 체계적으로 평가하는 틀을 제공하며, 이는 미생물 방제를 개선하고 전체 살균제 사용을 줄이는 시너지 혼합물을 식별하는 것을 목표로 합니다.

초록

기존 살균제의 항균 활성을 향상시키기 위한 혁신적이고 효율적인 접근법 개발은 의료 소독 목적의 미생물 방제 개선을 위한 유망한 전략입니다. 이 맥락에서 우리는 식물유래 식물화학물질이 합성 살생물에 미치는 증강 효과를 평가하는 상세한 프로토콜을 설명합니다. 이러한 식물성 제품은 구조적 다양성, 생활성, 그리고 종종 낮은 독성 덕분에 생물살해제 보조제로서 매력적인 후보자입니다. 여기서 설명한 워크플로우는 최소 살균 농도(MBC)를 결정하고, 개별 시험 제품(생물살사이드 및 식물화학물질) 및 이중·삼중 조합에 대해 용량-반응 및 시간 반응 곡선을 체계적으로 생성할 수 있게 합니다. 결과된 데이터는 분수 살균 농도 지수(FBCI) 산정과 Combenefit 소프트웨어를 사용하여 시험 제품 간 상호작용을 시너지, 가산 또는 길항 효과에 대해 평가하는 등 고급 수학적 모델링을 가능하게 합니다. 이런 의미에서, 유망한 천연 제품을 살해제 강화제로 식별하고, 항균 효능을 최적화하며, 합성 살해제에 필요한 농도를 줄일 수 있는 보다 지속 가능하고 안전한 소독 전략을 설계할 수 있습니다. 이로 인해 미생물 방제가 개선되고 과도한 바이오사이드 사용과 관련된 환경 및 공중보건 위험을 최소화합니다.

서론

의료 관련 감염(HAI)은 전 세계적으로 가장 심각하고 우려스러운 공중보건 문제 중^{하나입니다.} 놀랍게도, 이들은 다제내성(MDR) 미생물의 확산과 병원 표면에 남는 박테리아 생물 부담의 지속과 강하게 연관되어 있으며, 이는 종종 부적절하거나 효과적인 소독 방법으로 인해 발생합니다 ^2,3. 더불어, 환자, 의료진, 의료 장비 간의 교차 오염이^{이 문제를 더욱} 심화^{시킵니다.} 예를 들어 유럽에서는 거의 8만 명의 입원 환자가 하루에 최소 한 번의 HAI를 겪고 있는 것으로 추정되며, 이는 매년 약 1,600만 일수의 추가 입원일에 해당합니다^2. COVID-19 팬데믹은 이 문제를 더욱 복잡하게 만들었으며, 항균제/소독제 사용이 많아지고 입원 환자 증가로 인해 MDR 박테리아 감염이 급증하는 데 기여했습니다 ^6,7. 확장 스펙트럼 β락타마제(ESBL) 생성 대장균과 메티실린 내성 황색포도상구균(MRSA)을 포함한 항생제 내성 박테리아의 증가는 전 세계적으로 건강 및 경제적 부담을 증가시키고 있습니다. 사실, 이러한 균주들은 감염 예방 및 통제를 위한 혁신적인 해결책 개발의 긴급성을 강조합니다 ^1,8,9.

이러한 점을 염두에 두고, 생체 살해제는 내성 박테리아와 박테리아 감염의 확산을 제어하는 데 필수적인 도구가 되었으며, 병원 표면 소독, 장비 소독, 상수도 처리 및 의료기기 오염 방지에 광범위하게 적용되었습니다^10,11. 특정 미생물 표적에 작용하는 항생제와 달리¹², 생체살충제는 막, 효소, 리보솜 RNA, 대사 경로 등 여러 세포 구조를 동시에 파괴합니다 13,14,15. 이러한 광범위한 조치는 처음에는 내성 위험을 줄여줄 것으로 여겨졌습니다. 그러나 미생물은 생물 살해 노출에 적응하여 내성, 지속성, 심지어 항생제에 대한 교차 내성을 보일 수 있음을 증거로 보여준다 ^10,16. 예를 들어, 시프로플록사신과 노보바이오신에 내성을 가진 변종 선택된 벤잘코늄 클로라이드에 노출된 Pseudomonas aeruginosa는 유출 펌프의 과발현을 통해¹⁷. 마찬가지로, 트리클로산은 스테노트로포모나스 맥아호화에서 배출 펌프를 활성화하는 것으로 나타났으며, 클로르헥시딘 노출은 S. aureus¹⁸에서 항생제 내성 증가와 관련이 있습니다.

더불어, 4차 암모늄 화합물(QAC), 클로르헥시딘, 디아미딘, 아크리딘, 트리클로산이 여러 항생제에 대한 박테리아 내성 선택과 지속의 원인으로 지목되고 있습니다^19,20. qacA/B와 smr과 같은 내성 유전자는 QAC에 대한 내성을 부여하는 것으로 알려져 있으며, 오염된 QAC 용액에 저장된 카테터와 관련된 균혈증과 요오도포어의 내재 미생물 오염과 같은 임상 실패도 보고되었습니다 16,17,21. 이러한 발견은 기전 연구와 합리적인 소독 전략에 의해 뒷받침되는 최적화된 바이오사이드 사용의 긴급성을 강조합니다.

바이오필름은 다당류, 단백질, 핵산으로 이루어진 세포외 기질 내에 박혀 있는 고밀도 박테리아 군집으로, 감염 조절에 추가적이고 중요한 장애물이 됩니다^22,23. 이들은 항생제와 살생물에 대한 놀라운 내성을 보이며, 이는 환자 감염의 지속에 기여합니다. 더불어, 바이오필름은 의료 기기, 수술 기구, 병원 표면의 지속적인 오염과도 자주 연관되어^{있습니다.} 임상적 중요성에도 불구하고, 바이오필름은 최근 수십 년간 만성 감염과 항생제 내성의 주요 원인으로 인식되었습니다. 이들의 회복력은 매우 강해 공격적인 소독제조차도 박멸하지 못하고, 감염을 재심을 수 있는 지속적인 세포만 남겨둡^니다. 따라서 효과적인 항생생물막 전략을 찾는 것은 HAIs를 통제하고 MDR 병원체의 공중 보건 및 경제적 부담을 줄이는 데 매우 중요합니다 ^27,28.

식물에서 생산되고 추출되는 2차 대사산물인 식물화학물질은 유망한 해결책으로, 새로운 항생제 및 항생생물막 제제에 대해 거의 개발되지 않은 자원입니다²⁹. 그러나 기존 항생제에 비해 항생제 활성이 적어 식물화학물질은 사용되지 않습니다. 식물화학물질은 감수성 검사를 통해 항생제로 분류되며, 최소 억제 농도(MIC)는 100에서 1000 μg/mL 범위에 해당하며, 이는 기존 항생제보다 훨씬 높은 수치입니다^30,31. 중요한 점은, 식물화학물질이 단독으로 사용되었거나 기존 생체살해제의 증폭제로 사용되었을 때 이미 항생생물막 활성을 입증했다는 것입니다. 예를 들어, 퀘르세틴은 알지네이트 생성을 억제하여 바이오필름 형성 시 접착력을 감소시킬 수 있습니다 32,33,34. 에모딘은 바이오필름 형성에 관여하는 주요 유전자의 발현을 감소시켜 P. aeruginosa, E. coli, S. aureus의 바이오필름 형성을 억제했다³⁵. 식물화학물질을 전통적으로 사용되었으나 점점 효과가 떨어지는 생물살해제와 결합하여 내성 조절제로 사용하는 것은 항균 효능을 높일 수 있는 유망한 전략입니다³⁶. 이러한 시너지 상호작용은 미생물 저항성 메커니즘을 방해하여 만족스러운 소독을 달성하는 데 필요한 최소 유효 생물 농도를 낮출 수 있습니다³⁷. 이 접근법은 살생물 성능을 최적화하고, 저항성 발달을 위한 선택 압력을 줄이며, 과도한 살해제 사용과 관련된 생태학적 및 독성학적 영향을 줄입니다^15,20. 식물화학물질은 구조적으로 다양 합니다 38,39,40, ^{널리 이용 가능하며,} 저렴한 38,39,42 그리고 합성 생물살해제보다 인간과 환경에 덜 독성이 강한 경우가 많습니다^38,39. 이들은 재생 가능한 식물원에서 유래하는 천연 제품이며, 일부 합성 생물살해제에 비해 환경 지속력이 낮고 독성 프로필이 낮은 것으로 보고된 바 있습니다 43,44,45. 비용, 가용성, 독성 프로필은 화합물과 추출 공정에 따라 다르지만, 일부 식물화학물질은 특정 기존 살생물제에 비해 유리한 안전성과 환경 특성을 입증했습니다^46,47.

이 프로토콜은 기존 살균제와 병용하여 개별 및 기존 살균제와 병용하여 보건 소독에 사용할 수 있는 식물화학물질의 잠재력을 평가하는 것을 목표로 합니다. 간단히 말해, 프로토콜은 광범위한 농도 범위에서 살해제-식물화학적 상호작용을 평가합니다. 처음에는 0.1–500 mg/L 사이에서, 50–10,000 mg/L 사이에서 식물화학물질을 시험하여 최소 살균 농도(MBC)를 결정하였습니다(표 1). 이중 조합의 경우, 살균 하위 농도는 다음과 같이 선택되었습니다: 벤잘코늄 염화(BAC)는 0.1, 0.5, 0.75 mg/L; 과초산(PAA)은 0.1, 0.3, 0.5 mg/L; 살리실산(SAL)은 50, 100, 250 mg/L에서 투여됩니다; 유제놀(EUG)은 100, 250, 750 mg/L(표 1)입니다. BAC(0.75 mg/L) 또는 PAA(0.5 mg/L)와 SAL(100 또는 250 mg/L) 및 EUG(250 또는 750 mg/L)를 결합하여 삼중 조합을 수행하였습니다(표 1). 시간 반응 분석은 1분에서 90분 동안 수행되었고, 이후 24시간 동안 박테리아 재성장 평가가 이루어졌습니다. 항균 상호작용은 분별 살균 농도 지수(FBCI)를 사용하여 정량화하고 Combenefit 소프트웨어로 분석하며, 소독 반응학은 Chick-Watson 및 Weibull 모델을 사용하여 농도 의존성과 비활성화 역학을 특성화합니다.

혁신은 식물화학물질과 살생물 간의 안정적인 이중 및 삼중 상호작용을 합리적으로 설계하여 소독 활동을 최적화하면서도 기존 살해제 사용을 줄임으로써 독성과 환경 영향을 최소화하는 데 있습니다. FBCI 계산과 시너지 평가와 같은 수학적 접근법도 미생물 방제에서 식물화학-살해제 상호작용을 정량화하는 데 사용되었습니다. FBCI가 특정 농도 조합에서 상호작용(시너지, 길항, 무관심)을 범주적으로 해석하는 반면, Combenefit은 더 넓은 농도 범위에 걸친 상호작용 패턴을 보다 포괄적이고 반응 표면 기반 평가를 가능하게 합니다. 이를 통해 단일 점 지수로는 포착할 수 없는 농도 의존적 상호작용 효과를 시각화하고 정량화할 수 있습니다^48,49. 더불어, 소독 동역학은 Chick-Watson(선량-반응)과 Weibull(시간 반응) 모델(⁵⁰)을 사용하여 모델링됩니다. 이 모델들은 미생물 불활성화의 동역학적 모델링을 제공하며, 소독률과 생존 곡선 행동을 설명하는 정량적 매개변수를 제공합니다⁵⁰. 이들은 살해가 로그 선형 역학을 따르는지 비선형적인지를 특성화하는 데 도움을 주며, FBCI^51,52의 설명을 넘어서는 처리 효과의 보다 기전적 해석을 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 유망한 식물화학-생물살해제 조합의 체계적 식별과 효율적이고 지속 가능한 의료 소독 전략 개발을 보장합니다. 정적인 종점 측정을 제공하는 고전적인 MIC 또는 체커보드 검사와 달리, 이 프로토콜은 동적 박테리아 모델링과 상호작용 분석을 통합하여 증강의 크기와 동역학을 포착합니다. 고전적인 체커보드 검사는 MIC 종단을 기반으로 억제성 상호작용에 대한 귀중한 정보를 제공하지만, 성장 측정과 단일 상호작용 지수에 한정됩니다. 여기서 설명하는 프로토콜은 성장 억제보다는 살균 활성을 정량화하고, 치료 후 재성장을 평가하여 지속적인 항균 효과를 평가하며, 이중 및 삼중 살균-식물화학물질 조합을 평가하고, Chick-Watson 및 Weibull 접근법을 통한 소독 반응 역학 모델링, Combenefit을 이용한 농도-반응 표면 분석을 적용함으로써 이 틀을 넘어섭니다. 이 다차원 전략은 생물살해-식물화학적 강화에 대한 보다 견고하고 예측 가능한 평가를 가능하게 합니다.

프로토콜

참고: 제안된 방법론은 유럽 표준 EN 1276⁵³에서 수정되었습니다.

1. 배양 준비

1. 검사된 세균균인 대 장 균 CECT 434와 황색포도상구균 CECT 976을 -80 °C에서 30% 글리세롤(v/v)과 함께 냉동보존하여 냉동보존합니다.
2. 회복을 위해서는 박테리아를 판 카운트 한천(PCA) 플레이트에서 배양하고, 25 °C에서 24시간 동안 배양하여 배양합니다.
3. 연구된 균주를 하룻밤 동안 배양한 배양물을 준비하여, 트립티스 대두 육수(TSB)에 줄무늬가 있는 플레이트에서 한 박테리아 군락을 접종하여 다음 단계에서 얻은 보정 곡선에 따라 지수적 성장 단계에 도달하게 하고, 100rpm, 25 °C에서 진동 인큐베이터에서 배양합니다.
4. 분광광도계를 사용하여 앞서 언급한 배양 조건 하에서 각 박테리아 균주별 600 nm(OD₆₀₀)에서 광 밀도에 따른 집락형성 단위(CFU)/mL의 보정 곡선을 얻습니다.
   1. TSB 25°C에서 100rpm 교반과 함께 박테리아 배양을 하룻밤 배양합니다.
   2. 멸균 식염수 용액(0.85% w/v NaCl)에서 배양물을 10배 연속 희석하여 준비합니다.
   3. 분광광도계를 사용해 각 희석의 OD₆₀₀ 을 측정합니다.
   4. PCA에 적절한 희석액을 플레이트로 사용하세요. 플레이트를 25°C에서 24시간 배양하세요.
   5. 10개에서 100개 사이의 콜로니를 제시하는 플레이트를 선택하고 해당 CFU/mL 값을 결정합니다.
   6. CFU/mL 값을 선형 범위(0.04–0.8) 내에서 OD₆₀₀ 측정값과 비교해 그래프를 작성합니다.
   7. 최소 두 번의 독립 검사를 수행하고 최소 두 번의 복제를 수행하세요. 선형 회귀분석을 수행하여 보정 방정식을 구합니다.
   8. 이 방정식을 사용해 이후 실험에서 박테리아 농도를 추정하세요.
5. 접종체를 3772 x g 에서 10분간 원심분리하고, 인산 완충 식염수(PBS)(NaCl 8 g/L, KCl 0.2 g/L HCO, Na₂HPO₄ 1.44 g/L 1.44 g/L, KH₂PO₄ 0.24 g/L)로 한 번 세척합니다.
6. 분광광도계를 사용해 접종체의 OD₆₀₀ 을 PBS 단위로 1 x 10⁸ 콜로니 형성 단위(CFU)/mL로 조절합니다.

2. 분자 용액 준비 및 제어

1. 검사된 분자의 선택, 연구 및 준비를 다음과 같이 고려하세요: 두 가지 바이오사이드 – BAC 및 PAA(15% (w/v) – 그리고 두 가지 식물화학물질 – SAL 및 EUG 99% 사용.
   참고: 이 연구에서 BAC가 선택된 이유는 막 파괴를 통해 박테리아에 효과적인 널리 사용되는 QAC이기 때문입니다^54,55. 과초산은 의료 기구 멸균에 점점 더 많이 사용되는 광범위 산화 소독제입니다^56,57. 살리실산은 항균 및 항생생물막 활성을 나타내고 박테리아의 병원성 및 항생제 내성 메커니즘에 영향을 미쳐 소독 및 미생물 방제에 잠재적 역할을 시사하는 페놀 화합물이다^58,59. 유제놀은 천연 테르페노이드/페놀 방향족 화합물로, 항균 특성이 인정되어 합성 소독제보다 더 안전하고 친환경적인 대안으로 작용할 수 있습니다^60,61.
2. 초순수수에 신선하게 BAC와 PAA를 준비하세요.
3. 용해된 EUG와 SAL은 디메틸설폭화물(DMSO)에 용해되어 세포가 DMSO 농도가 5%를 넘지 않도록 했습니다.
4. 표 1에 따라 BAC, PAA, EUG, SAL 농도를 준비합니다.
5. 15mL 원심분리관에서 스톡 용액과 세포 현탁액의 부피를 조절하여 원하는 최종 분자 농도와 세포 밀도를 얻어 시험 농도를 준비합니다.
6. 이후 모든 검사에는 두 가지 음성 대조군을 포함하세요: (i) 처리 없는 박테리아와 (ii) 세포가 검사 전반에 걸쳐 노출되는 최대 DMSO 농도인 5% DMSO에 노출된 박테리아.

3. 박테리아의 생체 살해 또는 식물성 화학 노출

1. 세포 현탁액 1mL를 초순수 1mL에 넣고 2분간 기다리세요.
2. 그 후 8mL의 바이오사이드 또는 식물화학 용액(초순수수 또는 5% DMSO에 넣음)을 넣고, 100rpm, 25°C에서 흔들리는 인큐베이터에서 30분간 배양합니다.
3. 화합물을 세포와 소용돌이로 섞으세요.

4. 중화, 연속 희석, 도금

1. 희석 중화법과 범용 중화제를 사용하여 각 농도별로 각 생물살해 또는 식물화학물질을 중화시킨다: 폴리소르베이트 80 30 g/L, 사포닌 30 g/L, L-히스티딘 1 g/L, 레시틴 3 g/L, 티오설페트 나트륨 5 g/L 0.0025 M 인산 완충제.
2. 중화 중인 샘플 1mL를 범용 중화제 8mL와 초^순수 1mL를 추가합니다.
3. 특정 희석액 100 μL을 멸균 식염수 용액 900 μL에 첨가하여 10배 연속 희석을 수행하고(희석 ^10-1 에서 희석 ^10-7까지 반복), 드롭 플레이트^{방법 62}에 따라 각 희석액 10 μL을 PCA에 도금하여 중화된 샘플에 생존 세포를 결정합니다.
4. 세포 수를 측정하기 위해 25°C에서 교반 없이 24시간 배양합니다.
5. CFU는 10개 이상의 또는 100개 미만의 군락을 포함하는 플레이트에 대해 육안적으로 집계되었으며, 배양 가능성이 완전히 감소하는 농도는 MBC로 기록됩니다. 식( 1)에 따라 CFU/mL를 계산하는데, 여기서 n 은 계수된 CFU 수, SV 는 도금된 시료 부피(0.01 mL), Dil 은 CFU가 계수된 희석도입니다.
   CFU/mL = n/(SV 딜) (1)
6. 방정식 (2)에 따라 로그 감소, 로그 감소를 평가하는데, 여기서 X₀과 X는 각각 처리되지 않은 박테리아(대조군)와 처리된 박테리아의 CFU/mL입니다.
   로그 축소 = 로그 (X₀) - 로그 (X) = 로그 (_{X 0}/X) (2)

5. 이중 및 삼중 조합 평가

1. 위에서 설명한 방법론을 적용하여 하나의 바이오사이드와 하나의 식물화학물질(이중 조합의 경우) 또는 두 가지 식물화학물질(삼중 조합의 경우)의 모든 가능한 이중 및 삼중 조합의 활성을 평가하여 가능한 증강/시너지 효과를 탐색합니다.
2. 다음과 같은 농도 선택을 고려해 보십시오: 이중 조합에서 BAC 검사 농도는 0.1, 0.5, 0.75 mg/L였으며; PAA는 0.1, 0.3, 0.5 mg/L였으며; SAL은 50, 100, 250 mg/L였으며; EUG는 100, 250, 750 mg/L이었습니다(표 1). 삼중 조합에 관해서는, BAC 농도가 0.75 mg/L로 측정되었고; PAA는 0.5 mg/L이었고; SAL은 100과 250 mg/L이었으며; EUG는 250 mg/L과 750 mg/L이었습니다(표 1).
3. 농도를 선택하고, 개별 분자에 대해 용량-반응 분석에서 비살균적 효과를 낸 농도를 선택하세요.

6. 박테리아 재성장 평가

1. 박테리아 재성장 능력을 평가하기 위해, 처리 및 중화 후 미생물 세포를 액체 배지에서 25°C, 100rpm에서 24시간 이상 성장시키십시오.
2. 동일한 기술과 조건을 사용하여 10배 연속 희석, 도금, PCA 판 인큐베이션, CFU/mL 정량을 수행합니다.

7. 조합 결과 해석 – 분별 살균 농도 지수(FBCI)

1. 조합 분석 결과를 다음과 같이 해석하라:
   1. 이중 조합의 경우 FBCI = FBC(A) + FBC(B)이며, 여기서 A의 분별 박테리 농도인 FBC(A)는 이중 조합 상태의 A와 A 단독 MBC의 비율(MBC_A ^조합/MBC_{A 단}^독) 비율이며, FBC(B)는 이중 조합 B의 MBC와 B 단독 MBC 간의 비율(MBC_B ^조합/MBC_{B 단}^독) 간의 비율입니다(식3).
   2. 삼중 조합의 경우, FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C)이며, 여기서 FBC(A)는 A의 MBC와 A만의 MBC 간의 비율(MBC_A ^조합/MBC_{A 단}^독) 중 비율이며, FBC(B)는 B의 MBC와 B단독 MBC 간의 비율입니다(MBC_B ^조합/MBC_{B 단}^독). FBC(C)는 세 가지 결합 시 C의 MBC와 C만 포함된 MBC의 비율(MBC_C ^조합/MBC_C ^단독) (식 4)이다.
   3. Fernandes 등이 제안한 분류를 적용하^면, FBCI ≤ 0.5는 시너지, 0.5< FBCI ≤ 1은 가산성, 1< FBCI ≤ 4는 무관심, FBCI > 4.00은 길항성으로 간주됩니다.
      FBC(A) + FBC(B) = (MBC ^{이중 조합}/MBC_A ^단독) + (MBC_B ^{이중 조합}/MBC_B ^단독) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (MBC_A ^{트리플 콤비}네이션/MBC_A ^단독) + (MBC_B ^{트리플 콤비}네이션/MBC_B ^단독) + (MBC_{C 트리}^{플 콤비}네이션/MBC_C ^단독) (4)

8. 시간 반응 분석 절차

1. 앞서 설명한 성장 조건(1절)에 따라 E. coli CECT 434와 S. aureus CECT 976의 야간 배양을 준비합니다.
2. 세포 현탁액 1mL를 초순수 1mL에 넣고 2분간 기다리세요. 이 시점에서 각 분자에 대해 원하는 농도인 1/4 × MBC 및 MBC 및 박테리아 현탁액(OD 조절 의식)을 100 rpm, 25 °C에서 8mL의 살생물/식물화학 용액을 추가하세요. 분자들과 세포를 소용돌이로 섞으세요.
3. 노출 시간을 평가하세요: 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60, 90분.
4. 4절에서 설명한 대로, 항균 활성을 log (CFU/mL) 감소량을 log (X/X₀)로 계산하여 평가합니다.
5. 4절에서 설명한 대로 희석-중화법과 범용 중화제, 연속 희석 및 도금을 사용하여 각 농도/시간 쌍에 대해 생물살해 또는 식물화학적 중화를 수행합니다.

9. Combenet 소프트웨어를 이용한 조합 데이터 분석

1. 제공된 파일 'REPLICATE_TEMPLATE.xls'을 https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ 에서 열어 올바른 구조와 서식을 확인하세요.
2. 보충 표 1에 따라 데이터를 매트릭스로 정리하세요.
   1. 제품 A의 농도를 위에서 아래(가장 낮은 행부터 가장 높은 행 순)로 증가시킵니다. 제품 A에 대해 최소 세 가지 이상의 농도를 포함하세요.
   2. 제품 B의 농도를 왼쪽에서 오른쪽으로(가장 낮은 칼럼에서 가장 높은 열순으로) 증가시키세요: 제품 B에 대해 최소 세 가지 다른 농도를 포함하세요.
   3. 상단 행(0 mg/L 제품 A) 단일 제제 제품 B를 나타내십시오.
   4. 첫 번째 열(0 mg/L 제품 B)을 단일 제제 제품 A를 나타냅니다.
   5. (0,0) 셀을 처리되지 않은 대조군과 같이 나타냅니다.
   6. 각 경우에 대해 사용한 값을 정규화하는데, 식 (5)을 사용하며, treat_0h 는 노출 직후(0h) 직후 특정 처리의 로그(CFU/mL)입니다; treat_24h 노출(재성장) 후 24시간 후의 특정 치료법 로그(CFU/mL)입니다; control_0h 노출 직후(0시간) 즉각적인 대조군(5% DMSO에 노출된 세포 또는 세포만)의 로그(CFU/mL)입니다; control_24h 는 해당 대조군(5% DMSO에 노출된 세포 또는 세포)의 로그(CFU/mL)로, 노출(재성장) 후 24시간 후입니다.
   7. 모든 경우에 PCA에서 플레이트 샘플을 24시간 배양한 후 CFU 열거를 수행하세요.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      참고: 100% 생존성을 정의하는 대조군/미처리 상태와 최대 억제를 정의하는 양성 대조군(선택 사항)을 포함하세요; 수치만 사용하고, 공식은 사용하지 마세요; 복제 간에 동일한 행과 열의 수를 사용하세요; '.'는 소수점으로 사용하세요.
3. 파일을 .xls 또는 .xlsx로 저장하세요.
4. 각 복제본에 대해 앞서 설명한 것과 보 충 표 1과 마찬가지로 엑셀 파일을 만들고, 모든 파일을 같은 폴더에 추가하세요.
5. 소프트웨어를 열어 Combenefit(Cancer Research UK Cambridge Institute, 케임브리지, 버전 2.021, https://sourceforge.net/projects/combenefit/ 에서 이용 가능).
6. 그 폴더를 Combenefit에 업로드하세요.
   1. 소프트웨어를 열어 Combenefit를 사용하세요
   2. 프로젝트 폴더 선택 버튼을 눌러 올바른 폴더를 선택하세요.
   3. 기준 모델 선택 : 두 제품에 대해 정확한 메커니즘을 가정하는 로에베 가산성; 독립적인 행동을 가정하는 행복 독립성, 또는 HAS는 보수적 모델(조합을 최적의 단일 에이전트와 비교함)입니다. 최선의 방법은 최소 두 가지 모델을 실행하고 가장 좋은 모델을 선택하는 것입니다.
   4. 이 경우, 시험된 분자의 작용 방식을 고려하여 블리스 모델이 선택되었습니다.
   5. Synergy 분포를 위해 최소 하나 이상의 그래픽 출력을 선택해야 한다는 점을 염두에 두고 선택하세요.
   6. 프레스 런 분석 (보충 그림 1). 팁: 분석 중 저장 선택 창에서 'Everything'을 선택해 결과 모든 그래픽 출력을 원래 폴더에 저장하세요.

10. 칙-왓슨 및 와이불 모델을 용량 및 시간 반응 데이터에 적용

1. 데이터를 가져오기 전에 Excel이나 CSV로 데이터를 포맷하여 준비하세요: 용량 반응의 경우 A열은 용량(농도, mg/L)을, B열은 로그(X/X₀)에 해당합니다; 시간 반응 데이터의 경우, A열은 시간(분), B열은 로그(X/X₀)에 해당합니다.
2. 파일을 '.csv'에 저장하거나 Prism에 바로 복사해서 붙여넣으세요.
3. Open GraphPad Prism (사용 버전: Windows 11용 9.0; 미국 캘리포니아주 라호야).
4. 새 테이블과 그래프에서 XY를 선택하고, 데이터 테이블에서 '새 테이블에 데이터를 입력하거나 가져오기'를 선택하세요(보조 그림 2).
5. 옵션에서 X에 대해 숫자를 선택하고 Y를 선택해 나란히 있는 하위 열에 값을 복제한 후 생성(보충 그림 2)을 누르세요.
6. X에 용량/시간 데이터를 입력하고 Y에 생존 기록 데이터를 입력하세요.
7. 분석, 비선형 회귀(곡선 적합)로 가서 분석할 데이터셋을 선택한 후 확인(Settlement)을 누르세요 (보조 그림 2).
8. 새 항목을 선택한 후 새 방정식을 생성하세요.
9. 방정식에서 방정식 유형에 대해 명시적 방정식을 선택하세요: Y = X와 매개변수의 함수; 이름은 칙-왓슨 모델/와이불 모델이라고 쓰세요; 정의에서는 Y = -a*x^(n)*30 칙-왓슨 모형(보충 그림 3)과 Y = -1/(2.303)*(x/a)^(b)를 작성합니다 (보충 그림 4).
   참고: 칙-왓슨 모델은 방정식 6으로 표현되며, 여기서 X₀과 X는 처리되지 않은 박테리아(대조군)와 처리된 박테리아의 CFU/mL, C는 농도(용량), k_dis는 불활성화율 계수, C는 농도(용량), n은 농도 지수, t는 노출 시간입니다(이 경우 30분)⁵⁰. 칙-왓슨 모델을 적용하여 용량 반응을 관찰하고 소독제 농도와 미생물 감소 간의 관계를 특성화하였습니다.
   log (X/X₀) = -k_dis · Cⁿ · t (6)
   참고: 와이불 모델은 방 정식 7로 표현되며, 여기서 X₀ 과 X 는 처리되지 않은 박테리아(대조군)와 처리된 박테리아의 CFU/mL, t 는 시간, α 은 척도 매개변수(특성 시간), β 은 형태 매개변수⁵⁰입니다. 와이불 모델은 시간 반응을 관찰하고 생존 곡선의 형태를 특성화하기 위해 적용되었습니다. 스케일 매개변수는 비활성화의 특성적 시간을 나타내며, 형태 매개변수는 로그 선형 거동에서의 편차를 설명합니다(β = 1 로그 선형; β < 1개의 꼬리; β > 1개 어깨).
   로그 (X/X₀) = -1/2.303 (t/α)^β (7)
10. 초기 값 역할에서는 모든 매개변수에 대해 초기 값으로 0을, (적합해야 할 초기 값)을 규칙으로 선택합니다(보충 그림 5).
11. 나머지 설정은 기본값으로 유지하고 확인 버튼을 누르세요.
12. 적합도를 실행하고 추정한 매개변수를 점검하세요.

11. 생물학적 복제

1. 모든 분석에 대해 최소 두 개의 독립적인 실험을 수행하고 최소 두 개의 복제를 수행하세요.

결과

이 연구는 검사된 네 가지 화합물인 BAC, PAA, SAL, EUG 모두의 살균 활성을 대장균 CECT 434와 황색 산색 산균 CECT 976에 대해 평가했습니다. 그림 1과 그림 2에서 보듯, BAC, PAA, SAL, EUG는 농도에 따라 배양 가능성에 영향을 미치는 것으로 보입니다. 표 2는 노출 후 및 노출 후 24시간 동안(재생 능력 평가) 검사 분자의 MBC 값을 제시합니다. 혈당 농도에서는 대장균과 황색 구균 모두에서 3 mg/L 시 CFU가 6 log 감소 ≈ 관찰되지 않았습니다. PAA는 두 박테리아 모두 1 mg/L에서 완전 불활성화를 달성했습니다. 식물화학물질 중 SAL은 대장균과 황색 산균에 대해 500 mg/L ...

토론

본 연구에서 제시된 프로토콜은 일반적으로 사용되는 두 가지 생물살해제인 BAC와 PAA, 그리고 두 가지 유망한 식물화학물질인 EUG와 SAL의 살균 활성을 개별 및 결합(이중 및 삼중 조합)으로 평가하는 통합 틀을 제공합니다. 이 프로토콜 내 여러 단계는 항생제 상호작용의 재현성과 정확한 해석을 보장하는 데 특히 중요합니다. 여기에는 박테리아 접종 물질의 표준화, 생물 살해 및 식물화학 용액의 정밀한 준비 및 취급, 노출 시간과 온도의 엄격한 통제, 그리고 하위 동역학 모델링 및 시너지 분석을 위한 정확한 CFU 수치가 포함됩니다. 이 프레임워크는 기존의 살균 분석과 재성장 평가, 조합 검사, 동역학 모델링을 결합하여 즉각적·장기적인 항균 효과를 포괄적이고 정량적으로 특성화할 수 있게 합니다. 하지만 이 프로토콜의 올바르고 효율적인 사용을 보장하기 위해 몇 가지 측면이 고려될 수 있습니다. 첫째, 박테리아 접종체를 표준화하고 시험 분자의 용액을 신중하게 준비하는 것이...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
벤잘코늄 클로라이드	스페인 머크	8.14363.0100	생물살해
원심분리 메가 스타 600R	VWR, 미국	VWR 메가 스타 600R	-
Combenefit - 버전 2.021	영국 암 연구 케임브리지 연구소, 케임브리지, 영국	-	시너지 평가용 소프트웨어
쿠벳	VWR, 독일	VWRI634-0678	광학 밀도 조절을 위한 1.5 mL 큐벳
디스틸레이티드 워터	-	-	미디어 준비를 위해
디메틸 황산화물 (DMSO)	VWR, 프랑스	23500.322	유기 용매
일회용 접종 루프	VWR, 이탈리아	VWRI612-9357	10 & 뮤; L 접종 루프
에펜도르프 진공관	VWR, 중국	VWRI525-1164	1.5 mL 에펜도르프 안전 잠금관
<엠>대장균	스페인 유형 문화 컬렉션(CECT)	434	본 연구에서 사용한 기준 균주
에탄올	VWR, 프랑스	83813.36	작업 재료, 재료, 손의 분해를 위해
유제놀 99%	시그마-올드리치, 미국	163333	식물화학
팔콘 튜브	VWR, 미국	VWRI525-1085	15 mL 매 튜브
팔콘 튜브	VWR, 벨기에	VWRI525-1109	50 mL 매관
윈도우 11용 그래프패드 프리즘 9.0	미국 캘리포니아주 라호야(La Jolla)	-	수학 및 통계 분석을 위한 소프트웨어
레시틴	알파 에이사르, 독일	Q04A010	-
L-히스티딘	머크, 미국	1.04351.0025	-
궤도 인큐베이터	VWR, 미국	VWR 5000I 인큐베이팅 셰이커 230V	-
과초산(퍼아세트산 15%)	AppliChem, 독일	143495-1211	생물살해
페트리 접시	VWR, 이탈리아	VWRI391-0582	-
피펫 1 - 10 mL	VWR, 미국		-
피펫 100 - 1000 & 뮤; L	VWR, 미국		-
피펫 팁 100 - 1000 & mu; L	프리라보, 포르투갈	1-202-50-0	-
피페트 20 - 200 & 뮤; L	VWR, 미국		-
피페트 팁 1 - 10 mL	VWR, 벨기에	VWRI613-7094	-
피페트 팁 2 - 200 & mu; L	VWR, 멕시코	VWRI613-6418	-
판 카운트 아가르	VWR, 벨기에	84608-0500	미생물의 분리 및 배양
폴리소르베이트 80	VWR, 미국	20E2756726	-
염화칼륨 - KCl	VWR, 벨기에	11D110008	-
이수소 인산칼륨 - KH2PO4	VWR, 독일	26931.263	-
사실리산(sacilicic acid)	시그마-올드리치, 미국	84210-500G	식물화학
사포닌	VWR, 독일	21A124103	-
염화나트륨 - NaCl	VWR, 벨기에	27788.297	-
인산나트륨 - Na2HPO<>4	VWR, 벨기에	28026.26	-
티오황산나트륨 - Na2S2O3	VWR, 미국	18D2056589	-
분광광도계	VWR, 미국	UV-1600PC 분광광도계	광학 밀도 조정
황색포도상구균	스페인 유형 문화 컬렉션(CECT)	976	본 연구에서 사용한 기준 균주
트립틱 대두 육수 및 nbsp;	독일 머크	1.05459.0500	미생물의 분리 및 배양
초순수	-	-	샘플 준비를 위해