이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

쥐와 쥐의 등대동맥 및 장간막 저항 동맥에 대한 와이어 근사학

596 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70186

⸱

2026년 2월 27일

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 쥐와 쥐에서 분리된 관과 저항 동맥의 혈관 반응성을 평가하기 위한 나란 와이어 근촬영 상세 프로토콜을 제공합니다.

초록

와이어 근촬영술은 고립된 동맥의 혈관 기능을 정량적으로 평가하기 위해 널리 사용되는 외부 체 외 기법입니다. 큰 관로와 작은 저항 동맥은 구조와 생리적 역할에서 근본적으로 다르기 때문에, 동일한 쥐나 쥐에서 채취한 동맥을 이용해 두 혈관 클래스를 병행하여 분석하면 동물 간 변동성을 줄이고 혈관별 기능 변화를 밝혀내는 쌍 비교가 가능합니다. 이 글은 등척성 와이어 근촬영을 이용해 분리된 쥐 관과 저항 동맥에서 혈관 반응성을 평가하는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 신선하고 산소가 풍부한 생리학적 완충제의 준비를 설명하며; 동맥 구간의 신중한 해부, 세척 및 부착; 그리고 능동 전력 생성에 적합한 최적의 선박 길이 근처에 배치하는 정규화가 있습니다. 표준 혈관 수축제 및 광관 확장제에 대한 누적 농도-반응 곡선을 생성하는 문제 해결 가이드와 실험 시퀀스 예시가 제공됩니다. 이 프로토콜은 내피근과 평활근 기능을 정량적으로 측정할 수 있게 하며, 고혈압과 같은 혈관 질환과 관련된 혈관 반응성의 혈관 특이적 변화를 감지하는 데 도움을 줍니다.

서론

고혈압은 혈관 반응성 변화가 특징이며, 예를 들어 내피 기능 장애나 혈관 평활근의 혈관 수축제에 대한 과민반응이 특징입니다. 이러한 기능 변화는 미세혈관 재형성 및 희갈증과 함께 조직 관류 기능 장애와 혈압 조절 장애에 기여합니다 2,3,4. 분리된 혈관의 체외 검사는 혈관 미세환경을 정밀하게 조절하고 평활근과 내피 신호 전달 경로의 선택적 약리학적 조작을 가능하게 하여 건강과 질병에서 혈관 긴장도를 조절하는 세포 및 분자 메커니즘을 해부하는 강력한 도구입니다.

고립된 동맥에서의 혈관 반응성은 일반적으로 두 가지 상호 보완적인 체외 검사 기법인 와이어 근촬영과 압력 근촬영술 5,6을 사용해 평가합니다. 와이어 마이오그래피에서는 혈관 링이나 세그먼트가 핀이나 와이어에 장착되며, 등척성 힘은 7,8로 기록됩니다. 압력근조피에서는 온전한 혈관 구간을 캐뉼에 삽입하고 정의된 하강내 압력으로 압력을 가하며, 혈관 직경은 비디오 현미경으로 추적됩니다. 와이어 근촬영과 달리, 압력근촬영은 벽내 압력과 빛내 흐름을 조절할 수 있게 해줍니다. 따라서 저항 동맥의 생체 내 혈역학적 환경을 더 가깝게 재현하며, 근형성 긴장, 흐름 매개 반응, 혈관 구조적 또는 기계적 특성 연구에 일반적으로 사용됩니다 9,10. 반면, 와이어 근촬영은 기술적으로 구현이 더 쉽고(캐닐레이션이나 비디오 현미경 없이), 상업용 다중 방 시스템을 이용한 더 높은 처리량을 지원하며, 수십에서 수백 마이크로미터 직경의 소중동맥에서 재현 가능한 약리학적 농도 반응 곡선을 생성하는 데 적합합니다 5,6. 따라서 와이어 근촬영술은 쥐나 쥐로부터 분리된 관과 저항 동맥의 혈관 반응성 약리학적 프로파일링을 병행하는 데 선호됩니다.

관(큰 탄력)과 저항(작은 근육) 동맥은 구조와 기능 면에서 근본적으로 다르며, 이러한 차이는 각기 다른 실험적 고려사항과 종점을 요구합니다. 관도 동맥(예: 하행성 흉부 대동맥)은 많은 양의 탄성 조직과 상당한 평활근 질량을 포함하고 있습니다; 저항성 동맥(예: 장간막 동맥)은 상대적으로 더 큰 매끄러운 근육-내강 비율을 가지며, 말초 저항과 국소 자가조절의 주요 결정 요인입니다11,12. 동일한 작용제가 이 혈관 층에서 서로 다른 분자 반응을 활성화할 수 있기 때문에, 같은 동물의 관관과 저항성 혈관을 나란히 비교하면 유용한 상호 보완 정보를 제공합니다. 예를 들어, 관동맥에서는 내피에서 유래한 산화질소 방출이 아세틸콜린(ACh)이 혈관 이완을 유도하는 주요 이완 경로입니다13,14. 반면, 작은 저항 동맥에서는 ACh가 일산화질소, 프로스타사이클린, 그리고 중요한 것은 내피유래 과분극인자(EDHF)를 통해 이완을 유도합니다15,16. 따라서 같은 쥐 또는 쥐에서 채취한 관과 저항성 동맥의 나란히 와이어 근촬영은 혈관 특이적 기능 변화 탐지를 용이하게 하면서 동물 간 변이성을 줄이는 쌍 비교를 가능하게 합니다.

와이어 근촬영 데이터의 정확한 해석은 생리학적 염용액(PSS)의 조성 및 산소 공급, 조직 취급 및 해부, 장착 기법, 최적의 휴식 전장(정규화), 욕조 온도, 적절한 약리학적 대조군 선택에 대한 세심한 주의에 의존합니다6. 정규화는 선박의 기계적 작동 지점을 설정하여 능동력 발생을 최적화하고 생리학적 작동 조건에 근사하도록 하는 기술적 절차를 의미합니다. 실제로는 대동맥 고리의 경우 고정 전장을 사용하는 것이 일반적이며, 이는 과팽창을 피하면서 안정적인 반응을 주기 위해 경험적으로 결정되는 경우가 많습니다. 작은 저항 동맥의 경우, 정규화는 먼저 등가 벽면 압력 100 mmHg(IC100)에 해당하는 내부 둘레를 결정하여 수행됩니다. 그 후 용기는 이 값의 정의된 분율로 설정되어 정규화된 내부 둘레(IC1)를 설정합니다. 실제로 많은 프로토콜은 쥐 MRA의 경우 IC1을 0.9 × IC100, 마우스 MRA의 경우 IC100 × 1.0 정도로 설정하지만, 혈관 유형, 종, 실험 목표에 따라 이 값은 조정될 수 있습니다 5,17.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

다음 프로토콜은 설정된 지침을 준수하며, 톨레도 대학교 보건과학 캠퍼스 동물 관리 및 이용 위원회에서 승인을 받았습니다.

주의 시작 전에 항상 기관 동물 관리 및 이용 위원회(IACUC)와 기관 생물안전 위원회(IBC) 지침을 준수해 주시기 바랍니다; 적절한 개인 보호 장비(PPE) 사용; 수술용 또는 기타 날카로운 기구를 사용할 때의 운동 주의; 화학물질 및 생물 조직을 취급할 때 관련 안전 데이터 시트(SDS)를 참고하고 준수해야 합니다; 승인된 조절기와 안전한 저장을 사용하여 가압 가스 실린더로 탄화물을 다루고; 그리고 제도적 절차에 따라 생물학적 및 화학적 폐기물을 처리합니다.

1. PSS/변형 크렙스 중탄산염(크렙스) 완충제 준비

참고: 크렙스 완충 조성(최종 농도, pH 7.4): 130 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.17 mM MgSO4, 1.18 mM KH2PO4, 1.6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5.5 mM 포도당, 0.03 mM EDTA.

  1. 대용량 육수를 준비하세요: NaHCO3, 포도당, CaCl2 를 제외한 모든 성분을 이중 증류수에 녹여 육수를 만듭니다. 이 육수는 4°C에서 보관하세요.
  2. 실험 당일에는 필요한 재고 부피(예: 1L)를 분할 배치하고, 차례로 NaHCO3, 포도당,CaCl2를 첨가한 뒤, 탄화물(95% O2/5%CO2)으로 지속적으로 산소를 공급합니다.
    참고: 칼슘 염 침전을 최소화하기 위해 1 M CaCl2 육수를 4 °C에서 준비해 보관하고, NaHCO3 가 완전히 용해된 후에만 필요한 양을 천천히 완충제에 넣으면서 계속 저어주세요. CaCl2 첨가 중에는 탄산칼슘 생성을 줄이기 위해 탄산염 기포를 유지하세요(1.3단계 참조). 눈에 띄는 강수가 있으면 버리고 신선한 완충재를 준비하세요.
  3. pH 평형을 위해 최소 20분 동안 카보겐으로 버퍼를 버블링한 후 pH를 측정하고 필요 시 pH 7.4로 조정하세요.
    참고: 일반적인 기포 pH ≈ 7.7; 지속적인 기포는 pH를 생리적으로 ≈7.4로 낮춥니다.
  4. 신선하게 준비한 크렙스 버퍼로 근경 챔버를 준비하고, 카보겐을 부드럽게 부풀리기 시작하세요. 격한 교반 없이 충분한 가스 교환을 위해 기포 속도를 조절하세요.
  5. 신선하게 준비된 산소 첨가된 크렙스 완충제를 한 조각 남겨두고 얼음 위에 냉장해 조직 해부를 하세요. 남은 산소 완충제를 37°C(연속적인 탄수화물 부풀음과 함께)로 데워 실험 중 사용하세요.

2. 하행 흉부 대동맥과 장간막 아케이드 박리

  1. IACUC 지침에 따라 동물을 안락사시키세요. 동물 안락사와 조직 채취 시기를 2시간 이내로 표준화하여 잠재적인 일주기 영향을 최소화합니다.
  2. 즉시 흉강과 복강을 중앙선 절개로 열고 흉벽을 옆으로 반사시켜 심장과 대혈관을 노출시킵니다.
    참고: 표준 조건에서는 전신 관류를 하지 마세요. 이는 의도치 않게 내피 손상을 일으킬 수 있습니다. 더 나아가, 장간막 혈관 내에 혈액이 남아 있으면 동맥과 정맥 간의 시각적 구분이 향상되고 동맥 완전성 평가가 용이해집니다. 그러나 일부 병리학적 모델(예: 혈전성 질환)에서는 폐쇄성 혈전을 제거하고 내피 손상을 최소화하기 위해 간산화된 얼음처럼 차가운 생리학적 완충제를 이용한 부드럽고 저압의 관류가 권장될 수 있습니다.
  3. 하행 흉부 대동맥을 절제하세요. 해부를 돕기 위해 시각성을 높이기 위해 폐와 식도를 제거하세요. 하행 흉부 대동맥을 직접 잡지 마세요; 대신, 대동맥궁이나 심폐 주변 지방을 부드럽게 잡고 살짝 들어 올린 뒤, 대동맥 아래에서 늑간 가지 혈관을 조심스럽게 절단하세요. 하행 흉부 대동맥이 횡격막을 통과하기 직전에 절개하여 얼음처럼 차가운 산소가 든 크렙스 완충제가 들어 있는 실가르드 코팅 페트리 접시에 넣습니다.
    참고: 자발적인 음색을 최소화하고 생존 가능성을 유지하기 위해 차가운 온도를 유지하세요. 블랙 실가르드는 혈관 해부를 위한 대비를 높입니다.
  4. 장간막 아케이드 전체를 제거해. 장간막을 부드럽게 들어 올려 복부 대동맥에서 횡격막으로 갈라지는 상장간막동맥을 찾으세요. 상장간막동맥을 근위부에서 절단하여 장간막을 주변 결합조직에서 분리시키고, 직접적인 혈관 조작 없이 분리합니다. 장간막 아케이드를 별도의 실가르드 코팅 페트리 접시에 넣고, 얼음처럼 차가운 산소 크렙스 완충제를 넣습니다.

3. 핀 근조영술에 대동맥 고리의 격리 및 장착

  1. 하행 흉부 대동맥의 근위와 원위 끝을 박리 핀으로 고정하여 혈관을 곧게 펴세요. 기계적 손상을 막기 위해 과도한 스트레칭을 피하세요.
    참고: 손상을 최소화하기 위해 혈관 벽을 통과하지 않고 심폐 주변 지방에 핀을 삽입하세요.
  2. 외부 조명이 있는 입체현미경 아래에서 가느다란 Vannas 가위와 겸자를 사용해 심폐 주변 지방과 결합 조직을 조심스럽게 제거하세요. 혈관 벽 손상을 피하세요.
    참고: 혈관 주변 복엽 조직이 혈관 긴장력 조절에 미치는 역할을 연구하는 것이 목적이 아니라면 일반적으로 폐기부 지방을 제거하는 것이 일반적입니다.
  3. 2mm 크기의 대동맥 고리를 잘라서 깨끗하고 수직으로 절단하세요. 구멍이 났거나 눈에 띄게 손상된 반지는 버리세요. 가능하면 동물 간 유사한 위치를 샘플링하여 변동성을 최소화하세요.
  4. 산소가 포함된 크렙스 완충제가 담긴 한 챔버를 근촬영 기계에서 분리하고 조심스럽게 입체현미경으로 옮기세요.
    참고: 챔버를 흔들면 트랜스듀서에 영향을 줄 수 있고 결과에 영향을 줄 수 있으니, 챔버를 조심스럽게 잡고 부드럽게 내려놓으세요.
  5. 입체 현미경 아래에서 미소미터를 사용해 근도 핀을 모아 대동맥 고리를 핀 위에 끼워 넣어 하루관 표면의 조작을 최소화합니다.
  6. 링이 완전히 이완된 상태에서 마이크로미터 측정값을 주목하세요; 조직을 안전하게 고정하기 위해 약간 늘려주세요.
  7. 챔버를 기기에 연결하여 용기를 원래 마이크로미터 측정값으로 복원합니다.
  8. 모든 링이 장착된 후에는 챔버를 37 °C로 가열하고 제공된 프로브로 온도를 모니터링합니다(일반적으로 37 °C에 도달할 때까지 20-30분).
  9. 사용자 인터페이스에서 힘 측정값 0을 설정하고, 데이터 수집 소프트웨어를 실행한 뒤 기록을 시작하세요.
  10. 마이크로미터를 사용해 혈관에 적합한 고정값으로 대동맥 고리에 점진적으로 전장력을 가합니다.
    참고: 마우스 대동맥 고리의 일반적인 전장 측정 값은 5 밀리뉴턴(mN)5입니다. 쥐 대동맥 고리에 대한 보고된 프리텐션 값은 연구마다 다르지만, 사전 최적화는 이 프로토콜에서 10 mN의 프리텐션을 지지합니다18.
  11. 선택한 전장에서 45-60분 동안 대동맥 고리를 평형으로 유지하며, 37 °C 크렙스를 사용해 완충 상태를 반복적으로 교체합니다.
    참고: 대동맥 고리가 부분적으로 장력이 약해지는 경우가 흔하며, 따라서 장력이 안정되기 전까지 마이크로미터를 사용해 여러 차례 미세하게 재조정해야 합니다.
  12. 실험 프로토콜을 시작하기 전에 사용자 인터페이스의 힘 측정값을 0으로 설정하세요.

4. 와이어 근도기에서의 MRA 분리 및 장착

  1. 장간막 아케이드를 시계 방향으로 고정하여 장간막 가지를 곧게 펴세요. 먼저 맹장을 고정한 후, 시계 방향으로 소장을 연속적으로 고정하여 장간막 혈관을 부드럽게 장장하게 하면서도 과도하게 늘어나지 않도록 합니다. 필요에 따라 새로운 크렙스로 대체하여 피나 이물질을 제거하세요.
  2. 접시 중앙에 아케이드가 방사되는 상장간막동맥을 식별하세요.
  3. 적절한 MRA를 선택하여 격리; 일반적인 타겟: 내경 200-250 μm (정규화 과정에서 나중에 결정됨).
    참고: 성체 실험동물에서는 쥐에서 2차, 쥐에서 3차-4차 가지가 일반적으로 나타납니다. 가지 순서는 상장간막동맥에서 연속적으로 분기되는 것으로 정의됩니다. 1차 가지는 상장간막동맥에서 직접 발생하고, 2차선 가지는 1차 가지에서 발생하는 식입니다.
  4. 입체 현미경으로 바나스 가위와 미세한 겸자를 사용해 동반된 정맥을 제거하고 배심 주변 지방과 결합 조직을 제거합니다.
    참고: MRA는 더 두꺼운 벽과 작은 내강으로 정맥과 구별할 수 있으며, 이는 잔류 내강내 혈액의 존재로 쉽게 확인할 수 있습니다.
  5. 동맥을 절제하기 전에 선택한 혈관 인접 장벽을 늘리는 근처의 장 핀을 이완시켜 혈관 후퇴를 방지하세요.
  6. 선택한 MRA의 전체 길이(길이는 >2mm여야 함)를 절제하여 깨끗하고 수직으로 절단합니다. 가는 겸자를 사용해 동맥 한쪽 끝을 잡고, 얼음처럼 차가운 크렙스 완충제가 들어있는 깨끗한 페트리 접시로 옮깁니다(일반 실가르드 코팅이 없는 접시는 이후 장착을 돕습니다). 동맥 손상 여부를 점검하세요; 내관 내 혈액의 존재는 무결성 시각 평가를 용이하게 합니다.
  7. 손상되지 않은 부위에서 약 2mm 구간을 절제합니다. 운송 중에 다루거나 눈에 띄는 손상이 있는 부위는 버려.
    참고: 투명하고 실가르드 코팅이 없는 접시를 사용하면 접시 아래에 자를 놓아 용기 길이를 정확히 측정할 수 있습니다.
  8. 장착을 위해 2.5cm 길이의 40 μm 스테인리스 스틸 와이어 두 개를 준비하세요.
  9. 가는 겸자를 사용해 와이어를 한 번에 하나씩 루멘 안에 꿰어 양쪽 끝에서 충분한 와이어가 돌출되도록 하여 장착에 적합하도록 합니다. 내피 외상을 최소화하세요. 두 선을 모두 삽입한 후, 정규화 절차에 사용할 수 있도록 자를 사용해 정확한 길이를 기록합니다(5.2단계 참조).
    참고: 이 단계는 프로토콜 중 가장 기술적으로 도전적이고 시간이 많이 소요되는 단계이며, 내피 손상을 최소화하기 위해 인내와 반복 연습이 필요합니다. 첫 번째 와이어를 삽입한 후에는 두 와이어를 함께 고정하여 용기를 통과시키는 것이 더 쉽습니다.
  10. 산소가 포함된 크렙스 완충제가 담긴 한 챔버를 근촬영 기계에서 분리하고 조심스럽게 입체현미경으로 옮기세요.
  11. 입체 현미경 아래에서 양쪽 끝에 와이어를 고정한 MRA를 근촬영실로 옮깁니다. 마이크로미터를 사용해 근촬영기 턱을 모아 철선 끝을 턱 사이에 고정시켜 동맥이 그 사이에 자유롭게 매달리도록 합니다.
    참고: 이 단계에서는 전선을 서로 겹쳐 고정하는 것이 좋습니다. 이로 인해 전선이 고정되어 꼬이지 않도록 합니다.
  12. 상단 와이어를 시계 방향으로 감아 장착 나사 아래에 시계 방향으로 감아 고정하세요; 트랜스듀서 쪽 두 번째 선도 반복합니다.
    참고: 나사를 부드럽지만 단단히 조이세요. 나사가 너무 느슨하면 용기가 미끄러질 수 있습니다; 과도하게 조이면 와이어나 트랜스듀서가 손상될 수 있습니다. 첫 번째 끝을 고정한 후, 마이오그래프 턱 사이의 틈을 약간 벌린 후 반대쪽 끝을 고정하여 와이어 장력이 균일하게 유지되도록 합니다.
  13. 턱을 약간 벌리고 와이어를 평행하고 평행하게 정렬하여 거의 닿을 정도로 맞추세요.
    참고: 손상을 최소화하기 위해 모든 와이어 조정은 장착된 선박에서 떨어진 곳에서 수행하십시오.
  14. 모든 MRA에 대해 반복 장착.
  15. 챔버를 37°C로 가열하고 온도를 모니터링하세요(보통 20-30분 정도).
  16. 정규화 절차를 시작하기 전에 사용자 인터페이스에서 힘 측정값을 0으로 전환하세요.

5. MRA의 정규화 절차

참고: 대동맥 링은 고정되고 미리 정의된 전장으로 장착됩니다. 따라서 별도의 정규화 단계는 수행되지 않습니다.

  1. 데이터 수집 소프트웨어에서 정규화 매개변수를 설정하세요: 아이피스 보정 = 1; 표적 압력 = 13.3 kPa (≈ 100 mmHg); 정규화된 내부 둘레(IC1) = 쥐 MRA의 경우 0.9, 쥐 MRA의 경우 1.0; 평균 시간 = 2초; 지연 = 60초.
  2. 선박별 매개변수를 다음과 같이 정규화 모듈에 입력합니다:
    1. 조직 종말점(mm)의 경우: a1 = 0 , a2 = MRA의 측정 길이( 밀리미터 단위, 절제 시 기록된 정확한 길이)를 설정하였습니다.
    2. 와이어 직경: 40 μm.
    3. 마이크로미터 측정: 혈관을 장착하고 완전히 이완한 상태에서 기록한 기준선 마이크로미터 값을 입력합니다.
  3. 정규화 절차를 시작하면 장착된 MRA를 50μm 단위로 단계적으로 늘려 나갑니다. 각 스트레칭 후에는 새로운 마이크로미터 값을 정규화 모듈에 입력하고 각 단위 사이에 60초를 기다립니다.
    참고: 마이크로미터 조정 후 장력이 갑자기 떨어지는 것은 보통 혈관 미끄러짐을 나타냅니다. 장착 나사는 부드럽지만 단단하게 조여야 합니다.
  4. 정규화 모듈이 휴식벽 장력(mN/mm)과 내부 둘레(μm)를 그래프로 그리고 지수 곡선을 맞추기를 기다립니다. 마이크로미터를 사용해 장-둘레 곡선이 100 mmHg 등간선과 교차할 때까지 단계적으로 늘려갑니다. 교차점 근처에서는 구간을 10-30 μm로 줄여 용기가 과도하게 늘어나지 않도록 하세요.
  5. 곡선이 100 mmHg 등간선과 교차할 때, 소프트웨어가 계산한 내부 둘레를 주목하고, 모듈이 계산한 해당 값으로 마이크로미터를 설정하여 준비물이 목표 정규화 내부 둘레(IC₁)에 머무르도록 합니다.
    참고: 곡선 적합이 좋지 않으면 조직 길이, 와이어 직경, 마이크로미터 측정값 등 소프트웨어에 잘못된 매개변수가 입력되었음을 의미합니다.
  6. 모든 장착된 MRA에 대해 정규화 절차를 반복한 후, 37 °C 크렙스를 사용해 완충 상태를 반복하여 30-45분간 평형을 맞추세요.
  7. 실험을 시작하기 직전에 사용자 인터페이스에서 힘 측정값은 0으로 설정하세요.
    참고: 쥐와 랫 간의 주요 매개변수 차이는 표 1에 요약되어 있습니다.
매개변수마우스쥐
대동맥 링의 가장값5 mN10 mN
MRA의 목표 IC1 비율10.9
200-250 μm 내경에 대한 일반적인 MRA 분기 주문2차3위-4위

표 1: 쥐와 쥐 간의 주요 매개변수 차이.

6. 실험적 프로토콜 (예시 서열)

  1. 생존 가능성 검사: 탈분극성 높은 K⁺ 도전(예: 120 mM KCl)으로 수축 반응을 유도합니다.
    참고: 고K⁺ 버퍼(KPSS)는 표준 Krebs 버퍼에서 NaCl과 KCl을 등몰 치환하여 삼투압을 유지하며, 95% O2/5%CO-2로 지속적으로 산소 공급됩니다. 냉전기 충격을 방지하기 위해 사용 전에 KPSS를 37°C까지 가열하세요. KPSS 완충 조성(최종 농도, pH 7.4): 120 mM KCl, 14.7 mM NaCl, 1.17 mM MgSO4, 1.18 mM KH2PO₄, 1.6 mM CaCl2, 25 mM NaHCO3, 5.5 mM 포도당, 0.03 mM EDTA.
  2. 안정적인 수동 기저 장력이 회복될 때까지 신선한 37°C 산소 Krebs 완충제로 최소 세 번 연속 세척을 수행하세요.
    참고: 모든 세척 단계는 목욕용액을 완전히 제거하고 신선한 37 °C 산소 크렙스 완충제로 교체하여 수행됩니다. 상업용 근촬영기는 일반적으로 근촬영실을 배출하는 내장된 세척 기능을 갖추고 있습니다.
  3. 페닐레프린(PE)에 대한 누적 농도-반응 곡선(CRC)을 생성하고, 농도가 증가하는 범위(예: 10⁻9 에서 10⁻4 M)를 추가합니다. 각 농도가 안정될 때까지 기다렸다가 다음 농도를 추가하여 안정된 최대 평원층에 도달할 때까지 기다려야 합니다.
  4. 안정적인 수동 기저 장력이 회복될 때까지 신선한 37°C 산소 Krebs 완충제로 최소 세 번 연속 세척을 수행하세요.
  5. 내피 기능 평가: PE 농도가 최대이하로 전압착시키고 반응이 안정될 때까지 기다린 후 ACh로 내피 의존적 이완을 평가합니다(예: 범위 10⁻⁹에서 10⁻⁵ M). 각 농도가 안정될 때까지 기다렸다가 다음 농도를 추가하여 안정된 최대 이완이 달성될 때까지 기다립니다. 사전 수축된 음에 비해 이완 비율을 기록하세요(7.4단계 참조). <70% 이완을 보이는 제제는 제외됩니다.
    참고: 고혈압과 같은 혈관벽 질환은 일반적으로 내피 기능 장애와 연관되어 있으며, 이는 종종ACh 19에 대한 내피 의존성 혈관 이완 반응 저하로 이어집니다. 이러한 조건에서 <70% 이완을 보이는 제제는 자동으로 배제해서는 안 되며, 이는 기술적 실패가 아닌 진정한 질병 관련 내피 기능 장애일 수 있습니다.
  6. 안정적인 수동 기저 장력이 회복될 때까지 신선한 37°C 산소 Krebs 완충제로 최소 세 번 연속 세척을 수행하세요.
  7. 실험 질문에 따라 경로 특이적 억제제가 있든 없든 다른 혈관작용제를 시험합니다.
  8. 실험이 끝나면 모든 장착된 용기를 제거하고, 모든 챔버를 8% 아세트산으로 청소한 뒤, 세 번 물로 세척한 후 가스 탱크와 기계를 끕니다.
  9. 생물학적 및 화학 폐기물은 기관 절차에 따라 처리해야 합니다.

7. 데이터 분석 및 보고

  1. 기본 정의와 기록. 혈관 수축 도전(예: 고K⁺ 도전, 혈관 수축 CRC, 또는 혈관 확장제 CRC 전 수축 전)이 시작되기 직전에 기초 긴장을 기록하세요.
    참고: 후속 분석을 위해서는 혈관 수축 도전 시작 직전, 이전 자극을 충분히 세척한 후 사용자 인터페이스에서 힘 측정치를 0으로 맞추는 것이 실질적으로 더 쉽습니다(즉, 기준선 장력 = 0 표시).
  2. 하이-K⁺ 챌린지. 활성 힘을 다음과 같이 계산합니다: 활성 힘 = KCl 이후 최대 음 - 기준 장력 (단위: mN). 활성 힘을 장착된 동맥 구간의 단위 길이(mN/mm) 또는 단면적(mN/mm2)으로 정규화하여 표현합니다. 단면적 측정은 부착된 동맥 구간의 후속 조직학적 분석을 통해 벽 두께를 결정해야 합니다.
    참고: 대동맥 고환은 종종 정체되지 않는 반응을 보이므로, 모든 준비제에서 미리 정해진 시간(예: 10분) 내에 최대 고-K⁺ 반응을 측정하여 변동성을 최소화하세요. MRA에서는 자극 후 몇 초 이내에 최대 고-K⁺ 반응이 보통 달성됩니다.
  3. 수축성 CRCs. 수축성 누적 CRC(예: PE)의 각 농도에 대해 다음과 같이 활성 힘을 계산합니다. 각 농도에서의 활성 힘을 고-K⁺ 도전에 의해 유발된 반응의 백분율로 표현합니다. 이 % 값을 사용하여 수축형 CRC를 적합시키세요(7.5단계 참조).
    활성 힘 = 약물 적용 후 최대 톤 - 기저 장력 (단위: mN)
    참고: 특정 조건은 준비물에 따라 최대 고K⁺ 반응에 변동성을 일으킬 수 있습니다(예: 병리학적 원인으로 인한 평활근 질량 변화나 분화 상태). 이 상황에서, 각 농도에서의 활성 힘을 장착된 동맥 구간의 단위 길이(mN/mm) 또는 단면적(mN/mm2)으로 정규화하여 표현합니다.
  4. 이완제 CRCs. 최대치 전수축(전수축음) 이완 CRC의 경우, 각 농도별 이완율을 다음과 같이 계산합니다. 이 % 값은 이완 CRC를 맞추는 데 사용하세요(7.5단계 참조).
    이완 = (수축 전 음 - 약물 적용 후 음색) / (수축 전 음 - 기저 긴장) × 100.
  5. 곡선 피팅. 수축성 또는 이완성 누적 CRC에 대해, x축에 로그 [작용제 농도]를, y축에 정규화된 반응을 그래프로 표시하세요. 비선형 회귀를 사용하여 4매개변수 로지스틱 모델로 그래프 곡선을 적합시킵니다. 통계적 비교를 위해 Emax (최대 효과)와 pEC50 (−logEC50)을 추출하는데, 여기서 EC50 은 Emax의 50%를 생성하는 작용제 농도입니다.
  6. 데이터 제시: 정규화된 CRC를 제시하세요. 곡선의 각 데이터 포인트에 대해 그룹 평균± 평균의 표준오차(SEM) 또는 표준편차(SD)를 사용하세요. 대표적인 원본 트레이스를 포함하고, Emax 와 pEC50 값(SEM 또는 SD ±평균)을 요약한 매개변수 표를 제공하세요.
  7. 통계 분석:
    1. 양측 반복 분산 측정 분석(ANOVA)과 적절한 사후 검정(예: Bonferroni)을 사용하여 실험군 간 CRC를 비교합니다. 그러나 데이터가 누락되었거나 불균형할 때는 가정(구도, 정규성)을 확인하고 혼합 효과 모델과 같은 대체 접근법을 사용하세요.
    2. 두 실험군 간 pEC50 과 Emax 를 비교하여 쌍이 없는 t-검정을 사용하거나, 두 개 이상의 실험군을 비교할 경우 일원 ANOVA를 사용한다. 또는 분산 동지성과 정규성 가정이 위반될 때는 비모수 검정을 사용할 수 있습니다. 통계적 유의성을 p < 0.05로 설정하라.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

쥐나 쥐로부터 분리된 관로 및 저항 동맥에서 와이어 근촬영의 전체 작업 흐름을 나타내는 도식은 그림 1에 나와 있습니다. 마우스 흉동맥 고리의 분리 및 장착 및 2차 MRA의 대표적인 이미지는 각각 그림 2 와 그림 3에 나와 있습니다. 쥐 대동맥 고리와 MRA를 이용한 전장 및 정규화 절차를 묘사한 소프트웨어 스크린샷은 각각 그림 4A, B에 나와 있습니다.

프로토콜에 따라, 성체 수컷 C57BL/6J 마우스 (그림 5A,B) 또는 성체 수컷 Wistar Kyoto 쥐

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

와이어 근촬영은 혈관 기능을 외부 검사하는 강력하고 고해상도의 접근법으로 남아 있습니다. 신중하게 실행될 경우, 이 방법은 동일한 동물 내 거대혈관 및 미세혈관 층을 엄밀히 비교할 수 있는 신뢰할 수 있는 정량적 평가 지표를 제공하며, 서로 다른 생물학적 질문을 해결할 수 있습니다. 관로 동맥 연구는 맥박 압력과 대동맥 강성에 관련된 전역 동맥역학과 대혈관 반응성 변화를 밝혀내는 반면, 저항성 동맥 실험은 미세혈관 긴장도와 말초 저항성 및 조직 관류를 직접 조절하는 메커니즘을 탐구합니다12,20. 구조와 생리적 역할의 주요 차이점 외에도, 관과 저항 동맥은 혈관 층과 종 전반에 걸쳐 일산화질소, 프로스타노이드, EDHF가 내피 의존적 혈관 이완에 뚜렷이 기여하는 등 중요한 기능적 차이를 보인다 13,14,15,16

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 NHLBI 지원금(HL153896 I.O.에 R00)과 톨레도 대학교의 창업 자금으로 지원받았습니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
15 mL 원뿔형 원심분리기 튜브써모피셔 사이언티브14-959-70C
50 mL 원뿔형 원심분리기 튜브써모피셔 사이언티브14-959-49A
아세트산써모피셔 사이언티브A490-212
아세틸콜린밀리포어 시그마A6625-100G
분석 균형메틀러 톨레도MX304
CaCl2써모피셔 사이언티브C79-500
카보겐 (95% O2/5% CO2)에어가스CD USP50
해부 현미경 자이스자이스 스테마 305
해부 페트리 접시생명 시스템 계측DD-90-S-BLK
해부 핀덴마크 묘 기술400626
해부 도구 키트덴마크 묘 기술101017키트는 해부 가위(1개), 다목적 가위(1개), 페트리 접시(5개), 겸자(3개), 해부 핀으로 구성되어 있습니다.
듀몽 #5 - 미세 겸자파인 사이언스 툴즈11254-20
EDTA써모피셔 사이언티브BP2482-500
냉동고 (-20도 & 도; C)써모피셔 사이언티브TSG2325FA
냉동고 경첩 상자USA 사이언티픽2310-5848
장갑 (라지)써모피셔 사이언티브19-041-171D
장갑 (미디엄)써모피셔 사이언티브19-041-171C
장갑 (작음)써모피셔 사이언티브19-041-171B
포도당써모피셔 사이언티브D16-500
눈금식 실린더써모피셔 사이언티브08-572G
그래프패드 프리즘그래프패드 소프트웨어해당 없음데이터 분석 및 그래픽 표현
염산 용액써모피셔 사이언티브SA48-1
아이스 버킷써모피셔 사이언티브03-395-156
KCl써모피셔 사이언티브P217-500
KH2PO4써모피셔 사이언티브P380-500
LabChart 8 소프트웨어AD 악기해당 없음데이터 캡처 소프트웨어
실험실 냉장고써모피셔 사이언티브FBG49RPGA
LED 광원써모피셔 사이언티브AMPSILED21
자기 교반기써모피셔 사이언티브FB30786159
자기 교반봉 (대형)써모피셔 사이언티브14-513-68
자기 교반봉 (중간)써모피셔 사이언티브14-513-61
MgSO4써모피셔 사이언티브M63-500
마이크로 스푼과 주걱 샘플링 세트써모피셔 사이언티브S43322
마이크로 원심분리관USA 사이언티픽1615-5510
미니 마이크로 원심분리기써모피셔 사이언티브07-203-954
미니 드라이버써모피셔 사이언티브NC1349489
다중 와이어 근기록기 시스템덴마크 묘 기술DMT 620M
NaCl 써모피셔 사이언티브S271-3
NaHCO3써모피셔 사이언티브S233-500
pH 측정기써모피셔 사이언티브01-912-351pH 측정기, LE420 센서, 설치 퀵가이드, pH 버퍼 스타터 팩 포함
페닐레프린 밀리포어 시그마P6126-5G
피펫 컨트롤러써모피셔 사이언티브01-001-023
피펫 팁 인 랙 (10 & micro; L)USA 사이언티픽1111-3810
피펫 팁 인 랙 (1000 및 마이크로; L)USA 사이언티픽1111-2830
피펫 팁 인 랙 (200 & micro; L)USA 사이언티픽1111-1810
PYREX 재사용 미디어 저장 병써모피셔 사이언티브06-414-1D
혈청학적 피펫 (10 mL)써모피셔 사이언티브02-923-204
혈청학적 피펫 (25 mL)써모피셔 사이언티브02-923-205
단일 채널 마이크로피펫 멀티팩써모피셔 사이언티브13-684-2503개의 피펫(0.5-10 & mu; L, 10-100 & mu; L, 100-1000 & mu; L)
스테인리스 스틸 와이어(40 & mu; m)덴마크 묘 기술400447
타이머써모피셔 사이언티브02-261-840
초순수 시스템사르토리우스H2O-MM-UV-SET-US(하-옴-유-세팅-우스
바나스 스프링 가위파인 사이언스 툴즈15000-00
부피 플라스크써모피셔 사이언티브13-756-400
보텍스 믹서써모피셔 사이언티브10-320-807
물욕써모피셔 사이언티브07-202-155
접시 무게 재기써모피셔 사이언티브02-202-101

참고문헌

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

태그

혈관 반응성장간막 동맥등척성 근전도 측정법동맥 박리혈관 기능내피 기능평활근 기능

이 논문이 게재되었습니다

동영상 곧 제공

문의하기
도서관에 추천하기

개인정보 처리방침

이용 약관

정책

저작권 © 2026 MyJoVE Corporation. 모든 권리 보유.