방법 논문

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

DOI:

10.3791/70192

⸱

2026년 3월 27일

 ,  , 
1Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, 2Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

초록

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냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)은 천연 세포 초구조의 3D 시각화를 가능하게 하지만, 두꺼운 조직에 대한 적용은 신뢰할 수 있는 유리화 부족과 저처리량 라멜라 준비 방식으로 인해 제한적입니다. 여기서는 구리 호일을 사용한 '와플' 조립체를 이용해 조직을 미리 얇게 하고, 냉동 FIB 리프트 아웃, 과도한 기울기 보상을 적용한 120–200 nm 층상으로 조절된 얇아짐을 결합한 고압 냉동(HPF; ~2100 bar; 해부부터 냉동까지의 시간≤90초)을 통합한 종단 간 워크플로우를 제시합니다. 전도성 코팅은 표준화되어 있습니다(스퍼터-Pt 30 mA/15초; 커튼을 최소화하기 위해 GIS 제한 0.5–1.0 μm. 자동화된 선량 대칭 데이터 수집 (0°, ±3°, ±6°... ±60–66°; 스텝 크기는 2–3°; 총 선량 100–150 e⁻/Å2)는 PACEtomo 스크립트 를 통해 구현되며, 시작 기울기각은 밀링 각도와 시료 방향에서 도출됩니다. AreTomo 3를 통한 처리는 모션 보정, CTF 추정, 정렬, WBP 재구성 기능을 거의 실시간으로 제공합니다; IsoNet은 선택적으로 미싱-쐐기 이방성 감소를 줄일 수 있습니다. 서브토모그램 평균화(RELION 4.0)는 FSC 컷오프 0.143을 기준으로 해상도 보고를 하는 의사 서브토모그램 전략을 따릅니다. 마우스 해마에서 시연된 이 워크플로우는 잘 유리화된 샘플과 균일한 층상(표적 두께 150 ± 40 nm)을 일상적으로 생성하며, 고처리량의 틸트 시리즈 수집(일반적으로 5–8분/틸트 시리즈)을 달성합니다. 이 프로토콜은 복잡한 조직 환경에서 직접 현장 구조생물 학을 연구할 수 있는 재현 가능한 경로를 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)은 고분자 복합체와 세포 구조를 고유의 수분 상태 1,2,3,4,5에서 시각화하는 데 중요한 기법으로 부상했습니다. 투사 이미지의 기울기 시리즈로부터 3차원 부피를 재구성함으로써, 크라이오-ET는 세포 맥락과 원자 해상도 사이의 간극을 메우며, 6번 구조생물학에 대한 전례 없는 통찰을 제공합니다. 세포 표본7(동전 FIB 희석 세포 및 부착 세포 포함)에 대한 냉동전자 단층촬영 워크플로우는 현재 잘 확립되었지만, 두껍고 구조적으로 온전한 조직으로의 직접적인 확장은 여전히 매우 어렵습니다 8,9,10. 특히 뇌11과 같은 수분 함량이 높은 조직에서 두드러지는데, 신뢰할 수 있는 유리화와 전자 투명 층상(일반적으로 <200 nm)의 준비가 지속적인 병목 현상을 유발합니다12.

조직에서 유리화를 달성하는 것은 높은 수분 함량과 제한된 열 전달 때문에 어렵습니다. 플런지 냉동은 얇은 시료(≤20 μm)13에는 효과적이지만, 대부분의 조직에서는 실패합니다. 고압 냉동(HPF)은 고압을 가하여 얼음 핵생성을 억제하여 이론상 최대 ~200 μm까지 시료의 유리화를 가능하게 합니다. 그러나 기존 HPF의 효율은 조직 유리화에 비해 종종 최적이 아닙니다. 결과 개선을 위해 최근 노력에서는 냉동보호제(cryoprotectants 14)를 첨가하고15,16을 사전 절획(예: 바이브라톰 사용)하여11,17을 동결하기 전에 기계적으로 시료 두께를 줄이는 전략을 도입했습니다. 이러한 접근법은 유리화 품질을 향상시킬 수 있지만, 종종 장기간의 체외 처리와 천연 구조를 변화시킬 위험이 있는 화학 첨가물 사용이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 본 연구는 Kelley 등18이 원래 개발한 '와플' 운반체 전략을 수정하여 중요한 최적화를 도입했습니다: 뇌 조직을 두 개의 연마된 구리 운반체를 이용해 물리적 압축하여 동결 전에 시료를 미리 희석시키면서 동시에 필름 격자와 구리 호일 사이에 고정하는 방식입니다. 이 설계는 빠르고 균일한 유리화를 촉진할 뿐만 아니라 기계적 안정성을 크게 향상시켜 이후 취급 시 그리드 파손과 샘플 손실을 효과적으로 방지하여, 온전하고 고품질의 냉동 조직 샘플을 확보할 수 있는 견고한 기반을 마련합니다.

유리화 이후에도 농장은 처리량과 품질 모두에 큰 장애물로 남아 있습니다. 초기 및 널리 채택된 기술로서, 크라이오 울트라미크토미는 수많은 기초 현장 구조 연구를 가능하게 합니다. 그럼에도 불구하고, 구조적 완전성을 저해하는 압축 및 절단 아티팩트19,20을 자주 발생시킵니다. 반면, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 밀링21은 우수한 정밀도와 최소한의 왜곡을 제공합니다 7,22. 초기에는 격자 위의 유리화된 샘플에 직접 크라이오-FIB 밀링을 적용하여 라멜라23을 생산했으며; 그러나 이 현장 접근법은 주로24,25 두께의 얇은 표본(예: 배양된 세포 또는 말초 조직 영역)에 효과적이며, 두껍고 부피가 큰 조직 내 더 깊은 구조에는 접근할 수 없습니다. 이 깊이 제한을 극복하기 위해 추출 전략26이 개발되어 샘플 내부에서 관심 영역(ROI)을 현장 특이화로 추출할 수 있게 되었습니다. 이후 방법론적 발전, 즉 연속 리프트아웃27과 온그리드 직렬화 절획(SOLIST)28은 복잡한 조직에서 3D 상관 표적의 처리량, 층층 안정성 및 정밀도를 더욱 향상시켰습니다. 최근에는 Tang 등(Tang 등)의 6면 부착법(6면 부착법)이 들어 올리고 얇아질 때 기계적 안정성을 향상시키고, Benjamin C. Creekmore 등(11)이 도입한 새로운 온그리드 밀링 접근법과 함께 원래의 조직 맥락을 보존하는 혁신이 계속되고 있습니다. 이러한 발전에도 불구하고, 프로토콜은 여전히 조직 유형에 따라 효율성, 재현성, 적응성 면에서 차이가 있습니다. 이러한 최적화를 통합해 다양한 두꺼운 조직에 대한 일관된 파이프라인을 만드는 표준화되고 쉽게 재현 가능하며 폭넓게 적용 가능한 워크플로우를 구축하는 데 중요한 공백이 남아 있습니다.

이 격차는 확립된 방법론에서 핵심 기술적 세부사항을 종합하여 일반적인 종단 간 파이프라인으로 다듬음으로써 해결됩니다. 이 프로토콜은 견고한 유리화를 위한 향상된 HPF-와플 방식을 사용할 뿐만 아니라, 체계적인 과다 기울기 보상, 표준화된 전도 코팅, 보정된 밀링 순서 등 극저온 FIB 리프트아웃 및 얇아짐의 일련의 최적화 단계를 통합하여 라멜라 균일성을 높이고, 아티팩트(예: 커튼)를 줄이며, 처리량을 향상시킵니다. 특정 세포 유형이나 모델 생물에 맞춘 프로토콜과 달리, 이 워크플로우는 일반화 가능성을 핵심으로 설계되어, 입증된 마우스 해마를 넘어 상대적으로 부드럽고 압축에 취약한 조직을 포함한 다양한 두껍고 복잡한 조직에 적응할 수 있는 다재다능한 프레임워크를 제공합니다.

얼음 손상과 구조적 복잡성에 취약한 쥐 해마 어려운 모델에서 입증된 이 통합적이고 일반화된 작업 흐름은 고품질 층상(120–200 nm)을 신뢰성 있게 생산하고 효율적인 틸트 시리즈 획득(5–8분/시리즈)을 지원합니다. 모범 사례를 통합하여 일관되고 접근 가능하며 널리 적용 가능한 프로토콜로 통합하여, 다양한 생물학 및 생의학 맥락에서 두꺼운 조직 연구에서 냉동 외환 장치를 구현하는 데 있어 기술적 장벽을 낮추는 재현 가능한 틀을 제공합니다.

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프로토콜

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동물 조직을 이용한 모든 절차는 SUSTech IACUC(프로토콜 SUSTech-JY202501019)를 준수했습니다. 이사와 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 샘플 지지 준비

  1. HPF 캐리어 준비 ( 그림 1A 참조)
    1. 6mm 구리 HPF 캐리어 두 개(B형)를 확보하세요. 운반기 중 하나가 평평한 표면인지 확인하세요.
    2. 캐리어의 평평한 표면을 적시고 갈아내세요. 먼저, 원래의 가공 자국이 완전히 제거될 때까지 8000방 사포를 사용하세요. 그 후 12000방 사포로 전환하여 이전 단계에서 생긴 긁힘이 대부분 사라질 때까지 계속 연마하여 균일하게 매끄러운 마감이 됩니다. 그림 2 는 연마 및 연마 과정 중 캐리어 표면의 전형적인 이미지를 보여줍니다.
    3. 부드러운 금속기학적 천과 W0.5 다이아몬드 페이스트를 사용해 표면을 연마하세요: 먼저 페이스트를 천에 바른 후 1–2분 동안 원을 그리며 광을 내어 매끄럽고 광택이 뛰어난 마감이 나올 때까지 연마합니다. 캐리어를 에탄올로 깨끗이 씻고, 이어서 증류수로 모든 연마 잔여물을 제거하세요.
    4. 연마된 캐리어는 사용 전에 최소 4시간(또는 하룻밤) 1-헥사데센에 담가두세요.
      참고: 연마되고 처리된 운반체는 1-헥사데신에 잠긴 상태로 보관할 수 있습니다.
      주의: 1-헥사데센은 흡입 시 인화성 및 해롭습니다; 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 연기함에서 일하세요.
  2. TEM 지지 그리드 준비 ( 그림 1B 참조)
    1. 100메시 구리 그리드에 연속된 Formvar/탄소 지지 필름을 사용하세요.
    2. 스퍼터 코터를 사용해 그리드 양쪽에 금을 스퍼터로 코팅하세요: 전류를 50 mA로 설정하고 각 면에 120초간 코팅하여 한 변당 약 6nm 두께의 층을 만듭니다.
  3. 구리 호일 준비 ( 그림 1C 참조)
    1. 두께 1μm의 고순도 구리 호일을 얻으세요.
      참고: 구리의 열전도율은 순도에 따라 달라지며, 순도가 낮을수록 열전도율도 낮아집니다. 따라서 고순도 구리 호일(Cu ≥ 99.9%)이 필요합니다.
    2. 구리 호일을 원형 구멍 펀치로 직경 3mm 디스크에 천공합니다.

2. 고압 냉동

  1. 깨끗한 유리 표면에 10% 자당 용액 10μL 방울을 놓으세요.
  2. 최근에 안락사한 쥐의 해마를 신속히 해부하세요. 날카로운 면도날을 사용해 약 0.5–1 mm3 크기의 작은 조직 조각을 절제합니다( 그림 1D 참조).
  3. 이쑤시개나 고운 브러시를 사용해 HPF 캐리어 내 구리 지지대 TEM 그리드(100 메쉬)로 조직을 옮깁니다. 2-메틸부탄(이소펜탄)을 사용해 조직을 부드럽게 제자리에 맞추면서 그리드에 가해지는 기계적 응력을 최소화하세요.
    주의: 2-메틸부탄(이소펜탄)은 매우 인화성이 강합니다. 점화원이 없는 연기통에서 처리하세요.
  4. 조직과 격자를 3mm 직경의 구리 호일 디스크로 덮으세요. 조립을 완성하려면 두 번째 HPF 캐리어(평평한 뒤집음)를 위에 올려 밀봉된 '와플' 샌드위치를 만듭니다( 그림 1E 참조).
    참고: 구리 호일은 와플 조립체에서 중요한 기계적 기능을 수행합니다. 이 장치는 TEM 그리드와 호일 자체에 조직을 끼워 넣습니다. 조립 과정에서 이 구성은 부드러운 압력을 가하여 유리화에 이상적인 더 얇고 균일한 조직 조각을 형성하는 데 도움을 줍니다. 더 나아가, 포일은 취급 중 조직 손실을 방지하고, 고압 동결 시 압력을 분산시켜 그리드 파손 위험을 줄여줍니다. 동결 후에는 박이 또한 유리화된 시료 그리드에서 운반체를 더 쉽게 분리할 수 있도록 돕습니다. 그러나 이 준비 방법은 기계적 압축 손상을 유발할 수 있으며, 압력으로 인한 인공물에 민감한 시료에는 적합하지 않을 수 있습니다. 이러한 샘플의 경우, 압축 없이 적절한 두께를 달성하는 대체 절단 기법인 비브라톰 단면화나 시료 천공 등을 고려해야 합니다.
  5. 제조사의 운영 프로토콜에 따라 즉시 고압 냉동 절차를 시작하세요. 목표 압력을 ~2100 bar로 설정하고, 조직 해부부터 냉동까지의 총 시간이 90초를 넘지 않도록 하세요.
    참고: 해부부터 냉동까지 전체 절차는 장기간 체 외 관찰로 인한 구조적 변화를 최소화하기 위해 90초 이내에 완료되어야 합니다. 뇌의 조직 두께 범위는 약 20–40 μm입니다.

3. FIB 밀링 및 리프트아웃

참고: 크라이오 스테이지가 장착된 이중 빔 현미경을 사용하여 다음 단계를 수행하세요. 시료 온도는 전반적으로 -170 °C 이하로 유지하세요.

  1. 수신기 그리드 준비
    1. 리프트아웃 절차의 최종 수신자 그리드로 사용할 새로운 300메시 골드 그리드를 확보하세요.
    2. 실온에서 입체현미경으로 그리드를 부드럽게 클립으로 고정하여 호환되는 냉동 FIB 오토그리드 링에 끼웁니다.
    3. 조립된 오토그리드는 사용 전에 약 40°C로 유지되는 건조 오븐에 직접 보관하여 서리 축적을 최소화하세요.
      참고: 클리핑 시에는 그리드가 평평하고 중심에 놓여 구부러짐이나 정렬 이상을 방지하도록 하세요.
  2. 유리화 조직 격자의 회수 및 장착
    1. 조립체를 액체 질소(LN₂)에 지속적으로 담그는 동안, 조직과 구리 박지를 포함하는 유리화된 TEM 그리드를 주변의 '와플' 조립 부품과 조심스럽게 분리합니다.
      참고: 구리 호일 스페이서는 일반적으로 그리드를 캐리어에서 쉽게 분리할 수 있게 해줍니다.
    2. 미리 냉각된 냉동 로딩 작업대에서 분리된 조직 그리드를 LN₂ 보호 하에 두 번째 크라이오-FIB 오토그리드 링에 장착합니다.
  3. 크라이오 이송 셔틀에 그리드를 공동 적재
    1. 두 개의 오토그리드를 냉동 전송 셔틀의 지정된 슬롯에 넣어.
    2. 각 AutoGrid를 밀링 노치가 바깥쪽을 향하고 수직으로 정렬되도록 하세요.
    3. 적재된 셔틀은 LN₂ 침수 또는 사전 냉각 상태로 유지하다가 FIB/SEM 현미경으로 옮겨집니다.
  4. FIB/SEM에서의 국소화 및 전도 코팅
    1. 냉동 전송 후 현미경으로 이동하면 저해상도 SEM 확대로 조직 그리드로 이동합니다.
    2. 전체 그리드 표면에 전도성 및 보호 코팅을 적용하세요.
      1. 30mA에서 백금(Pt)으로 격자 표면에 스퍼터 코팅을 15초간 발라줍니다.
      2. 가스 주입 시스템(GIS)을 사용하여 두께 0.5–1.0 μm 크기의 유기금속 Pt 캡을 증착합니다.
      3. 30 mA 압력으로 15초 동안 격자 표면에 최종 스퍼터 코팅 Pt 층을 적용합니다.
        참고: GIS 제한은 커튼 아티팩트를 줄이는 데 매우 중요합니다.
  5. 조직 블록 분리 및 리프트 아웃(참조) 그림 3)
    1. 부지 선정 및 방향
      1. SEM 전자빔 이미지를 사용하여 조직 그리드에서 선택한 관심 영역(ROI)으로 이동할 수 있습니다.
      2. 시료를 전면 밀링을 위해 방향을 잡으세요. 일반적인 스테이지 위치는 110° 회전과 7° 기울기로 설정되며, 이 위치는 이온 빔 접근에 적합한 각도로 시료 표면을 제시합니다.
        참고: 형광 표지자가 없는 경우에는 사전 선별 전략을 사용할 수 있습니다. 이 전략은 목표 조직 영역을 찾아내고 냉동 보호 물질이나 기타 비조직 성분이 포함된 부위를 제외하는 것을 목표로 합니다. 표면 얼음이 없는 것으로 보이는 영역을 선택한 후, 표준 전면 방향에서 더 높은 빔 전류(예: 30 kV에서 15 nA)를 사용해 작은 시험용 트렌치를 밀링하고, 더 낮은 빔 전류(예: 30 kV에서 1 nA)로 연마합니다. 단면을 보기 위해 전자 빔으로 전환하면, 조직은 전자 빔 아래에서 뛰어난 대비를 보이는데, 이는 특히 막성 구조와 무거운 원소가 풍부한 영역에서 두드러집니다; 반면, 냉동 보호제는 일반적으로 전자빔 아래에서 균일한 대비를 보입니다. 이로 인해 전체 리프트 아웃 절차를 진행하기 전에 신속한 검증이 가능합니다.
    2. 블록을 격리하기 위한 트렌치 밀링 (그림 3A)
      1. 30 kV로 작동하는 이온 빔을 사용하여 표적 조직 블록을 둘러싼 직사각형 트렌치를 정의합니다.
      2. 블록에서 일정 거리에서 밀링을 시작하세요. 15 nA의 비교적 높은 전류를 사용해 빠른 재료 제거를 위해
      3. 트렌치 벽이 블록에 몇 마이크로미터 이내로 가까워지면 이온 빔 전류를 7 nA로 줄입니다. 전류를 줄이면 더 정밀한 제어가 가능해지고, 관심 영역의 이온 빔 손상과 생물학적 물질의 가열을 최소화할 수 있습니다.
      4. 블록의 한쪽 면을 벌크 자재에 붙여 '탭'처럼 만들어서 임시로 고정하세요.
    3. 두꺼운 블록에 대한 선택적 언더컷 밀링 (그림 3B)
      1. 두께가 20 μm 이상의 조직 블록의 경우, 최종 리프아웃을 용이하게 하기 위해 뒷면에서 언더컷 밀링 단계를 수행합니다.
      2. 스테이지를 회전시키고(예: -70°), 스테이지 기울기(예: 23°)를 조절하여 블록 바닥에 접근합니다.
      3. 30 kV, 3 nA 전류로 FIB를 사용해 하부 연결을 밀링하세요.
    4. 마이크로매니퓰레이터 바늘 부착 (그림 3C)
      1. 시료를 바늘에 부착하려면 순차적인 단면적 밀링 패턴을 수행합니다.
        참고: 금 블록은 300메시 골드 그리드의 바에서 추출할 수 있습니다.
    5. 조직 블록의 리프트 아웃 (그림 3D)
      1. FIB(30 kV, 1 nA)를 이용해 블록과 벌크 샘플을 연결하는 남은 '탭'을 절단합니다.
      2. 마이크로매니퓰레이터 바늘을 조심스럽게 조작해 이제 분리된 조직 블록을 들어 올려 트렌치와 주변 원래 격자에서 완전히 분리시키세요. 그 후 바늘을 당겨 블록을 수신자 그리드로 옮깁니다.
    6. 블록 이동, 용접 및 재도장
      1. 바늘을 통해 미리 냉각된 300메시 골드 리시버 그리드로 연결하세요.
      2. 블록을 선택한 격자 칸 위에 내려놓습니다. 티슈 블록을 그리드의 필름에 닿게 한 뒤, 블록을 수직으로 들어 올려 접촉을 끊으세요. 블록에서 약 3–4 μm 두께의 슬라이스를 이온 빔(30 kV, 1 nA)을 사용해 격자 필름에 밀링합니다(그림 3E).
        참고: 얼음 이물질이 있을 경우, 부착 부위를 직사각형 패턴(30 kV, 50 pA)으로 미리 청소하세요. 블록이 그리드 필름과 접촉하도록 하여 정전하가 무작위로 슬라이스를 이동시킬 수 있습니다.
      3. 접합부 양쪽에 세척 단면 패턴(30 kV, 30 pA)을 사용하여 단단히 용접합니다(그림 3F).
      4. 3.4.2단계(그림 3G)에 설명된 대로 전도성/보호 코팅을 다시 적용하세요.
        참고: 이 GIS 도금 단계에서는 블록 크기에 따라 시간을 줄일 수 있습니다.
    7. 라멜라 얇아짐
      1. 스테이지를 회전시키고(예: -70°), 초기 스테이지 기울기(예: 15°)를 설정합니다(그림 3H).
        참고: 샘플 홀더는 45° 사전 기울기를 특징으로 합니다.
      2. 조직 블록의 매끄러운 영역 내에서 최종 라멜라 위치를 정의합니다.
        참고: 선택한 구역이 얼음 오염이 없는지 확인하세요.
      3. 표 1에 명시된 이온 빔 전류를 사용하여 체계적인 밀링을 수행합니다. 목표면에 접근할수록 더 높은 조류에서 낮은 조류로 진행됩니다(그림 3I, J). 선택적으로, 라멜라에서 1–2 μm 이내일 때는 라멜라의 휘거나 말리지 않도록 약 1.5 μm 떨어진 곳에 응력 완화 트렌치를 밀링할 수 있습니다.
        참고: 남은 재료가 목표 평면에서 ~1 μm 이내에 있을 때는 한 번에 제거되는 두께를 제한하세요.

4. 크라이오-ET 데이터 수집

  1. 라멜라 준비가 성공적으로 완료된 후, 그리드를 크라이오 홀더, 에너지 필터, 단층촬영 소프트웨어(예: SerialEM)가 장착된 투과 전자현미경(TEM)에 신중하게 적재합니다.
  2. 전체 그리드의 아틀라스 지도(예: 그림 4A; 일반적인 배율은 155×)를 획득하세요.
  3. 라멜라 위치로 이동해 몽타주 지도(예: 그림 4B; 일반적인 배율은 3600× 초점 -100 μm).
  4. 명목상 녹화 배율을 설정하고 픽셀 크기가 의도한 해상도에 적합한지 확인하세요; 본 연구에서는 2.109 Å의 픽셀 크기를 사용했습니다. 스팟 크기, C2 조리개 직경, 조명 면적 등 해당 조명 매개변수를 조정하여 직접 전자 검출기의 최적화된 선량률을 달성합니다.
  5. 초점 및 시험 조명 조건을 기록 매개변수에 설정된 조건과 맞추도록 설정하세요.
  6. PaceTomo 스크립트32를 사용하여 아래 단계를 따라 데이터 수집을 수행합니다:
    1. 내비게이터의 "지점 추가" 기능을 사용해 몽타주 지도에서 목표를 미리 선택하여 첫 번째 지형이 충분한 대비를 보이도록 합니다.
    2. PACEtomo_selectTargets.py 스크립트32를 사용해 타겟을 선택하고, 필요 시 미리보기 확대율로 특징 영역을 조정하세요. 일반적인 관심 영역은 그림 4C에 표시되어 있습니다.
    3. 선량 대칭 방식(예: 0°, +3°, -3°, +6°, -6°...)을 사용하여 기울기 시리즈를 획득합니다. 최대 ±60°–66°)까지 2° 또는 3° 단위로 증가합니다. PACEtomo.py 스크립트에서 채취 매개변수를 설정하세요: 시작 기울기각은 3.7.1단계에서 지정한 밀링 각도(즉, 8°)로 결정되며, 그 부호는 냉동 전자기에서 시료 하중 방향에 따라 달라집니다; 최소 및 최대 기울기각은 절대 값을 나타내며; 스텝 크기는 틸트 증가(예: 3°)에 해당합니다.
      참고: 이 시작 기울기 각도는 라멜라를 전자빔에 수평 및 수직으로 위치시키도록 설계되었습니다. 밀링 각도가 알려지지 않았다면, 이미지를 기울여 라멜라가 가장 큰 겉보기 높이로 표시되도록 하세요; 이로 인해 충분히 정확한 정렬이 가능합니다.
    4. 모든 기울기에 분포된 누적 전자 선량을 100–150 e⁻/Ų로 유지하세요. 가능하다면 슬릿 폭 10 eV의 에너지 필터를 사용하세요.
    5. 데이터 수집을 시작하세요. 각 기울기 각도마다 자동 초점 및 추적 기능이 구현되어 있습니다. 단일 틸트 시리즈의 일반적인 획득 시간은 5분에서 8분입니다.
      참고: 문제 해결 가이드는 표 2에 제공됩니다.

5. 데이터 처리

  1. AreTomo 333을 사용하여 틸트 시리즈 모션 보정, CTF 추정, 정렬, 3D 단층 촬영 재구성을 처리하여 세 가지 핵심 단계를 수행합니다: (1) 원본 이미지 프레임의 모션 보정, (2) 각 틸트 이미지의 대비 전달 함수(CTF) 추정, (3) 전체 틸트 시리즈의 정렬.
    1. 정렬 후 가중치 백프로젝션 알고리즘 을 통해 3차원(3D) 단층촬영도를 재구성합니다. 이 단계에 필요한 입력 요소에는 원본 이미지 프레임, mdoc 메타데이터 파일(틸트 시리즈 획득 매개변수를 문서화), 그리고 샘플의 미리 정해진 회전 축이 포함되었습니다.
  2. 쐐기 보정 부족
    1. 재건 후 생성된 단층촬영 결과에 IsoNet34를 이용한 쐐기 보정을 적용합니다.
  3. 입자 선택과 큐레이팅
    1. EMAN 2.935 에서 템플릿 매칭 방법을 사용하여 입자 선택을 수행하세요. 자동 선택이 이루어진 후, 위양성(즉, 비표적 영역 또는 잘못 선택된 영역)은 선택된 입자 데이터셋의 품질을 보장하기 위해 수동으로 배제되었습니다.
  4. 서브토모그램 평균화
    1. 틸트 시리즈와 해당 입자 좌표를 RELION 4.0에 가져오세요. RELION 4.0 문서(https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html)에 명시된 표준 워크플로우에 따라 서브토모그램 평균을 수행하여 재현성을 위한 확립된 모범 사례를 준수합니다.

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결과

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이 프로토콜의 성공적인 적용을 통해 고품질 유리화 조직 라멜라를 생산하고, 이후 토토 세포 초구조를 드러내는 토모그램 재구성이 가능합니다. 마우스 해마 조직을 이용해 입증된 다음 결과들은 성공적인 실험을 대표합니다.

'와플' 방법으로 고압 냉동을 처리한 조직 블록은 균일하고 전자가 투명한 모습을 보였습니다(그림 4B,C). 완전히 유리화된 시료에서는 결정 얼음과 관련된 회절 대비가 나타나지 않았습니다. 틸트 시리즈에서 파생된 파워 스펙트럼은 얼음 결정화를 나타내는 날카로운 육각형 회절 고리 없이 확산된 프로필을 보여주었으며, 이는 고해상도 영상 분석에 필수적인 유리체 상태에서의 세포 수질 보존을 입증했습니다. 최적화된 프로토콜에도 불구하고, 두꺼운 조직 표본의 완전한 유리화는 여전히 기술적인 도전 과제로 남아 있습니다. 평가된 네 개의 ...

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토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기서 제시된 워크플로우는 천연 두꺼운 조직의 현장 냉동 전자 단층촬영을 위한 일반화되고 최적화되며 재현 가능한 파이프라인을 구축합니다. 이 기술의 주요 기여는 단일 기법의 발명이 아니라, 수정된 와플-HPF 방법을 이용한 견고한 유리화부터 정밀하게 보정된 냉동 FIB 리프트아웃 및 희석 프로토콜에 이르기까지 전체 공정의 체계적 통합, 정교화, 상세한 표준화에 있습니다. 이 합성은 복잡한 조직에 냉동 ET를 적용할 때 자주 발생하는 중요한 재현성 및 접근성 격차를 해결합니다.

중요한 단계와 프로토콜 최적화
여러 통합 최적화가 워크플로우의 성공과 신뢰성에 매우 중요합니다. 첫째, 향상된 HPF '와플' 방법은 기본으로, 두 개의 연마된 구리 캐리어를 사용해 조직을 물리적으로 압축하여 얼리기 전에 샘플을 미리 희석하는 주요 수정을 포함합니다. 조직은 필름 격자 위에 지지되...

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 서던 과학기술대학교 크라이오-EM 센터 직원들의 기술 지원에 감사를 표합니다. 이 프로젝트는 국가과학기술혁신위원회(뇌과학 및 뇌유사지능기술 – 국가과학기술 주요 프로젝트, 연구비 번호 2022ZD0211905)와 중국 국가자연과학기금(연구비 번호 32200998호 및 32161133022호)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1-헥사데센시그마-올드리치H2131화학 및 시약
2-메틸펜탄시그마-올드리치M65807화학 및 시약
클립 링써모피셔 사이언티브1131750; 1188953소모품
구리 호일펑청 금속 재료1 & 마이크로; 두께 m소모품
구리 지원 TEM 그리드 (100 메쉬)베이징 중징케이 테크놀로지 유한회사BZ10021b소모품
크라이오-EM써모피셔 사이언티브크리오스 G4장비  
냉동 섬유써모피셔 사이언티브아퀼로스 2장비  
크라이오-FIB 오토그리드써모피셔 사이언티브1205101소모품
그리드 (UltrAufoil R 1.2/1.3 300 메쉬)양화일알트어포일소모품
고압 냉동고라이카 마이크로시스템즈에미 아이스장비  
HPF 캐리어, 구리라이카 마이크로시스템즈타입 B (6 mm)소모품
이온 스퍼터 코팅기정족수Q150RS 플러스장비  
금속학 연마 페이스트lab-testecW0.5소모품
광택 천고랄B00809소모품
사포이글 브랜드 샌드페이퍼8000방, 12000방소모품
입체 현미경라이카 마이크로시스템즈S9i장비  
자당시그마-올드리치200-334-9화학 및 시약
틸트 시리즈 획득 소프트웨어https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/시리얼EM 4.0.9소프트웨어
틸트 시리즈 정렬 및 재건 소프트웨어https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3 아레토모 3소프트웨어
틸트 시리즈 획득 소프트웨어https://github.com/eisfabian/PACEtomo페이스토모소프트웨어
틸트 시리즈 정렬 및 재건 소프트웨어https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet아이소넷소프트웨어
틸트 시리즈 정렬 및 재건 소프트웨어https://github.com/cryoem/eman2EMAN2소프트웨어
틸트 시리즈 정렬 및 재건 소프트웨어https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.html렐리온 4소프트웨어

참고문헌

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