쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

Jinrong Hu; Xiaokang Zhang; Jing Wu

doi:10.3791/70192

이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.

방법 논문

쥐 해마에서 입증된 두꺼운 조직을 위한 냉동 전자 단층촬영 워크플로우

1.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70192

⸱

2026년 3월 27일

Jinrong Hu¹ , Xiaokang Zhang² , Jing Wu¹

¹Cryo-EM Center, Southern University of Science & Technology, ²Interdisciplinary Center for Brain Information, the Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 고압 냉동(HPF)과 와플 방법, 극저온 집중 이온 빔(cryo-FIB) 리프트아웃, 선량 대칭 병렬 채취를 통합하여 두꺼운 조직에 대한 냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)을 표준화하여, 쥐 해마에서 재 현 가능한 현장 분석을 위한 균일하게 얇은 층상과 유리화 표본을 제공합니다.

초록

냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)은 천연 세포 초구조의 3D 시각화를 가능하게 하지만, 두꺼운 조직에 대한 적용은 신뢰할 수 있는 유리화 부족과 저처리량 라멜라 준비 방식으로 인해 제한적입니다. 여기서는 구리 호일을 사용한 '와플' 조립체를 이용해 조직을 미리 얇게 하고, 냉동 FIB 리프트 아웃, 과도한 기울기 보상을 적용한 120–200 nm 층상으로 조절된 얇아짐을 결합한 고압 냉동(HPF; ~2100 bar; 해부부터 냉동까지의 시간≤90초)을 통합한 종단 간 워크플로우를 제시합니다. 전도성 코팅은 표준화되어 있습니다(스퍼터-Pt 30 mA/15초; 커튼을 최소화하기 위해 GIS 제한 0.5–1.0 μm. 자동화된 선량 대칭 데이터 수집 (0°, ±3°, ±6°... ±60–66°; 스텝 크기는 2–3°; 총 선량 100–150 e⁻/Å²)는 PACEtomo 스크립트 를 통해 구현되며, 시작 기울기각은 밀링 각도와 시료 방향에서 도출됩니다. AreTomo 3를 통한 처리는 모션 보정, CTF 추정, 정렬, WBP 재구성 기능을 거의 실시간으로 제공합니다; IsoNet은 선택적으로 미싱-쐐기 이방성 감소를 줄일 수 있습니다. 서브토모그램 평균화(RELION 4.0)는 FSC 컷오프 0.143을 기준으로 해상도 보고를 하는 의사 서브토모그램 전략을 따릅니다. 마우스 해마에서 시연된 이 워크플로우는 잘 유리화된 샘플과 균일한 층상(표적 두께 150 ± 40 nm)을 일상적으로 생성하며, 고처리량의 틸트 시리즈 수집(일반적으로 5–8분/틸트 시리즈)을 달성합니다. 이 프로토콜은 복잡한 조직 환경에서 직접 현장 구조생물 학을 연구할 수 있는 재현 가능한 경로를 제공합니다.

서론

냉동 전자 단층촬영(cryo-ET)은 고분자 복합체와 세포 구조를 고유의 수분 상태 ^1,2,3,4,5에서 시각화하는 데 중요한 기법으로 부상했습니다. 투사 이미지의 기울기 시리즈로부터 3차원 부피를 재구성함으로써, 크라이오-ET는 세포 맥락과 원자 해상도 사이의 간극을 메우며, 6번 구조생물학에 대한 전례 없는 통찰을 ^{제공합니다.} 세포 표본⁷(동전 FIB 희석 세포 및 부착 세포 포함)에 대한 냉동전자 단층촬영 워크플로우는 현재 잘 확립되었지만, 두껍고 구조적으로 온전한 조직으로의 직접적인 확장은 여전히 매우 어렵습니다 ^8,9,10. 특히 뇌^11<....