건강한 자원자에서 리팍시민 치료 및 공생 젤 사용 중 비피도박테리아 및 락토바실리 콜로니 형성 단위의 변화 정량화

Summary

이 임상시험은 리팍시민 치료 1주일 후 비피도박테리아와 락토바실리의 수치를 평가했으며, 락 토바실루스 아시도필러스 NCFM과 비피 도박테리아 Bi07로 구성된 합바이오틱 젤과 아가베 이눌린을 리팍시민 치료 중과 4주 후 플라시보 젤과 비교하여 합성바이오틱 젤이 락토바실리와 비피도박테리아 유지에 도움이 될 수 있음을 보여주었습니다.

Abstract

장내 미생물군은 대체로 안정적이지만, 항생제 치료에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 위장 질환 치료에 사용되는 리팍시민은 프로바이오틱스와 함께 자주 투여되어 불균형 위험을 줄입니다. 락토바실러스 아시도필루스는 장 세포와 상호작용하며 프리바이오틱 화합물을 사용합니다. 비피도박테리아, 특히 비피도박테리움 인판테리움 ssp. 락티스 Bi07은 장내에서 유익한 효과와 연관된 프로바이오틱스입니다. 시험관 내 연구에서는 아가베 프럭탄이 치커리 이눌린보다 우수함을 입증했습니다. 리팍시민과 합성생물을 병행한 후 대변 유산균과 비피도박테리아 수치의 변화를 보고한 연구는 없습니다. 우리의 목표는 건강한 자원자들을 대상으로 Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07, 아가베 이눌린을 프리바이오틱으로 포함한 Synbiotic Gel을 섭취한 후 리팍시민 치료 1주일과 치료 후 4주 동안 장내 비피도박테리아와 락토바실리의 CFU 수치 변화를 평가하는 것이었습니다. 무작위 위약 대조 이중맹검 임상시험에서, 지난 한 달 항생제 치료를 받지 않은 건강한 참가자들을 1:1로 두 그룹(그룹당 10명)으로 무작위배정하였습니다. Synbiotic Gel 그룹은 5주간 하루 10.32g의 아가베 이눌린과 Lactobacillus acidophilus NCFM 4× 10^{9 CFU}/g 및 Bifidobacterium lactis Bi07 4× 10⁹ CFU/g 4mg을 5주간 투여했으며, 첫 주간은 하루 2회 200mg 리팍시민을 투여했습니다. 위약 젤 그룹은 5주간 위약 젤을, 첫 주에는 하루 2회 200mg 리팍시민을 투여했습니다. 배설물의 미생물학적 평가를 통해 CFU를 정량화하여 세균 변화를 추정하였다. 5주 후에도 락토바실리와 비피도박테리아 개체군은 변하지 않았습니다. 일부 대변 샘플에서 Lactobacillus acidophilus NCFM과 Bifidobacterium lactis Bi07이 검출된 것은 일시적이고 부분적인 정착을 시사하며, 이 합성생물에 대한 용량-반응 연구의 필요성을 강조합니다.

Introduction

인간 장내 미생물군은 영구적으로 존재하는 토착종과 기타 일시적인 미생물을 포함하는 밀집된 군집입니다. 개체마다 구성이 다를 수 있지만, 일반적으로 안정적이라고 여겨집니다. 하지만 나이, 감염, 항생^{제 치료에} 의해 영향을 받을 수 있습니다. ^1,2,3. 리팍시민은 장 흡수가 낮은 광범위 항생제로, 장 질환 치료에 사용되며 미생물군을 변화시킬 수 있습니다. 이러한^{영향을 완화}하기 위해 락토바실러스(Lactobacillus)와 비피도박테리움(Bifidobacterium)의 프로바이오틱스 박테리아가 사용됩니다.

비피도박테리움 속 균주는 리팍시민^{내성 2}를 가진 것으로 보고되었으며, 이는 비피도박테리움 속 개체군을 충분한 수로 포함하는 장내 생물군을 촉진하여 유익한 프로바이오틱 효과를 발휘하는 흥미로운 효과를 냅니다.

더불어, 락토바실러스 아시도필루스는 위장 상피⁴와 상호작용하는 능력과 다당류, 올리고당류, 프록툴리고당과 같은 프리바이오틱스를 활용하는 능력으로 널리 인정받고 있습니다. 하지만 락토바실러스 아시도필러스 노스캐롤라이나 식품 미생물학(NCFM) 균주와 같은 몇몇 프로바이오틱 균주만이 확인되었습니다. 따라서 이들의 생체 내 효과를 연구하는 것이 중요하며, 위장관 내 비피도박테리움 락티스 Bi07의 존재도 건강 증진 효과와 연관되어 있습니다 ^2,5. 이 프로바이오틱스는 최적의 성장을 위해 프리바이오틱스가 필요하기 때문에, 프로바이오틱스와 프리바이오틱스가 모두 포함된 합성 바이오틱스가 시너지 효과를 냅니다; 즉, 프로바이오틱스 단독보다 더 유리한 효과가 있습니다. 프로바이오틱스의 기질 역할을 하는 프리바이오틱스와 함께 이 공생은 위장관 내 프로바이오틱 미생물의 생존을 증진시켜 미생물군의 더 큰 회복으로 이어질 것으로 기대됩니다^.

프리바이오틱스의 중요한 공급원은 아가베 프럭탄으로, 이는 치커리 뿌리(Cichorium intybus L)보다 체외에서 미생물군에 더 우수한 효과를 보인다고 보고되었습니다.⁷. 프로바이오틱스 섭취의 영향에 대한 연구가 보고되었습니다; 예를 들어, Engelbrektson 등은 항생제 투여 중과 후에 프로바이오틱스 섭취가 항생제로 인한 미생물군 변화를 줄일 수 있는지 평가했습니다⁸. 프로바이오틱스 혼합물을 받은 그룹이 그렇지 않은 그룹보다 정상 미생물군의 회복이 더 빠른 것으로 나타^{났습니다.} 더 나아가, Koning 등은 500mg 아목시실린을 하루 두 번 7일간 투여받은 40명의 건강한 자원자 장내 미생물군 내 이성균과 프로바이오틱 혼합 섭취 후 미생물군 회복 가능성을 연구했습니다. 결과는 아목시실린 치료가 천연 미생물군의 구성에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 프로바이오틱스 혼합물을 투여했을 때, 2개월 섭취 후 미생물군이 유의미하게 회복되었습니다⁹.

그러나 문헌에 따르면, 리팍시민과 같은 항생제 투여 중 및 후에 장내 미생물군에 미치는 영향을 조사한 연구는 없다고 보고되어 있습니다. 프로바이오틱스를 이용한 연구만 발견했습니다. 따라서 본 연구는 건강한 자원자들이 리팍시민 치료 1주일과 치료 후 4주 동안 Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07, 아가베 이눌린을 포함한 Synbiotic Gel을 섭취한 후 장내 비피도박테리아와 락토바실리의 CFU 수치 변화를 평가하였습니다.

Protocol

이 프로토콜은 살바도르 주비란 국립의학 및 영양 연구소(INCMNSZ) 산하 인간 생의학 연구 기관 위원회(CIIBH)의 승인을 받았습니다(참조 1734). 모든 참가자는 본 연구에 포함되기 전에 사전 동의를 제공했습니다.

연구 설계 및 집단

이 시험은 5주간의 추적 관찰 기간을 가진 무작위 위약 대조 이중맹검 임상시험이었습니다. INCMNSZ 연구자들이 연구에 참여하도록 초대되었으며, 2011년부터 2012년 사이에 항생제 치료를 받지 않은 20세에서 50세 사이의 건강한 자원봉사자들이 동의서를 수락하고 서명한 이들이 포함되었습니다. 연구 대상자들은 1:1로 Synbiotic 젤 그룹에 무작위 배정되었으며, 프레바이오틱 10.32 g의 아가베 이눌린과 Lactobacillus acidophilus NCFM 4× 10^{9 CFU}/g 4× 10⁹ CFU/g Bifidobacterium Lactis Bi07을 하루 4개의 봉지에 5주간 포함하고, 첫 주간은 하루 2회 200mg 리팍시민을 투여하였습니다. 위약 젤 그룹은 5주간 15g 플라시보 젤 4팩을 받았으며, 이 젤은 Synbiotic Gel과 동일한 표현 및 감각 특성을 가지고 있으며, 첫 주에는 하루 2회 200mg 리팍시민을 투여받았습니다(그림 1).

임상 평가

두 연구 그룹 모두 증상과 변 상태를 브리스톨 척도를 사용해 평가하였습니다. 체중, 키, 체질량지수(BMI)도 측정하였습니다. 일기를 사용하여 합성생물 젤, 위약 젤, 리팍시민 섭취 여부를 평가하고, 젤 섭취와 관련된 부작용의 유무를 기록하였습니다.

섬유 소비

두 그룹 모두 식이섬유 섭취를 음식 일기와 매주 24시간 회상을 통해 평가하였습니다.

치료 순응도

리팍시민 및 젤 복용 순응도를 평가하기 위해 참가자 1인당 리팍시민 용량과 합성생물 및 위약 젤 봉지 수를 세었습니다. 중합효소 연쇄반응(PCR)을 통해 락토바실러스 아시도필루 스와 비피도박테리움 락티스 의 존재가 검출되었습니다.

대변의 미생물학적 평가

각 그룹에서 0번 방문과 주 5회 방문(6회 방문)에서 120개의 대변 샘플에서 락토바실리, 비피도박테리아, 장관박테리아의 수를 판 카운트 측정법으로 평가하였습니다. 이 방법은 희석된 샘플을 특수 고체 배지¹⁰에 배치하여 콜로니 형성 단위(CFU)를 측정합니다. 각 방문 시작 시 대변 샘플을 채취하였습니다.

미생물을 확인하기 위해 대변 샘플을 수집하여 BBL 튜브에 보관했습니다. PBG 바이알은 혐기성 박테리아에 사용되었으며, 대변 샘플은 냉동 젤 팩이 들어 있는 스티로폼 쿨러에 담겨 저온을 유지한 후 실험실에서 처리되었습니다. 공동 배양용 PBG 바이알의 뚜껑을 제거하고, 대변 샘플을 면봉으로 채취하여 샘플이 침투되도록 했습니다. 그 후 어플리케이터는 고체 배양 배지가 담긴 튜브에 삽입되었습니다.

혐기성 박테리아의 경우, 바이알을 무게로 재고 숟가락으로 5–10g의 변을 채취했습니다. 변은 바이알 내용물과 섞어 단단히 밀봉했습니다. 샘플 처리를 위해 샘플이 담긴 바이알과 멸균된 Stomacher 백의 무게를 측정했습니다. 샘플은 봉지에 담아 60초간 원심분리한 후 0.1% 펩톤수 4.5mL를 추가했습니다. 이후 샘플 500 μL를 바이알에 옮겨 혼합물을 균질화하기 위해 소용돌이로 변환했습니다. 샘플 100 μL를 각 플레이트에 두 배 접종한 후, 유크토박테리아용 Man Rogosa Sharpe(MRS) 배지와 비피도박테리아용 시스테인 + 시로헥시마이드(원치 않는 미생물군 제거용)를 포함한 DP Beerens 배지에 최대 희석 8(희석 인자 0.1 mL)까지 접종하였습니다. 장내세균의 경우, 맥콘키 배지를 5–8 희석 비율(희석 인자 0.1 mL)에서 사용하여 박테리아 집락을 분리하고¹¹을 정량했습니다. 각 중간 분말은 정제된 증류수에 녹인 후, 용액을 끓게 가열해 완전히 녹인 후, 121°C에서 15분간 멸균되었다. 혼합물을 46.5 °C로 냉각하여 부어 넣는 기법을 수행했으며, 각 판에 1mL를 15–20mL 배양 배양지가 담긴 멸균 페트리 접시에 두 배로 부어 접시가 굳어지도록 했습니다. 접종된 샘플은 혐기성 GasPak 시스템에서_CO2 농축 대기 내 37°C에서 배양하여 24–48시간 동안 혐기성 상태를 유지했습니다. 식민지 형성 단위(CFU)는 펜으로 표시되어¹²개로 세어졌습니다. 다음과 같은 공식이 적용되었습니다:

CFU/mL = (콜로니 수 × 총 희석 인수) / 배양 플레이트 부피(mL)

유산균과 비피도박테리아의 형태학적 특성 확인

그람 염색은 표본의 형태학적 특징을 식별하는 데 사용되었습니다. 각 균주에서 추출한 박테리아 군락 샘플을 현미경 슬라이드에 올려 1분간 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 증류수로 헹군 것입니다. 요오드 용액을 1분간 바른 후 증류수로 헹구었습니다. 알코올-아세톤 용액을 10초 동안 탈색제로 사용한 후 증류수로 헹구었습니다. 마지막으로 사프라닌을 1분간 카운터 스테인으로 바르고 증류수로 헹구었습니다. 현미경 슬라이드는 100배 대물렌즈를 사용한 침수유를 사용한 광학 현미경 아래에서 관찰되었습니다.

총 정량은 5명의 대상자로부터 무작위로 선정된 대변 샘플에 대해 기존 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하여 5주 동안 총 60개의 샘플을 얻었습니다. 배양 배지에서 분리된 개체는 유전 물질 추출을 위해 가공되었습니다. PCR은 범용 박테리아 프라이머를 사용해 16S rRNA 유전자¹³의 일부를 증폭하는 방식으로 수행되었습니다. PCR 산물을 정제 및 서열 분석했습니다. 이 서열들은 확인되어 GenBank 데이터베이스에 제출되어 대변 샘플에서 분리된 락토바실러스와 비피도박테리아 균주가 확인되었습니다.

통계 분석

데이터는 절대 빈도와 상대 빈도 또는 중앙값(p25-P75)으로 제시됩니다. 증상의 누적 중증도는 각 추적 관찰에서 리커트 점수(경미함 1; 중등도 2; 중증 3)를 사용하여 산출되었습니다. 그룹 간 비교는 윌콕슨 랭크 합 검정과 카이제곱 검정 또는 피셔 정확 검정을 사용하여 수행되었습니다. 0주차부터 5주차까지는 프리드먼 검정과 더빈-코노버 검사를 포함한 다중 비교를 사용하여 그룹 내 비교를 수행하였습니다. 통계적 유의성은 P < 0.05로 설정되었습니다.

Results

건강한 자원자 20명을 무작위로 Synbiotic Gel 그룹(n = 10)과 플라시보 젤 그룹(n = 10)으로 나누었습니다(그림 2 및 표 1). Synbiotic Gel 그룹에서는 남성 7명, 여성 3명이 있었으며, 중위 연령은 31세(범위: 27–35세)였다; 위약 젤 그룹에서는 남성 3명, 여성 7명, 중위 연령은 33세(범위: 28–38세)였습니다. 연령, 성별, 체중, BMI 면에서 그룹들은 유사했습니다. 치료 순응도는 Synbiotic Gel 그룹에서 100%, 위약 젤 그룹에서는 90%였습니다.

연구 기간 동안 복통, 복부 팽만감, 보르보리그미, 방귀와 같은 위장 증상이 두 그룹 모두에서 빈도와 강도가 비슷하게 나타났으며, 대부분 경증에서 중등도였고 유의미한 차이는 없었습니다. 배변 빈도와 ...

Discussion

본 연구에서는 위약군 대변 샘플에서 개입 첫 주와 신바이오틱 젤 그룹 대상자에서 장내 세균 수가 유의미하게 감소한 것을 발견했습니다. 이 변화는 병원성 박테리아 과증식을 완화하는 것으로 알려진 리팍시민을 통해 설명할 수 있습니다^. 우리 연구에서 리팍시민 복용 후 Synbiotic Gel 그룹은 긍정적인 효과를 보였다: 개입 기간 내내 Lactobacillus 균주의 중간 개체군은 기저라인과 변하지 않았고, 비피도박테리아는 위약 겔보다 1 log CFU 미만으로 감소하여 임상적 관련성이 최소한으로 간주된다. 리팍시민 처리 후 L. acidophilus NCFM과 B. lactis Bi07을 아가베 프럭탄과 함께 투여하면 배설물 락토바실러스와 비피도박테리움 개체군 유지에 도움이 될 수 있습니다.

락토바실러스 아시도필루스 NCFM 균주...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
BBL 튜브	NA	NA	어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다.
DP 매체	NA	NA	어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다.
냉동 젤 팩
맥콘키 매체	NA	NA
MRS 미디엄	NA	NA	어떤 브랜드든 사용할 수 있습니다.
PBG 바이알			인산염 완충제, 젤라틴, 염 0.05% 시스테인 환원제
페트리 접시
플라시보 블렌드	쿠라고바이오텍-베이비캣.	NA	심 이오틱 젤과 같은 물리적·감각적 특성이 있지만, 활성 성분은 없습니다
스티로폼 콘티너
공생 혼합	쿠라고바이오텍-베이비캣.	NA	Lactobacillus acidophilus NCMF와 Bifidobacterium infantis Bi-07로 구성된 비유제품 (2 x 109nbsp; 그리고 15g 팩에 프리바이오틱으로 17.2g 아가베 이눌린이 들어 있습니다