대 장균 과 포유류 세포에서 유전 암호 확장을 통한 부위 특이적 라이신 락틸화

요약

이 연구는 유전 암호 확장을 활용하여 대 장균 과 포유류 세포에서 인간 에놀라제-1(hENO1)과 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)의 특정 부위에 락틸-라이신(Klac)을 성공적으로 통합하는 방법을 확립했습니다.

초록

락틸화는 최근 발견된 다양한 생물학적 기능을 가진 번역 후 변형(PTM)입니다. 2019년 대식세포 분극 조절자로 처음 확인된 이후, 히스톤 락틸화는 세포 대사와 기능 조절을 연결하는 중요한 연결고리로 부상했습니다. 생화학적으로는 락틸 그룹이 라이신 잔기로 공유 전달되는 과정을 포함하며, 이는 락틸-CoA를 아실 공여체로 사용하는 락틸트랜스퍼라제나 락틸-AMP 중간체를 통한 아미노아실-tRNA 합성효소(AARS)에 의해 매개됩니다. 이러한 메커니즘을 통해 세포 내 락테이트 수치는 단백질 변형 및 기능과 직접적으로 결합됩니다. 락틸화는 유전자 조절, DNA 복원, 대사 재프로그래밍, 면역 조절과 같은 생리적 기능부터 종양 진행 및 전이와 같은 병리학적 과정에 이르기까지 다양한 중요한 세포 과정을 매개합니다. 단백질체학에 의해 수많은 락틸화 부위가 확인되었음에도 불구하고, 돌연변이 유발을 통한 부위 특이적 라이신 락틸화를 달성하는 것은 여전히 도전적입니다. 이를 해결하기 위해 락틸-라이신 특이적 아미노아실-tRNA 합성효소(KlacRS)와 그 관련 tRNA를 사용하여 지정된 잔기에서 락틸-라이신(Klac)을 정밀하게 통합하는 유전 암호 확장 기술을 사용합니다. 이 전략은 직접적인 기능 연구를 위한 균질한 락틸화 단백질 변이체를 생성할 수 있게 합니다. 여기서는 인간 에놀라아제-1(hENO1)과 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)를 모델 시스템으로 사용하여 대장균(Echerichia coli)과 포유류 세포에서 검증된 부위 특이적 단백질 락틸화의 간소화된 프로토콜을 설명합니다.

서론

원래 히스톤에서 발견된 라이신 락틸화(Klac)는 비정상적인 종양 대사와 후생유전학적 조절을 연결하는 핵심 노드로 부상했습니다^. 종양 세포에서 호기성 당화가 강화되어 락테이트가 축적되면, 락틸화의 대사적 기반이 되어, 락테이트가 단순한 대사 부산물이 아니라 단백질 기능을 직접 조절하는 신호 분자로 작용할 수 있게 됩니다. 점점 더 많은 증거는 락틸화가 암세포 증식 2,3,4,5, 전이 6, 대사 재프로그래밍 7, 치료 저항성 ^8,9를 조절하여 종양 시작과 진행에 광범위하게 관여함을 시사합니다.

표현형 수준에서 높은 락틸화는 종양 공격성 증가와 밀접한 관련이 있습니다. 예를 들어, 투명세포 신세포암(ccRCC)에서는 H3K18 락틸화가 혈소판 유래 성장인자 수용체 β(PDGFRβ)를 상향 조절하여 증식과 전이를 촉진하며, 젖산 축적과 종양 신호 전달 사이에 양의 피드백 루프를 형성합니다¹⁰. 마찬가지로, 대장암(CRC)에서는 H3K18 락칠화가 상승하여 루비콘 유사 자가포식 증강제(RUBCNL)의 전사가 강화되어 종양 진행을 촉진하여 자가포식체 성숙을 촉진하고 암세포 생존을 지원합니다¹¹.

종양 공격성에 직접적인 영향을 미치는 것 외에도, 락틸화는 대사 관련 유전자의 발현과 활성을 조절하여 종양 대사 재프로그래밍을 매개합니다⁷. 비소세포폐암(NSCLC)에서는 히스톤 락틸화가 당화 관련 효소를 하향 조절하는 동시에 삼카복실산(TCA) 사이클 효소를 상향 조절하여 종양 세포의 포도당 흡수를 증가시키고 대사 조절 이상을 악화^{시킵니다.} 일관되게, 전 세계 락틸로옴 프로파일링은 락틸화가 포도당 대사, TCA 사이클, 아미노산/지방산 대사 등 중심 대사 경로에 관여하는 효소를 우선적으로 표적으로 하며, 이러한 변형은 공격적인 종양 표현형과 강한 상관관계를 보인다⁷.

중요하게도, 락틸화의 생물학적 결과는 부위에 매우 의존적이며, 이 변형은 종양 치료 내성의 주요 결정 요인으로 부상했습니다. CRC에서는 감수분열 재조합 11(MRE11)의 K673 락틸화가 상동 재조합(HR) 수리를 촉진하여 화학요법 및 폴리(ADP-리보스) 중합효소(PARP) 억제제에 대한 내성을 부여합니다¹³. 교모세포종(GBM)에서는 알데하이드 탈수소효소 1 계열 구성원인 A3(ALDH1A3)와 피루브산 키나제 M2(PKM2) 간의 상호작용이 젖산 생성을 증가시키고, 이후 X선 수리 교차보완 단백질 1(XRCC1)의 K247 락틸화를 유도하여 DNA 손상 복구를 촉진하여 방사선 저항성 및 테모졸로마이드(TMZ) 화학저항성을 촉진합니다¹⁴. 이 연구들은 정의된 라이신 잔기에서 락틸화의 정밀한 조절이 기전적 해부와 치료 표적 지정에 필수적임을 강조합니다.

고해상도 질량분석법의 발전은 대사 효소, 전사 인자, 신호전달 변환기 전반에 걸쳐 광범위한 락틸화를 보여주었으며, 이는 대사, 신호 전달, 세포 생리학 조절에 있어 폭넓은 역할을 강조했습니다 15,16,17,18. 현재까지 락틸화를 촉매하는 여러 작가 효소가 보고되었는데, 예를 들어 AARS1은 종양^{발생을 촉진}하기 위해 p53 락틸화를 매개하고, AARS1/2는 cGAS 락틸화를 조절하여 선천 면역을 억제하지만, 이 효소들은 기질 선택적이며, 임의의 단백질에 대해 완전한 부위 특이적 락틸화를 달성하지 못한다²⁰. 따라서 연구나 치료 목적으로 클락을 어떻게 조종할지 이 분야는 여전히 도전 과제를 제기하고 있습니다.

기능적 연구는 여전히 주로 부위 지향 돌연변이 유발에 의존하는데, 이는 일반적으로 라이신(K)을 글루타민(Q)로 대체하여 아세틸화 또는 락틸화 같은 아실-라이신 변형의 전하 없는 상태를 모방하는 것이다 21,22,23,24. 그러나 이 접근법은 천연 락틸화를 충실히 재현하는 데 상당한 한계가 있습니다: 글루타민의 화학 구조와 측사슬 형상이 락틸화된 라이신과 다르며, 중요한 점은 K에서 Q로 치환하는 과정에서는 두 변형이 동일 부위에서 일어날 수 있을 때 아세틸화 상태와 락틸화 상태를 구분할 수 없다는 점입니다.

유전 암호 확장(GCE)은 정의된 부위에서 비정통 아미노산을 단백질에 직접 통합함으로써 이러한 한계에 대한 강력한 해결책을 제공합니다. Methanosarcina mazei 피롤릴실-tRNA 합성효소(MmPylRS) 돌연변이 라이브러리의 양성 스크리닝을 통해 이전에 Klac 의존적 성장을 보이는 변이를 확인했습니다. 이 돌연변이는 L301M, Y306L, L309A, C348F를 보유했으며, KlacRS1^25,26으로 지정되었다. KlacRS1은 Klac과 동족 직교 tRNA를 아미노아실화하고, 호박 종결 코돈을 억제하며, Klac을 표적 단백질에 효율적이고 부위특이적으로 통합할 수 있게 합니다. KlacRS1 외에도 Klac 통합 가능한 여러 aaRS 변종이 보고되었으며, 여기에는 MbPylRS 기반 LacKRS(L270I/Y271L/L274A/C313F)와 LacKRS3 (Y271M/C313S)^19,27, 그리고 MmPylRS 기반 LacKRS (C348T/Y384F)²⁸이 포함됩니다. 이 도구들은 개별 락틸화 사건의 생물학적 결과를 이해하기 위해 부위 특이적 락틸화 단백질 변이를 생성하는 다목적 유전적 도구 키트를 구축합니다.

이전 연구에서는 이 GCE 기반 시스템을 적용하여 Lys147 부위 특이적 락틸화를 가진 ALDOA 단백질을 대장균과 포유류 세포 모두에서 발현시켰습니다. 기능적 분석 결과, Lys147에서의 락틸화는 당해에 부정적 피드백 효과를 가하고, ALDOA의 열적·화학적 안정성을 높이며, 세포질에서 핵으로의 이동을 촉진하는 것으로 나타났습니다. 이 결과들은 이전에 인식되지 않았던 ALDOA의 조절 메커니즘을 밝혀냈을 뿐만 아니라, 이 부위 특이적 락틸화 플랫폼의 견고성, 다재다능함, 그리고 실용적 유용성을 입증했습니다^25,26. 이 기반을 바탕으로, 여기서는 인간 에놀라제-1(hENO1)과 슈퍼폴더 GFP(sfGFP)를 대표적인 예로 사용하여 직교 KlacRS/tRNA 시스템을 이용한 정밀한 Klac 통합 전략을 설명합니다.

프로토콜

1. 락틸리신을 표적 유전자에 유전적으로 암호화하기 위한 호박 정지 코돈 돌연변이 유발

1. 제조사 프로토콜에 따라 사이트 지시 돌연변이 유발을 통해 hENO1 유전자의 89번과 sfGFP 유전자 149번에 TAG 호박 종료 코돈을 도입하고, PCR 산물을 정제한 뒤 상동 재조합을 수행합니다. 다음 프라이머를 사용하세요:
   ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGtagATTGACAAACTGATGATCGAG
   ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTGTGTGACGTTCAGTTTCTTG
   sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCAT태그GTGTATATCACCGCCGACAAGC
   sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTGTTGAAGTTATACTCCAGC
   참고: 락틸화된 라이신을 부위특이적으로 도입하려면, 표적 부위를 앰버 스톱 코돈(TAG) 또는 다른 무의미 코돈으로 돌연변이해야 하며, 진정한 스톱 코돈으로 TAA 또는 TGA를 사용해야 합니다.
2. DH5α 유능 세포를 얼음 위에서 해동하고, 재조합 산물 5 μL과 세포 50 μL을 혼합한 후 얼음 위에서 30분간 배양합니다. 혼합물을 42°C에서 45초간 열충격에 가한 후 얼음 위에 2-3분간 보관합니다. LB 배지 350 μL을 추가하고 37 °C에서 흔들며(220 rpm) 1시간 배양합니다.
3. 세포를 암피실린이 포함된 미리 가열된 LB 플레이트에 펼치고 37°C에서 12-16시간 인큐베이팅합니다. 돌연변이를 확인하기 위해 생어 시퀀싱을 위해 두 개의 단일 군집을 선택하세요.

2. 대장균 세포 내 락틸화 단백질의 발현

1. 50 μL 대 장균 DH10B 화학적으로 적합한 세포와 표적 유전자를 암호화하는 pBad-ENO1-K89TAG와 KlacRS1(Addgene 플라스미드 #232157)을 공동 변환하여 표적 유전자를 암호화합니다.
2. 혼합물을 얼음 위에서 25분간 배양하고, 42°C에서 45초간 열충격을 주고, 다시 얼음에 3분간 보관합니다. 상온 LB 배지 350 μL 추가, 37 °C에서 220 rpm으로 1시간 동안 세게 흔듭니다.
3. 세포 배양물을 100 μg/mL 암피실린(앰프₁₀₀)과 50 μg/mL 클로람페니콜(Cm₅₀)을 보충한 LB/플레이트에 발랐습니다. 플레이트를 37°C에서 12-16시간 배양하세요.
4. 단일 군집을 선택해 4mL 스타터 배양물을 접종하고 하룻밤 동안 배양하세요. 다음 날에는₁₀₀Cm₅₀ LB/Amp 400mL로 배양 후 220 rpm, 37 °C에서 강하게 흔들어 OD 600이 0.6-0.8에 도달할 때까지 조절합니다.
5. 0.2% L-아라비노스와 1 mM Klac을 유도합니다; 30°C, 220rpm에서 추가로 16시간 배양하세요.

3. HEK 293T 세포에서 락틸리신의 유전적 암호화

1. 12웰 플레이트에 10 x⁵ 세포 밀도의 종자 세포를 1mL DMEM 배지를 사용한다. 24시간 배양 후 세포 수합률이 70%-80%에 도달하면 형질전환을 수행합니다.
   참고: 형질전환에는 70%-80%의 합류율이 권장되며, 군집 형성 분석은 더 낮은 씨앗 밀도를 요구하므로 경험적으로 결정해야 합니다.
2. 희석된 DNA 용액을 제조할 때, 0.75 μg의 pcDNA-sfGFP-N149TAG와 pNeu-KlacRS(Addgene 플라스미드 #232155)를 1:1 비율로 38 μL 혈청 무포도당 DMEM에 첨가합니다. 부드럽게 피펫을 위아래로 움직이거나 잠시 소용돌이로 섞어 주세요.
3. 희석된 형질전환 시약을 제조할 때, 고포당이 포함된 혈청 무첨가 DMEM 38 μL에 2.25 μL의 형질전환 시약을 첨가합니다. 피펫을 부드럽게 위아래로 3번에서 4번 섞어 섞으세요.
   참고: 옵티-MEM의 사용 여부는 제조사의 지침에 따라 달라지며, 혈청 함량이 형질전환 효율에 영향을 줄 수 있습니다.
4. 희석된 형질전환 시약을 즉시 희석된 DNA 용액에 모두 한 번에 첨가합니다.
   참고: 용액을 역순으로 섞지 마세요.
5. 즉시 피펫을 위아래로 3x-4회 또는 잠시 보텍스로 섞어 섞으세요. 상온에서 10-15분간 배양하여 형질전환/DNA 복합체가 형성되도록 하세요.
   참고: 형질전환/DNA 복합체는 준비 후 20분 이내에 사용해야 합니다.
6. 각 웰에서 50 μL 형질전환/DNA 혼합물을 각각 배지에 떨어뜨리고, 플레이트를 부드럽게 휘저어 균질화합니다.
7. 형질전환 6시간 후, 1 mM Klac가 포함된 신선한 DMEM으로 배지를 교체합니다. 24-48시간 동안 배양하세요.
   참고: 이전 데이터를 기준으로 1-5 mM 농도에서 Klac은 세포²⁶에 대해 세포독성 효과를 보이지 않았습니다. Klac의 작동 농도는 단백질 발현 수준에 따라 최적화되어야 합니다. 표적 단백질이 락틸화 변형 손실에 취약한 경우, HDAC 억제제(예: 트리코스타틴 A) 또는 시르투인 억제제 NAM(니코틴아마이드) 투여가 권장됩니다.

4. 대장균 세포 내 락틸화 단백질의 His-tag 정제

1. 세포를 6,900 x g 에서 원심분리하여 4 °C에서 10분간 채취합니다. 50 mL의 용해 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl)에 재현탁합니다. 얼음 위에서 초음파 용해를 3초 펄스, 8초 간격으로 200W에서 30분간 용해합니다. 13,800 x g, 4 °C에서 30분간 원심분리기를 사용한 후 상원액을 수집합니다.
   참고: 표적 단백질이 기계적 전단에 취약한 경우, 초음파 단계에서 대 장균에 적합한 조제된 단백질 추출 시약을 사용하여 부드러운 세포 용해로 대체할 수 있습니다.
2. 0.45 μm 두께의 막을 통해 상청액을 여과하여 용해성 분획을 수집합니다. 정제된 용해물을 1mL Ni-NTA 중력 컬럼에 적재합니다. 약 5mL의 버퍼 A(20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl)로 세척합니다.
   5 mM 이미다졸)를 투여하여 엘루에이트에서 검출 가능한 단백질이 발견되지 않을 때까지 투여합니다. 단백질을 1mL 버퍼 B(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl, 200 mM 이미다졸)로 5회 용출합니다. 모든 분수를 저장하세요. 빠른 브래드포드 검사로 용출된 단백질 검사를 하세요.
3. 정제된 단백질 분획을 결합하여 저장 버퍼(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl)로 버퍼 교환을 수행합니다. 각 튜브에 농축된 단백질을 50μL로 분할 배치한 후 급속 냉동하여 -80 °C에서 저장하여 다음 분석을 수행합니다.

5. 락틸화 단백질의 생화학적 특성 분석

1. SDS-PAGE와 웨스턴 블로팅
   1. 단백질을 SDS-PAGE(90 V 20분, 150 V 50분 분)로 분리합니다. 젤을 쿠매시 블루로 염색하고, 전자레인지에서 15초간 가열한 후, 셰이커(50rpm, 15분)에 염색액(40% 절대 에탄올, 10% 빙하 아세트산, 50% 탈이온수)으로 염색합니다. 염색 과정을 반복하여 단백질 띠가 뚜렷하게 보입니다.
   2. 메탄올에 PVDF 막을 1분간 활성화하세요. 전사 스택을 순서대로 조립하세요: 스펀지, 필터 페이퍼, 젤, 멤브레인, 필터 페이퍼, 스펀지. 250 mA에서 1시간 동안 미리 냉각된 버퍼에서 전송을 수행합니다. 멤브레인을 5% 탈지우유로 막을 1.5시간 동안 막고, TBST로 3번(각각 10분씩) 세척하세요.
   3. 1차 항체(Anti-His 1:10,000; 항-L-락틸 라이신 1:1,000) 4°C에서 밤새 투여했습니다. TBST로 세 번 세척하세요.
      참고: 최적의 희석 비율은 다양한 상업적 공급원에서 얻은 항체에 대해 경험적으로 결정해야 합니다.
   4. 토끼 2차 항체(1:10,000)를 실온에서 1.5시간 동안 인큐베이팅합니다. TBST로 세 번 세척하세요. 화학 발광을 이용한 이미지 및 이미지 랩에서 저장 데이터.
2. 질량분석법 분석
   1. 완전한 질량 분석을 위해서는 단백질을 0.1% 개상산(FA)이 함유된 물로 최종 농도가 0.1 μg/μL로 희석한 후 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 시스템에 노출시킵니다. 이동상은 용매 A(물 내 0.1% FA)와 용매 B(아세토니트릴, ACN)로 구성되었으며, 유량은 분당 0.3 mL였습니다.
   2. m/z 범위를 300-2000으로 설정한 고해상도 쿼드루폴 비행 시간 질량분석기(Q-TOF)를 사용해 hENO1-89Klac의 분자량을 측정합니다. 모든 데이터를 MassLynx 소프트웨어를 사용하여 수집하고 처리합니다.
   3. 프로테오믹 분석을 위해서는 앞서 설명한 대로 나노플로우 액체 크로마토그래피 시스템을 분석기와 분석기가 장착된 고해상도 트라이브리드 질량분석기를 사용하여 소화된 세포 용해물을 분석합니다. 이동상은 용매 A(물 내 0.1% FA)와 용매 B(ACN/물, 8:2, v/v)로 구성되었으며, 유량은 300 nL/min이었습니다.
   4. 90분 구배를 가진 반상 C18 모세관 컬럼(75 μm x 250 mm)에 분리된 펩타이드: 3%-8% B (0-5분), 8%-28% B (5-60분), 28%-38% B (60-75분), 38%-100% B (75-80분), 100% B (80-90분). 해상도 120,000, AGC 타겟 4e5로 m/z 350-1800 MHz에서 MS1 스펙트럼을 획득합니다. MS2 스펙트럼을 생성하는 것은 고에너지 충돌 해리(HCD) 단편화(충돌 에너지 = 32%)이며, 첫 질량은 m/z 110, 해상도는 30,000, AGC 타겟은 5e4입니다.
3. 유동 세포분석
   1. 셀을 미리 냉각된 PBS 버퍼로 2번 세척한 후, 각 세척 후 3분간 1,380 x g 에서 원심분리합니다. 원심분리 후 얻은 세포 펠릿을 500 μL PBS 완충액에 재현탁한 후 부드럽게 피펫으로 혼합합니다. 세포 현탁액을 300메시 멸균 거즈로 여과한 후, 세포 집합체의 간섭을 최소화하기 위해 유동 세포 측정 튜브에 여과물을 수집합니다. 듀얼 레이저가 장착된 유동세포계를 사용해 준비된 샘플을 분석하며, 각각 405nm에서 여기, 488nm에서 해당 형광 신호를 검출합니다.

결과

우리는 먼저 대장균 단백질에 Klac의 특이성을 평가했습니다. 인간 에놀라아제 1(hENO1) 유전자는 K89 잔기에서 호박 종결 코돈(hENO1-89TAG)을 포함하도록 설계되었으며, 이 구성은 대장균에서 직교 KlacRS 및 그 동족 tRNA 쌍과 함께 발현되었습니다. 1 mM Klac 보강이 없으면 전체 길이의 hENO1은 검출되지 않았으며; 반면, 1 mM Klac을 배지에 첨가했을 때, 89 위치에서 Klac을 포함한 전장 hENO1(hENO1-89Klac)이 ~1.2 mg/L의 수율로 생성되었습니다(그림 1A). 전장 hENO1의 존재와 Klac의 선택적 도입은 anti-His 태그와 항-L-락틸 라이신 항체를 이용한 면역블롯을 통해 확인되었습니다(그림 1B-C). 정제된 hENO1-89Klac는 전기분무 이온화 비행 시간 질량분석법(...

토론

여기서는 원핵세포와 진핵세포 모두에서 단백질에 Klac을 부위특이적으로 통합하는 전략을 설명합니다. 목표 유전자의 원하는 위치에 호박 종결 코돈을 도입하고, 숙주 세포 내 직교 KlacRS/tRNA 쌍과 공동 발현함으로써, 진짜 락틸 라이신은 살아있는 세포 내 단백질에 정밀하게 통합될 수 있으며, 이는 락틸화 특이적 생물학을 탐구하는 강력한 도구를 제공합니다.

대표적인 기능성 단백질인 hENO1과 sfGFP를 모델 시스템으로 사용하여 이 워크플로우의 실현 가능성을 입증했습니다. hENO1은 2-인산글리세레이트를 포스포에놀피루브산으로 전환하는 다기능 당분해 효소입니다. 이 식물은 세포 성장, 저산소 적응, 알레르기 반응, 면역 조절 등 다양한 생물학적 과정에 관여합니다. 특히, 이 연구에서 특징지어진 K89를 포함한 종양 세포에서 ENO1의 여러 락틸화 부위가 확인되어, 전사 억제자 및 종양 억제자로서의 잠재적 역할을 강...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
6*그의 태그 재조합 단일클론 항체	단백질 기술	84814-1-RR	6×를 표적으로 하는 특이적 면역글로불린 계열; 그의 태그(재조합 단백질에서 6개의 연속된 히스티딘 잔기로 구성된 짧은 펩타이드, HHHHH)입니다.
액퀴티 UPLC 시스템	수역		초고성능 액체 크로마토그래피
항-L-락틸리신 토끼 mAb	PTM 생물학 실험실	PTM-1401RM	L-락틸 라이신(Klac)을 표적으로 하는 특정 면역글로불린 계열로, 단백질의 번역 후 변형(PTM)입니다.
클론익스프레스 II 원스텝 클로닝 키트	Vazyme	C112	간단하고 빠르며 효율적인 DNA 이음 없는 복제 기술을 기반으로 삽입 조각은 어떤 벡터의 어느 부위에든 방향성 클론이 가능합니다.
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