이 실험 프로토콜은 두부 영역에서 림프 배출을 직접적이고 정량적으로 평가할 수 있는 깊은 경추 림프관 캐뉼레이션 쥐 모델을 시연합니다. 이 모델은 중추신경계(CNS) 유래 용질, 면역 세포 집단, 그리고 CNS 표적 치료제의 분배 및 제거에 대한 상세한 분석을 지원합니다.
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이 논문에서
요약
초록
림프는 중추신경계(CNS)에서 일련의 림프관(LV)과 림프절을 통해 경추 림프관에 합류하여 흐릅니다. 체액 균형을 유지하는 것 외에도, 이 림프관들은 내인성 대사산물, 신호 전달 분자, 면역 세포, 소분자 및 고분자 약물 등 다양한 물질을 운반하는 데 핵심적인 역할을 합니다. 이는 두개내(예: 뇌)와 두개외 영역(예: 비강 및 구강) 모두에서 생리학적 항상성과 면역 기능에 매우 중요합니다. 뇌에서의 림프관 배출 기능 장애는 점점 더 다양한 신경학적 및 신경퇴행성 질환과 연관되어 있습니다. 경추 림프관 캐뉼레이션은 머리와 뇌를 배출하는 림프를 수집할 수 있게 하여 림프계를 통한 다양한 물질의 농도와 운반 속도를 측정할 수 있게 합니다. 이러한 요인들이 다양한 도전(예: 약물, 스트레스, 외상)과 질병(예: 뇌졸중, 감염, 알츠하이머병)에 반응하여 변화하는 것도 확인할 수 있습니다. 여기서는 수술 후 몇 시간 동안 림프를 채취할 수 있는 마취 심부 경추 림프관 캐뉴럴 쥐 모델을 설명합니다. 이 방법은 림프에서 관심 있는 다양한 매개변수를 측정하기 위해 영상 및 다중 오믹스 기술과 결합될 수 있습니다. 이를 통해 두경부 부위의 기초 생리학 및 병태생리학 연구와 특히 중추신경계 질환 치료를 위한 약물의 약동학/약리역학 연구가 가능해집니다.
서론
몸 전체에 분포된 림프계는 체액 항상성 유지, 면역 반응 조절, 영양소 및 신호 전달 분자 수송에필수적입니다. 말초 림프관은 림프 모세혈관에서 시작되며, 이 모세혈관은 간질액과 용질을 모아 주변의 평활근층을 가진 더 큰 집합 림프관(LV)으로 배출됩니다; 이 혈관들은 이후면역 처리를 위해 국소 림프절에 림프를 전달합니다. 두부 영역을 배출하는 림프관망은 두개내(예: 뇌)와 두개외(예: 비강 및 구강) 장기의 항상성에 중요합니다. 두개외림프망의 구조와 조직은 전신의 말초 림프관과 유사하다고 여겨지며, 두개내 림프계는 독특한 해부학적·기능적 특징을 보인다(쥐 모델의 상세 도식은 그림 1 참조)4,5. 전형적인 LV는 뇌 실질에는 없지만, 림프관 유사 기능은 뇌척수액(CSF)과 간질액(ISF) 간 교환을 촉진하는 특수 교세포 의존 림프 수송계에 의해 매개됩니다6. 교림계는 뇌 실질 내 ISF와 뇌척수액을 혼합할 수 있게 하지만, 수막, 혈관주, 비인두 LV는 뇌척수액에서 용질을 두개강 밖으로 운반합니다. 구체적으로, 수막 림프 경로는 지주막하 공간에서 뇌막 LV로 뇌척수액을 유도하여 두개내 액체 역학과 말초 림프 클리어런스를 연결합니다7. 동시에 신경주위 경로는 두개신경 및 척수 신경막을 따라 뇌척수액과 관련 용질이 배출되도록 하며, 특히 후각신경을 통해 비인두 림프신경총 5,8로 유출됩니다. 이 시스템의 동시 작업은 뇌 내 유체 항상성을 유지합니다 6,7,8. 최근에는 중추신경계 배출 림프계에 대한 이해가 진전되면서 뇌 생리학과 병태생리에 대한 새로운 통찰을 얻었습니다. 이러한 발견은 중추신경계 질환에 대한 치료 개입의 새로운 길을 제시할 수 있습니다9.
그림 1: 중추신경계 림프 정화 경로의 도식적 표현. 이 경로들은 (A) 혈관 주변 공간을 통한 교류 경로; (B) 비인두 림프 경로, (C) 수막 상위. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.
머리와 중추신경계에서 배출되는 림프관은 목에 위치한 경추 림프관으로 합쳐지며, 림프는 경추 림프절을 통과한 후 전신순환계로 들어갑니다. 경추 림프절은 목 내 해부학적 위치에 따라 표재(sCLN)와 심부 경추 림프절(dCLN)으로 분류됩니다. 경추 림프관 내 림프액 조성 변화는 뇌의 근본적인 병태생리학적 변이와 관련이 있는 것으로 여겨지며, 알츠하이머병(AD), 파킨슨병(PD), 외상성 뇌손상(TBI), 뇌졸중 후 인지 장애(PSCI)가 대표적인 예입니다9, 10, 11, 12, 13. 특히 AD에서는 아밀로이드-β(Aβ)와 인산화 타우 단백질(P-tau)의 배출 장애가 이 림프 경로를 통해 질병 진행에 기여하는 요인으로 지적되었습니다 9,10,14. 림프관을 인접 정맥과 직접 연결해 림프 배출을 재구성함으로써, 림프관 정맥 문합(LVA)은 중추신경계에서 림프관 배출을 촉진하고 AD6,15,16의 진행을 지연시키는 치료 전략으로 동물과 인간 모두에서 연구되고 있습니다. 이 경로의 중요성은 경추 림프절 수술(림프절제술)을 받은 쥐에서 관찰된 결과로 더욱 잘 드러나며, 이로 인해 경부 림프절 정치율이 감소했습니다. 제거 장애는 Aβ와 P-타우의 독성 축적을 초래하며, 이후 병리적 키나제 신호 전달 경로가 활성화됩니다. 이러한 변화는 AD와 유사한 타우오파시의 점진적 악화와 불안 및 우울증과 유사한 행동의 위험 증가와 관련이 있습니다(14,16). 더불어, 뇌척수액 기반 연구들은 뇌림프종과 같은 중추신경계 종양이 심부 경추 림프관을 통한 림프 제거를 물리적으로 방해하는 동시에 뇌척수액9, 17, 18의 종양단백질 농도를 증가시킬 수 있음을 시사합니다. 중추신경계 염증 기반 연구의 증거는 수막에서 유래한 세포가 수막 저위를 통해 경추 림프절로 이동할 수 있음을 보여줍니다 8,19. 이 세포들은 주로 림프구로 구성되며, 수지상세포, 대식세포, 내피세포 집단은 더 적습니다19,20. 염증 또는 중추신경계 손상 또는 수술 후에는 림프관 면역 세포 수송이 명확히 증가하며, 사이토카인, 화학계 및 기타 염증 매개체와 같은 면역 바이오마커 수치가 증가합니다21.
병리생리학적 역할 외에도, 경추 림프관 네트워크는 약물 처리의 중요한 통로로 점점 더 인정받고 있습니다. 이전 동물 연구들은 CNS 투여를 위해 설계된 여러 약물 제형이 뇌에서 제거될 수 있음을 보여주었으며(정도는 다양하게) 경부 림프관과 림프절을 통해 제거될 수 있으며, 이는 뇌내 투여되는 나노입자 기반 제제(예: 라모트리진, 탈라조파리브)와 생물학적 제제(예: 단클론 항체, 방사성 표지 추적 단백질)로 대표된다(22,23,24,25. 인간에서 MRI 영상 연구는 가도부트롤과 같은 특정 분자가 교림계에서 경추 림프관으로 능동적으로 수송된다는 것을 보여주었다26.
앞서 언급했듯이, 경추 림프절(sCLNs와 dCLN 모두)은 머리의 여러 부위에서 림프를 배출합니다; 그러나 각 노드가 배출하는 구체적인 두개골 영역은 여전히 명확하지 않습니다 27,28. 배수구 영역이 겹치고, 개체 간 해부학적 변이가 있으며, 종 간 구조적 차이가 동물과 인간 모두에서 경추 림프 배액 패턴 설명을 더욱 복잡하게 만듭니다29. 복잡한 경추 림프관 네트워크 내에서 심부 경추 림프관은 뇌인두 및 수막 LVs 8 하류에 위치한 뇌척수수의 주요 유출 경로로 확인되었습니다. 피하 조직에서 미세하고 가변적인 네트워크를 형성하며 개별 쥐 간에 크기와 가지가 크게 다르는 표면 경추 림프관과 비교할 때, 심부 경추 림프관은 소동물 모델에서 CNS 유래 림프를 채취하는 데 더 접근하기 쉽고 실용적인 경로를 제공합니다20,30. 따라서 현재 프로토콜은 심부 경부 림프관에서 림프를 수집하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립하는 데 중점을 두고 있습니다.
지난 10년간 수행된 연구는 중추신경계 질환 연구나 약물 분포를 분석하기 위해 자궁경부 림프액을 수집하는 데 매우 제한적입니다. 이전 연구에서는 자궁경부 림프에서 약물 농도를 측정하기 위해 분리된 조직 절편(예: 단일 dCLN 인접 절편)에서 액체를 세척하거나 압착하여 측정하는 방법을 설명했습니다.31. 그러나 특히 쥐를 포함한 소형 실험동물에서 자궁경부 림프관에서 림프를 지속적으로 채취하는 실험 프로토콜은 아직 미숙합니다. 이 프로토콜은 (쥐) 경부 림프관을 캐뉼을 수 있는 쉽고 재현 가능한 방법을 확립하여 지속적인 림프 수집을 가능하게 하고, 중추신경계 림프 수송, 면역 반응, 약물동역학을 연구합니다. 주요 장점은 정해진 시간 동안 림프 흐름과 조성을 정량화할 수 있다는 점으로, 이를 통해 약물, 지질, 지방산 및 세포 구성 요소의 정량적 측정이 가능하다. 특히, 이 모델은 혈장/뇌척수액 샘플링이나 영상 기법으로는 충분히 표현되지 않는 림프 수송 과정을 포착하여 중추신경계 약물 성향, 지질 및 영양분 수송, 면역 신호전달에 대한 새로운 통찰을 제공합니다20.
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프로토콜
이 프로토콜에 기술된 절차들은 대학 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 중국약대의 실험 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 동물 관련 시술을 시작하기 전에 관련 기관 또는 조직 윤리 위원회로부터 필요한 승인을 받으세요. 실험 동물로는 220에서 250g 사이의 수컷 스프래그-도울리(SD) 쥐가 사용된다. 동물은 허가된 실험동물 공급업체( 재료표 참조)로부터 공급받으며, 실험 시작 전까지 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있는 전용 우리에 보관됩니다. 이 프로토콜에서는 왼쪽 심부 경추 림프관 캐뉼레이션이 대표적인 예로 설명됩니다. 현재는 좌측과 우측 심부 경추 림프관 간의 해부학적 차이에 대한 증거는 제한적입니다. 이전에 완료된 실험 관찰에 따르면, 림프류 유량을 포함해 양측 간에 유의미한 차이는 관찰되지 않았습니다.
1. 안전 수칙 및 절차
- 모든 절차를 기관 생물안전 지침에 따라 수행하며, 모든 인원은 이 프로토콜을 수행하기 전에 미세수술 기법, 실험동물 취급, 화학 안전에 대한 적절한 교육을 받아야 합니다.
- 시술 내내 실험실 코트, 수술용 장갑, 보호 고글 등 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요. 휘발성 마취제(이소플루란)가 사용되어 장기간 노출 후 중추신경계 저하와 심혈관 독성을 유발할 수 있으므로, 환기가 잘 되는 환경에서 시술을 시행해야 합니다. 음식과 음료는 실험실로 반입하지 말아야 하며, 흐르는 물이 항상 쉽게 접근할 수 있도록 해야 합니다.
- 주사기 바늘, 면도날, 마이크로 가위 등 모든 날카로운 물건은 주의 깊게 다루고, 사용 후에는 지정된 날카로운 용기에 즉시 폐기하세요; 어떠한 경우에도 일회용 날카로운 물건은 재사용해서는 안 됩니다.
- 모든 생물학적 샘플(예: 채취된 림프)과 동물 체액(예: 혈액)을 잠재적 위험으로 간주하고, 모든 채취 장비를 신중히 취급하고 샘플을 수술 부위에서 멀리 떨어뜨려 두세요. 우발적인 바늘 찔림이나 유해 물질과의 피부 접촉이 발생했을 경우, 즉시 비누와 물로 해당 부위를 세척하고 기관 안전 프로토콜에 따라 사고를 보고하십시오.
2. 수술 전날 준비
- 특정 실험의 요구에 따라 쥐를 단식하거나 먹이로 주세요. 이 프로토콜은 특정 단식이나 식사 상태를 강제하지 않습니다.
- 헤파린 또는 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA)을 희석하여 최종 농도인 10 IU/mL로 조제합니다. 이 혼합물(약 0.7mL)을 30G 바늘이 장착된 1mL 멸균 인슐린 주사기에 미리 주입하여 림프관 캐뉼라(PE) 캐뉼라의 내부 표면을 미리 코팅합니다. 이 준비된 혼합물을 사용할 때까지 멸균 상태에서 보관하세요.
- 림프 샘플 채취용 캐뉼라를 준비하기 위해 PE 캐뉼라를 머리부터 꼬리까지 구성하여 준비하세요. 말단 구간에는 외경 0.5mm(OD), 내경 0.3mm(ID) 튜빙을, 중간 구간에는 0.6 mm 외경, 0.5 mm 내경 튜빙을 사용합니다.
- 주사기 바늘에 연결된 근위 부분은 2cm, 중간 부분은 40cm, 그리고 캐논레이션용 원위 부분은 8cm로 캐뉼라 구간을 자릅니다.
- 캐뉼라 조립체의 원위 끝을 약 45° 각도로 절단하고 경사면을 내어 경추 림프관에 원활하게 삽입되도록 합니다. 캐뉼라 조립체의 자세한 그림은 그림 2 를 참고하세요.
참고: 이 베벨은 림프관에 부드럽게 삽입되도록 돕고, 효과적인 단면적을 증가시켜 폐색 위험을 줄여줍니다. 성공적인 캐논리 삽입 후에는 근위부(2cm) 부위를 분리하고, 노출된 중간 부위의 노출된 근위부에서 림프를 직접 채취합니다(자세한 내용은 4.9 및 4.10 단계에 설명됨).
그림 2: 캐뉼라 조립체의 회로도(축척 기준 아님). 도표는 캐뉼라를 구성하는 데 사용된 조립된 PE 튜빙의 각 구성 요소의 치수를 보여줍니다. 왼쪽에서 오른쪽으로 조립된 캐뉼라를 각각 근위 끝, 중간 구간, 원위 끝이라고 부릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
- 증발기가 장착된 압력 용기에 액체 이소플루란을 미리 적재하여 마취 흡입 시스템을 준비하세요. 사용 전에 기밀성을 확인하고 가스 흐름이 안정적이고 일정하게 유지되도록 증기 장치의 시험 운전(프라이밍)을 수행하세요.
- 필요하다면 적합한 차량에서 시험 약물 후보를 준비하세요. 보관 중과 투여 기간 동안 제형의 무결성을 확인하기 위한 안정성 연구를 수행합니다. 필요 시 추가 제제(예: 에반스 블루와 같은 생물학적 염료)를 포함하세요.
- 멸균 마이크로 원심분리관을 미리 무게를 재고 초기 무게를 기록하여 림프 수집용 용기를 준비하세요. 각 튜브에 계획된 수집 시간대(예: 시간별 간격)에 따라 순차적으로 라벨을 붙입니다. 각 튜브에 농축 헤파린(또는 EDTA)을 첨가하고, 질소 블로우다운 증발로 용매를 제거하면, 각 튜브당 2에서 5 IU의 건조 헤파린(또는 EDTA)을 남겨 림프가 불균등하게 희석되는 것을 방지합니다.
3. 수술 직전 준비
- 각 캐뉼라의 개열성을 확인하려면 준비된 항응고제 용액으로 세척합니다. 조립된 캐뉼라의 근위 끝에 주사기를 연결하고 소량의 용액을 부드럽게 방출합니다. 용액이 원위쪽 끝에서 누출 흔적 없이 원활하게 배출되도록 하세요. 누출이 감지되면, 일반적으로 연결 지점에서 유체가 새어나가는 것으로 나타난다면, 전체 캐뉼라 조립체를 폐기하고 2.3단계에 따라 새 캐뉼라를 재구성한다.
참고: 이 단계는 캐뉼라 내부 표면에 항응고제를 동시에 미리 코팅하는 과정입니다(수술 전날에도 진행될 수 있어 캐뉼라가 하룻밤 동안 미리 코팅됩니다). - 수술 시작 약 5분 전부터 코 콘 마스크를 통해 흡입한 이소플루란을 투여하기 시작하세요. 시술 내내 마취를 유지하며, 분당 0.4에서 0.6 L/분, 20°C의 압력 하에 투여하세요. 발가락 압박 반응을 평가하여 마취 깊이를 확인하세요.
- 마취 깊이를 지속적으로 모니터링하세요. 고통이나 생리적 불안정 징후가 관찰되면 즉시 안락사시키세요.
- 쥐를 37°C로 유지한 가열된 수술용 패드 위에 누워 눕히세요. 머리를 기울이고 목을 펴며, 필요하다면 작은 지지대(베개)를 사용해 경추 부위에 노출을 극대화하세요. 마취 마스크 안에 머리를 고정하여 이소플루란이 지속적으로 투여되도록 하고, 시술 중 움직임을 최소화하기 위해 고무줄이나 수술용 테이프를 사용해 전肢를 부드럽게 고정하세요.
- 면도를 돕기 위해 경추 부위의 털을 멸균 생리식염수로 씻어내세요. 수술 부위 전체를 철저히 면도하세요(양날 안전 면도날을 사용하며), 보통 목과 쇄골 부위를 면도하여 절개 전에 털을 완전히 제거하세요(목 면도한 부위의 예는 그림 3A 참조).
- 요오드 함유제와 같은 소독제로 면도한 부위 전체를 깨끗이 청소하세요.
- 수술 부위를 2.5cm 점선으로 표시하여 초기 절개 길이를 확인하세요. 줄을 쥐 몸의 중앙선보다 약간 오른쪽에 위치시키세요. 절개 부위의 윗부분을 아래 입술에서 약 1에서 1.5cm 아래에 위치시키세요(절개 부위의 예시는 그림 3B 를 참고하며, 자를 이용해 측정을 돕습니다).
그림 3: 수술 부위 준비. (A) 절개 준비를 위해 목 부위를 면도합니다; (B) 절개 부위의 대략적인 길이와 위치, 2.5cm 점선으로 표시됨. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
4. 경부 림프관 관내 관통
- 쥐를 조작자 쪽으로 머리를 향하게 배치하세요. 경추 림프관의 직경이 비교적 작기 때문에 이 단계는 현미경을 사용하세요.
- 멸균 메스를 사용해 앞서 언급한 2.5cm 길이의 표를 따라 경추 근육의 표면층을 정중앙선과 거의 평행하게 조심스럽게 절개합니다(열린 표면 피부층은 그림 4A 참조).
- 남은 근육층, 주로 경추 근막을 부드럽게 분리하여 일반적으로 붉은 색을 띤 경동맥을 드러냅니다.
- 흉선돌과 하악하선을 철회시키고 수술 부위에서 조심스럽게 기울여 경추 림프관 위치를 확인하기 쉽게 합니다. 조직 확장기를 사용해 수술 창을 유지하고, 면봉으로 근육 조직을 일시적으로 고정하며 림프절과 관련 림프관을 찾아보세요. 조직 확장기가 전체 삽입 과정 내내 제자리에 있는지 확인하세요(조직 확장기가 설치된 상태에서 열린 수술용 창문은 그림 4B 참조).
- 경추 림프관 위치 확인(현미경 아래에서): 경추 림프관은 직경 약 0.2에서 0.5mm 정도의 불투명하고 무색 혈관으로 보이며, 경동맥과 바로 평행하게 뻗어 있습니다. 자궁경부 림프관 경로를 따라 하나 이상의 인접한 살색 dCLN이 관찰되는 경우가 많습니다(노출된 깊은 경추 림프관과 인접한 dCLN의 현미경 시점은 그림 4C 참조).
참고: 경추 림프관은 주변 조직과 매우 유사한 색을 띠며, 특히 지방 조직이 많은 쥐의 경우 이를 식별하기 위해 신중한 검사가 필요합니다. 수술 실습 목적으로(약물이나 내인성 물질의 림프 수송 연구는 제외), 수술 시작 시 목 아래에 피하 주사하여 조료가 림프를 통해 배출될 때 경추 림프관을 더 잘 볼 수 있도록 할 수 있습니다. - 둔한 겸자를 사용해 분리된 결합 조직을 부드럽게 통과시키고, 경추 림프관이 수술 영역 내에서 명확히 보이도록 핀셋을 제자리에 유지하세요.
- 경추 림프관을 주변 결합 조직과 지방 조직으로부터 둔탁 해리하여 신중하게 분리하되, 혈관이 매우 약하므로 손상을 방지하기 위해 특별히 주의해야 합니다.
- 노출된 관의 상반부에 작은 절개를 만들기 위해 마이크로 가위 한 쌍을 사용하세요. 덕트를 완전히 분리하지 마세요; 두 반쪽은 온전하게 유지되어야 합니다.
- 2.3단계에서 설명한 항응고제 용액이 미리 코팅된 준비된 캐뉼라에 부드럽게 세척하여 기포가 없는지 점검하세요. 삽입 직전에는 겸자로 캐뉼라의 원위 끝을 조심스럽게 잡아 경사면이 위쪽으로 향하도록 방향을 잡으세요. 그 후 캐뉼라를 절개를 통해 관에 약 2mm 부드럽게 밀어 넣어 머리 쪽으로 향하게 합니다(성공적인 캐뉼레이션 사례는 그림 4D 참조). 실제 삽입 깊이는 쥐 개체에 따라 다를 수 있습니다.
참고: 이 시술에서 캐뉼라 삽입이 비교적 얕기 때문에, 주변 부위에 추가로 고정점을 두는 것이 도움이 될 수 있습니다. 이는 수술용 창문에서 약 1.5cm 떨어진 곳에 가위를 사용해 작은 2차 피부 천자(구멍)를 만들어 달성합니다. 이 구멍은 이후 단계(예: 봉합이나 접착제)에서 더욱 안정화됩니다. 그림 4E는 조직 접착제 사용 맥락에서 이 단계를 보여줍니다. 캐뉼라는 구멍을 통과시켜 위치를 고정하는 데 도움을 줍니다. - 인슐린 주사기와 짧은 (2cm) 근위 부분을 나머지 캐뉼라 조립체에서 분리하세요. 그 후 림프는 더 큰 직경의 중간 마디의 노출된 근위 끝에서 직접 채취할 수 있습니다. 이 수집 구간의 원위 끝을 1분에서 2분간 관찰하세요. 캐릉이 삽입된 관에서 림프액이 눈에 띄고 느리며 꾸준히 유출되어 성공적인 캐논레이션을 확인하세요.
- 캐뉼레이션 성공이 확인되면, 림프관 절개 부위와 2차 고정 구멍 양쪽에 피펫으로 시아노아크릴레이트 조직 접착제를 소량 발라하여 고정합니다(캐뉼라 고정 시연은 그림 4E 참조). 혈관을 막거나 림프류 방해를 피하기 위해 각별히 주의하세요.
- 림프류 흐름을 몇 분간 관찰하여 안정적인 유출을 확인하세요(보통 1분 이내에 캐뉼라 끝에 눈에 보이는 비말이 형성됩니다). 확인이 되면, 수술 창문에서 조직 확장기를 조심스럽게 제거하고 하악하선을 원래 위치로 재배치하세요.
- 캐뉼라의 원위 끝에 미리 라벨이 붙은 항응고제 코팅 미세원심분리관(2.6단계 참조)을 부착하여 자유롭게 흐르는 림프를 수집합니다.
그림 4: 경추 림프관 관통. (A) 목 부위의 절개 부위; (B) 조직 확장기가 설치된 수술용 창문을 열고 하악하선이 오른쪽으로 후퇴함; (C) 경추 림프관과 현미경으로 시야 본 1개의 dCLN. (D) 성공적인 캐널레이션, 녹색 점선으로 표시됨 (현미경 뷰). (E) 절개 부위에 조직 접착제를 도포하고 피펫을 이용해 2차 피부 천자를 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
5. 수술 후 기간 및 약물 투여
- 경추 림프관 캐논레이션이 완료되면 모든 근육층을 원래 위치로 다시 위치시킵니다. 그 후 피부 절개 부위를 봉합사나 조직 접착제로 봉합하고; 일반적으로 길이 2.5cm 절개는 8바늘로 제대로 봉합할 수 있습니다(봉합으로 닫힌 수술용 창은 그림 5A 참조). 이 단계가 끝나면 앞다리에 묶인 고무줄이나 수술용 테이프를 제거하세요.
- 적절한 경로로 뇌척수액에 약물을 투여하는데, 예를 들어 뇌수조 내 주사(ICM), 뇌심실내(ICV), 요추 수막내주사(LIT) 등이 있습니다. ICM 투여를 예로 들면, 두개골 바닥에 위치한 주입 부위를 확인하자. 이 부위는 등쪽 표면에서 유일하게 보이는 부드러운 움푹 들어간 부위다. 주변 털을 필요 시 면도하여 시각화를 쉽게 할 수 있습니다(ICM 주입에 적합한 부위는 그림 5B 참조).
참고: ICM 주사 중 두개내압(ICP)을 유지하기 위해 약물 투여 전에 상당량의 뇌척수액을 제거하는 경우가 많습니다. 주사할 때는 새로 충전된 주사기를 사용하는 것이 권장됩니다. 주사기를 구부리면 투여가 더 쉬워집니다(구부린 주사기를 이용한 ICM 주사 시연은 그림 5C 참조). - 주사 후와 샘플 채취 기간 내내 체온을 유지하기 위해 쥐를 37°C로 유지한 온열 수술용 패드 위에 등을 대고 눕혀 두세요.
그림 5: 수술 후 관리. (A) 실크 봉합을 이용한 닫힌 절개 부위. (B) 주변 털이 면도된 채 시스테르나 마그나의 대략적인 위치. (C) 구부러진 바늘이 있는 인슐린 주사기를 사용하여 약물 후보의 ICM 투여. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
6. 림프 샘플 채취 및 분석
- 림프를 항응고제 코팅 마이크로 원심분리관에 지속적으로 모아, 정해진 간격(보통 매시간)에 튜브를 교체합니다. 수집한 샘플은 냉열한 상자를 이용해 얼음찜질팩과 함께 보관하세요. 마이크로 원심분리관에서 채취한 자궁경부 림프 샘플은 그림 6 을 참조하세요.
- 림프 수집 과정이 완료되면 적절한 프로토콜에 따라 인도적으로 쥐를 안락사시키십시오.
- 각 계획된 간격(시간별) 동안 수집된 림프의 양을 측정하여 림프 유량을 결정합니다.
- 적절한 분석 방법(HPLC, HPLC-MS 또는 시판 분석 키트 등)을 사용하여 림프관 내 약물(또는 관심 물질) 농도를 측정하여 림프계를 통해 중추신경계에서 약물의 제거 속도 특성을 특성화합니다.
- 측정된 약물 농도를 해당 림프부피로 곱하여 림프 약물 대량 수송을 계산합니다.
그림 6: 림프 샘플 채취. 마이크로 원심분리기 튜브에서 채취한 샘플(약 100 μL) 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.
7. 절차 후 처리 및 폐기물 처리
- 안락사된 쥐는 전문 의료 폐기물 처리팀이 수거 및 처분할 때까지 지정된 의료 폐기물 컨테이너(예: 냉장고)에 보관하세요.
- 폐기된 날카로운 물건은 다른 쓰레기와 분리하여 지정된 날카로운 용기에 모으세요.
- 실험에 사용된 다른 비날카로운 물품들(예: 면봉, 고무줄, PE 캐뉼라)은 의료 폐기물 봉투에 폐기하고, 가정이나 일반 쓰레기와 함께 버리지 마십시오. 이 가방에 날카로운 물건을 넣지 않도록 주의하세요.
- 실험실 프로토콜에 따라 남은 재사용 도구를 모두 청소하고 소독하세요.
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결과
자궁경부 림프 관식 모델을 사용해 시간별 림프유량(mL/h)의 대표적인 데이터셋을 얻었습니다(해당 차트는 그림 7 참조). 이 실험에서는 3마리(n = 3)의 연구용 쥐를 대상으로 림프를 연속적으로 마이크로 원심분리관에 수집했고, 6시간에 걸쳐 매시간 교체했습니다.
그림 7: 경부 림프류 흐름 경과. 경부 림프유량(mL/h)의 시간에 따른 대표성 데이터를 포함한 차트입니다. 표시된 데이터는 6시간 경과 시간 동안 세 번의 성공적인 실험(폐원 포함, ●)의 평균 측정값입니다. <...
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토론
이 프로토콜은 쥐의 자궁경부 림프관을 재현 가능한 방법으로 수립하여 장기간 지속적인 림프 수집을 가능하게 합니다. 충분한 미세수술 훈련을 받으면 이 수술은 효율적으로 시행할 수 있으며, 지속적인 마취로 유지되는 안정적인 생리학적 조건 하에서 일관된 림프 샘플을 얻을 수 있어 일상적인 실험 사용에 적합합니다. 숙달이 완료되면 수술 절차는 일반적으로 약 40분에서 50분 정도 소요되어 한 번의 실험 세션 내에 여러 동물을 처리할 수 있습니다. 또한, 단일 시점 샘플링과 달리 장기간에 걸쳐 연속적으로 수집하면 단백질, 약물, 면역 마커, 지질 등 CNS 유래 물질의 림프 수송을 보다 상세하게 정량화할 수 있습니다. 심부 경추 림프관은 일반적으로 중추신경계에서 유래한 림프액의 주요 운반 경로로 간주되지만, 표면 및 심부 배수 경로 간의 상대적 기여도는 병태생리학적 조건에 따라 달라질 수 있습니다27,
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공개 사항
저자들은 이 글에서 보도된 연구에 영향을 미칠 수 있는 상충하는 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
저자들은 동물 실험 수행을 지원해 주신 중국의약대학 동물실험센터의 하오정린 씨와 자오 씨에게 진심으로 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 30게이지 바늘 | 유쇼 헬스 | 카뉼라의 근위 끝(0503)과 헤파린 주사기를 연결하는 데 사용됩니다 | |
| 증기화기가 포함된 마취 디스펜서 | 윤 기기 회사 | ||
| 둔탁한 겸자 | RWD 생명과학 | F22002-10 | |
| 면봉 | 칭다오 슐츠 바이오테크놀로지 | MQ-02 | 근육 조직을 일시적으로 고정하는 데 사용되었습니다 |
| 가열 수술용 패드 | 상하이 이헝 인스트루먼트 | 차원 15 &; 20cm | |
| 헤파린 나트륨 | 상하이 알라딘 생화학 기술 | H123383 | 사용 전 희석 필요 |
| 인슐린 주사기 (1 mL) | 유쇼 헬스 | U100-1ML | 헤파린 프리 코팅에만 사용됩니다 |
| 흡입용 이소플루란 용액 | RWD 생명과학 | R510-22-10 | 증기화를 통한 마취에 사용됨 |
| 마커 펜 | 어떤 브랜드든 | 해당 없음 | |
| 마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL) | 난통 하이루이 실험 장비 | HR10003 | 림프 수집에 사용 |
| 마이크로 가위 | RWD 생명과학 | GD234BA0007925 | |
| 나일론 수술용 봉합 및 nbsp; | 상하이 이헝 인스트루먼트 | 4-0 35CM | |
| 피펫(용량 조절 가능, 측정 범위 5에서 50 & mu; L) | 드래곤 연구소 기기 주식회사 | 7030301006 | 조직 접착제 측정에만 사용됩니다 |
| 피펫 팁 | 바이오샤프 생명과학 | BS-10-T | 조직 접착 전이에만 사용되며, 특정 부피 요구 사항 없음 |
| 폴리에일렌(PE) 캐뉼라 0.5mm 외경, 0.3mm 내경 (0503) | 애니랩 과학 기기(닝보) | PE-0503 | |
| 폴리에일렌(PE) 캐뉼라 0.6mm 외경, 0.5mm 내경 (0605) | 애니랩 과학 기기(닝보) | PE-0605 | |
| 면도날 | 질레트 상하이 | Q31/0115000301C004 | 털 면도에만 사용됩니다 |
| 고무줄 | 어떤 브랜드든 | 해당 없음 | 쥐의 앞다리를 제압하는 데 사용됨 |
| 통치자 | 어떤 브랜드든 | 해당 없음 | |
| 스케이플 블레이드 (#23) | RWD 생명과학 | S31010-01 | |
| 염화나트륨(0.9%) 주입용 용액 | 스자좡 제4 제약 | H20066533 (승인 번호) | 털 헹구기에만 사용됨 |
| 스프래그-도울리 래츠 | 베이징 바이탈 리버 실험 동물 기술 | 101 | 무게 220에서 250그램, 나이 제한 없음 |
| 수술용 조명 | 베이징 허 바이오테크 | XHA011-1 | |
| 외과용 현미경 | 상하이 체웨이 광전자 기술 | SMZ755T | 기계 스테이지가 없는 해부 현미경은 수납식 스탠드를 장착할 수 있습니다 |
| 조직 접착제 | 3M 베트본드 | 1469SB | 주성분은 시아노아크릴레이트와 nbsp; |
| 조직 확장기 (Colibri) | RWD 생명과학 | R2029-04 | 확장 범위 20mm/4cm |
참고문헌
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