제2형 당뇨병의 장내 미생물군과 대사체 변화: 16S rDNA 시퀀싱과 생물정보학에서 얻은 통찰

요약

이 연구는 제2형 당뇨병(T2DM)에서 장내 미생물 다양성 감소와 대사 경로 변화를 확인하며, 단백질박테리아 증가와 유익 분류군 감소를 강조하여 미생물 불생물 형성이 T2DM과 연관되어 병태생리에 기여할 수 있음을 시사합니다.

초록

제2형 당뇨병(T2DM)의 전 세계적 증가는 특히 숙주-미생물군 상호작용과 관련된 그 근본적인 생물학적 메커니즘을 더 잘 이해할 필요성을 강조합니다. 본 연구는 새로 진단된 제2형 당뇨병 환자와 비당뇨병 매칭(NM) 그룹을 비교하여 장내 미생물 다양성, 분류학적 구성, 예측된 대사 경로를 특성화하는 것을 목표로 하였습니다. 신선한 대변 샘플은 16S rDNA 시퀀싱을 사용해 분석하였습니다. 알파 다양성(Chao, ACE, Shannon, Simpson 지수)과 베타 다양성을 계산하여 미생물 군집 구조를 평가하였습니다. 분류학적 차이는 윌콕슨 랭크합 검정과 선형 판별 분석 효과 크기(LEfSe)를 사용하여 평가하였다. 기능적 경로 예측은 KEGG와 MetaCyc 주석을 기반으로 한 미관찰 상태 재구성을 통한 군집 계통 연구(PICRUSt2)를 통해 수행되었습니다. 역분산 가중치, MR-에거 방법, 가중 중앙값 방법을 포함한 멘델 무작위화(MR) 분석을 적용하여 미생물 분류군과 T2DM 간의 유전적으로 예측된 연관성을 평가하였다. 결과는 T2DM 환자에서 낮은 Chao 및 ACE 지수로 미생물 풍부도가 감소하고, Shannon이 낮고 Simpson 지수가 높음으로 인해 다양성 구조가 변화되었으며, 이는 유의미한 조성 변화와 함께 나타났다. 프로테오박테리아의 상대적 풍부도는 증가했고, 라크노스피라세과(Lachnospiraceae)와 블라우티아(Blautia)와 같은 유익 분류군의 개체 수는 감소하는 것이 관찰되었습니다. 기능적 예측은 비산화성 펜토스 인산염 경로, 이소부탄올 생합성, L-이솔류신 생합성과 관련된 경로의 풍부도가 감소함을 나타냈다. MR 분석은 특정 미생물 분류군과 T2DM 감수성 간의 연관성을 뒷받침하는 상호 보완적 근거를 제공하였습니다. 결론적으로, T2DM은 미생물 풍부도 감소, 다양성 구조 변화, 뚜렷한 분류학적 및 기능적 변화와 관련이 있습니다. 이 발견들은 T2DM에서 장내 미생물군의 중요성을 강조하며, 마이크로바이옴 기반 바이오마커와 치료 전략의 잠재적 유용성을 지지합니다. 이러한 발견을 검증하고 근본 메커니즘을 명확히 하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.

서론

제2형 당뇨병(T2DM)은 급속한 도시화, 서구화된 식습관, 그리고 점점 더 앉아서 지내는 생활습관에 의해 전 세계적으로 가장 빠르게 성장하는 만성 질환 중 하나가 되었습니다 ^1,2. 이는 전 세계 이환율과 사망률에 주요 원인이며, 상당한 공중보건 부담을 안겨^줍니다. 유전적 감수성이 역할을 하지만, 2형 당뇨병 발생률의 급격한 증가는 환경 및 대사^{결정 요인의} 중요성을 부각시킵니다. 따라서 조절 가능한 생물학적 기전을 식별하는 것은 조기 발견 및 예방 전략을 개선하는 데 필수적입니다. 최근 발전은 장내 미생물군이 대사 항^상성의 핵심 조절 요인임을 확인했습니다. 장 내 미생물 생태계는 포도당 대사, 면역 기능, 장 장벽 완전성, 만성 저등급 염증에 영향을 미치며, 이 모든 것은 T2DM⁶의 발병기전의 핵심입니다. 이스바이시스는 비만, 인슐린 저항성, 내독혈증, 에너지 균형 변화와 연관되어 있어, 미생물 변이와 질병 진행 사이의 기전적 연관성을 시사합니다^. 또한, 단쇄 지방산, 담즙산, 분지사슬 아미노산 등 미생물 대사산이 인슐린 감수성과 숙주 대사를 조절하는 데 관여하는 것으로 알려져 있습니다⁸.

장내 미생물군이 T2DM에서 역할을 지지하는 증거가 쌓여 있지만, 대부분의 기존 연구는 관찰적 설계에 의존하여 인과관계 추론을 제한합니다. 샷건 메타게노믹스나 표적 대사체학과 같은 대안적 접근법은 더 높은 해상도의 기능적 통찰을 제공할 수 있지만, 비용, 계산 복잡성, 탐색적 또는 파일럿 규모 연구에서의 제한된 실현 가능성 때문에 제약을 받는 경우가 많습니다. 반면, 16S rDNA 시퀀싱은 비용 효율적이고 널리 채택된 미생물 군집 구성 프로파일링 방법이지만, 분류학적 해상도는 종 수준에 제한되어 기능성 대사산물을 직접 정량할 수 없습니다. 따라서 16S rDNA 시퀀싱은 탐색적 임상 코호트에 적합한 비용 효율적이고 확장 가능한 접근법으로 이 연구에 선정되었으며, 하위 기능 예측 및 보완적 분석 프레임워크와의 통합을 가능하게 하였습니다. 따라서 16S 기반 미생물 프로파일링과 생물정보학 기능 예측 및 멘델 무작위화(MR)와 같은 보완적 접근법을 통합하면 조성 관계와 잠재적 인과관계 모두를 탐구하는 균형 잡힌 틀을 제공할 수 있습니다.

특히, 새로 진단된 치료에 경험이 없는 제2형 당뇨병 환자에 대한 구체적인 데이터는 상대적으로 부족한 상태입니다. 이러한 집단에서는 미생물 변화가 약리학적 개입, 특히 장내 미생물군 구성^{과 기능을 크게} 재구성하는 것으로 알려진 메트포르민에 의해 혼동될 가능성이 적습니다. 이는 현재 문헌에서 중요한 공백을 의미하는데, 기존 연구들이 다양한 치료 노출을 가진 이질적인 환자 집단과 유전적 분석 접근법의 미생물군 프로파일링과 제한된 통합을 포함하고 있기 때문입니다.

이 맥락에서 본 연구는 16S rDNA 시퀀싱과 생물정보학 분석을 사용하여 신규 진단된 T2DM 환자와 NM 그룹을 비교하여 장내 미생물군 다양성, 분류학적 구성, 기능 경로를 예측하는 것을 목표로 했습니다. 또한, 공개된 전유전체 연관 데이터를 활용한 멘델 무작위화 방법을 적용하여 특정 미생물 분류군과 T2DM 위험 간의 유전적으로 예측된 연관성을 탐구하였습니다. 이러한 통합 분석 전략은 미생물 군집 프로파일링과 집단 수준의 유전 데이터를 통해 상호 보완적인 통찰을 제공합니다. 구체적으로, 16S rDNA 시퀀싱은 연구 집단 내 미생물 구성을 직접적으로 특성화하는 반면, 멘델 무작위화는 독립적인 코호트의 유전적 도구를 활용해 관찰된 연관성이 유전적으로 예측된 관계와 일치하는지 평가합니다. 이 통합은 관찰 마이크로바이옴 연구의 주요 한계를 해결하기 위해 미생물군과 T2DM 연관성의 견고성을 뒷받침하는 보완적 증거를 제공하고자 합니다. 따라서 이러한 접근법을 통합하는 것은 중복이 아닌 교차 검증을 제공하여 미생물군-T2DM 연관성의 해석 가능성을 강화하는 것을 목표로 합니다.

본 연구는 세 가지 측면에 초점을 맞춥니다. 첫째, 신규 진단 및 치료에 미숙한 제2형 당뇨병 환자의 장내 미생물군 변화를 평가하여 약리학적 개입으로 인한 혼란을 줄입니다. 둘째, 분류학적 프로파일링과 예측된 기능 경로를 통합하여 미생물군과 관련된 대사 변화를 시스템 수준에서 파악할 수 있게 합니다. 셋째, 관찰된 연관성이 유전적으로 예측된 관계와 일치하는지 평가하기 위해 멘델 무작위화 분석을 도입하여 방법론적 삼각측량을 제공합니다. 이러한 측면들은 순수한 기술적 연구가 아닌 미생물군 분석에 상호 보완적이고 재현 가능한 틀을 제공하며, 이 연구는 일반적으로 단일 방법 관찰 설계에 의존하고 미생물 프로파일링, 기능 예측, 유전적 추론을 통합하지 않은 이전 연구들과 구별됩니다.

프로토콜

인간 참여자가 포함된 모든 절차는 충칭 천자차오병원 윤리위원회(승인 번호 20240131)의 검토 및 승인을 받았습니다. 샘플 수집 전에 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 모든 대변 샘플과 참가자 정보는 자료표에 명시된 식별 해제 연구 코드를 사용하여 처리되었습니다.

참가자 선별 및 등록

2023년 6월부터 12월까지 충칭천자차오 병원을 방문한 신규 2형 당뇨병 환자들을 대상으로 자격 선별을 실시하였습니다. 참가자는 20세에서 65세 사이이고, 새로운 2형 당뇨병 진단을 받았으며, 신선한 대변 샘플 제공에 동의하고, 필수 병력 평가 및 임상 검사를 완료한 경우 DM 그룹에 등록되었습니다. 같은 기간 동안 모집된 건강한 자원봉사자는 비당뇨병 매칭(NM) 그룹으로 포함되었으며, 연령, 성별, 일반 인구통계학적 특성 측면에서 DM 그룹과 최대한 유사하게 매칭되었습니다. 혈액 질환, 중추신경계 질환, 활동성 류머티즘 질환, 자가면역 질환, 급성 또는 만성 위장관 감염, 만성 설사, 변비, 활동성 또는 치유 중인 위장 궤양, 염증성 장 질환, 과민성 대장 증후군, 장 결핵, 위장관 종양, 기타 악성 종양, 중증 심장기능 부전, 중증 간기능 부전, 중증 신부전, 기타 중증 대사증이 있는 참가자는 제외되었습니다 질병, 영양실조, 면역결핍, 선천성 대사 장애, 정신 질환, 진정제-최면 사용, 약물 남용. 참가자들은 변 채취 1개월 전 항생제, 산 억제제, 위장 운동 약물, 프로바이오틱스, 글루코코르티코이드 또는 면역억제제를 복용한 경우에도 제외되었습니다. 또한, 설사를 경험했거나, 위장관 수술이나 위장관 내시경을 받았거나, 대변 수거 1개월 전 생활 환경이나 식습관에 갑작스러운 변화가 있다고 보고한 사람은 제외되었습니다. 샘플 수집 전에 각 자격 있는 참가자에게 고유한 연구 코드가 할당되었습니다. 적격 코호트 중에서 12명의 신규 진단 T2DM 및 12 NM 참가자가 샘플 가용성과 시퀀싱 품질 요건에 따라 하위 16S rDNA 시퀀싱 및 마이크로바이옴 분석을 위해 선발되었습니다.

대변 샘플 채취 및 보관

각 참가자에게는 지정된 연구 코드만 적힌 멸균 대변 수집 용기가 제공되어 식별 해제를 보장했습니다. 참가자들은 배변 전에 방광을 비우어 소변 오염을 최소화하고, 변기, 소변, 소독제 또는 기타 잠재적 오염물질과 접촉하지 않고 신선한 대변을 멸균 용기에 직접 담으라는 지시를 받았습니다. 채취 직후, 약 1–2g의 대변을 멸균 일회용 샘플링 숟가락을 사용해 멸균 극저온 튜브로 옮겼습니다. 튜브는 단단히 밀봉되어 즉시 드라이아이스나 미리 냉각된 이송 용기에 넣었습니다. 모든 샘플은 수집 후 2시간 이내에 실험실로 운송되었습니다. 실험실에 도착하자 연구 코드를 검증하고 각 튜브에 누출이나 눈에 띄는 오염 여부를 검사했습니다. 모든 샘플에 대해 채취 및 보관 시간이 기록되었습니다. 대변 샘플은 이후 유전체 DNA 추출 전까지 −80°C 온도에서 보관되었습니다. 샘플은 저장 및 운송 중 완전히 냉동 상태로 유지되고 관 누출이나 외부 오염의 증거가 없을 때만 하위 분석 허용으로 간주되었습니다.

유전체 DNA 추출

대변 샘플은 −80 °C 저장 상태에서 꺼내 얼음 위에 올려놓은 후 처리되었습니다. 각 샘플은 반복되는 동결-해동 사이클로 인한 분해를 최소화하기 위해 균질화가 가능해질 때까지만 해동되었습니다. 약 200mg의 대변이 멸균 미세원심분리관으로 옮겨졌고, 대변 DNA 추출 키트에 제공된 용해 완충제는 재료표에 기재된 제조사 지침에 따라 추가되었습니다. 샘플은 30초간 격렬하게 소용돌이 돌려 완전한 균질화를 이루고, 세포 용해를 돕기 위해 실온에서 5–10분간 배양했습니다. 용해 후 샘플은 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리되었습니다. 상원액은 펠릿을 손상시키지 않고 새로운 멸균 미세원심분리관으로 조심스럽게 옮겨졌습니다. 이후 제조사 프로토콜에 따라 키트에 제공된 용출 버퍼 또는 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 유전체 DNA를 용출했습니다. 추출된 DNA는 단기 사용을 위해 −20°C, 장기 보존을 위해 −80°C에 보관되었습니다. 하류 분석에 적합하다고 판단된 DNA 샘플은 투명하고 눈에 띄는 입자가 없는 것으로 보였습니다.

DNA 품질 평가

DNA 품질은 아가로스 겔 전기영동과 형광 기반 정량을 사용하여 평가하였습니다. 1% 아가로스 겔을 전기영동 버퍼에 준비하고, 추출한 DNA 샘플을 로딩 버퍼와 혼합하여 겔 웰에 로딩했습니다. DNA 밴드가 충분히 분리될 때까지 전기영동을 시행한 후, 자외선 또는 청색광 조명 아래에서 젤을 검사했습니다. DNA 완전성은 현저한 분해나 과도한 번짐 없이 완전한 유전체 DNA 밴드가 관찰될 때 허용 가능한 것으로 간주되었습니다. 이후 DNA 농도는 형광 기반 DNA 정량 시스템을 사용하여 정량화되었습니다. 샘플은 이후 PCR 증폭에 필요한 농도로 희석되었습니다. 고품질 DNA 샘플은 일반적으로 아가로스 겔 전기영동에서 뚜렷한 밴드를 보였으며, 이후 증폭 절차에 충분히 농축되어 있었습니다.

16S rDNA V3–V4 영역의 PCR 증폭

박테리아 16S rDNA의 V3–V4 과가변 영역은 바코드 프라이머를 사용하여 증폭되었습니다. 프라이머 서열은 다음과 같았습니다: 전방향 프라이머 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′와 역방향 프라이머 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. PCR 반응은 최종 20 μL 용량의 얼음 위에 준비되었으며, 여기에는 4 μL PCR 버퍼, 2 μL 뉴클레오타이드 혼합물(2.5 mmol/L), 각 0.8 μL 순방향 및 역 프라이머(5 μmol/L), 0.4 μL 고충도 DNA 중합효소, 10 ng 주형 DNA, 그리고 부피 대비 무누클레아제 물이 포함되어 있습니다. 반응 혼합물은 피펫팅으로 부드럽게 혼합한 후 잠시 원심분리하여 튜브 바닥에서 액체를 수집했습니다. PCR 증폭은 다음과 같은 사이클링 조건을 사용하여 수행되었습니다: 95 °C에서 5분간 초기 변성, 이어서 95 °C에서 30초간 변성 25회 사이클, 55 °C에서 30초간 어닐링, 72 °C에서 30초간 확장, 마지막 72 °C에서 10분간 확장 단계. 증폭 바이어스를 최소화하기 위해 각 샘플은 3회 반응으로 증폭되었고, 동일한 샘플에서 생성된 PCR 산물들은 이후 하나의 튜브로 모였습니다. 아가로스 겔 전기영동에서 예상 크기의 투명 앰플리콘 밴드가 존재함으로써 증폭이 성공했다.

PCR 산물 검증 및 정제

PCR 제품은 2% 아가로스 겔 전기영동을 통해 검증되었습니다. 각 샘플에서 나온 결합된 PCR 산물을 겔에 적재하여 전기 영동하여 표적 증폭자 밴드가 명확히 분리되었습니다. 예상되는 암플리콘 크기에 해당하는 밴드는 깨끗한 멸균 칼날로 절단하고, 제조사의 재료표에 기재된 지침에 따라 젤 추출 키트로 정제되었습니다. 정제된 PCR 산물은 이후 용출 완충제나 무뉴클레아제가 없는 물에서 용출되었습니다. 각 정제된 PCR 산물의 농도는 형광 기반 DNA 정량 시스템을 사용하여 정량화되었고, 농도 값은 후속 라이브러리 준비를 위해 기록되었습니다. 아가로스 겔 전기영동에서 예상 앰플리콘 크기의 단일 투명 밴드로 증폭 및 정제가 성공적으로 확인되었습니다.

라이브러리 준비 및 풀링

시퀀싱 라이브러리는 제조업체의 재료표에 기재된 지침에 따라 DNA 라이브러리 준비 키트를 사용해 준비 되었습니다. 표준 라이브러리 준비 워크플로우에 따라 정제된 증폭세포에 시퀀싱 어댑터 서열이 연결되었습니다. 어댑터 리그 제품은 선택한 라이브러리 준비 프로토콜에 따라 겔 추출 또는 비드 기반 정제 방법으로 정제되었습니다. 정제된 라이브러리 제품은 적절한 조각 분포를 확인하기 위해 2% 아가로스 겔 전기영동을 사용해 평가하였습니다. 라이브러리 농도는 형광 기반 DNA 정량 시스템을 사용하여 정량화되었습니다. DNA 농도와 조각 크기를 기반으로 각 라이브러리는 샘플 간 시퀀싱 깊이의 균형을 이루기 위해 동일한 몰 농도로 정규화되었습니다. 동일한 몰 수의 개별 라이브러리를 1:1 비율로 모아 최종 시퀀싱 라이브러리 풀을 생성했습니다. 시퀀싱 전에 샘플 로딩 전에 풀된 라이브러리는 시서열 플랫폼 프로토콜에 따라 변성되었습니다. 시서열 분석에 적합하다고 판단된 라이브러리는 예상 크기 범위 내에서 명확한 조각 분포를 보였고, 하위 시퀀싱 분석에 충분한 농도를 보였습니다.

쌍 끝 시퀀싱

최종 풀링된 라이브러리는 제조사의 표준 운영 절차에 따라 쌍 엔드 시퀀싱 플랫폼에 로드되었습니다. 쌍말단 시퀀싱은 각 샘플의 미생물 다양성을 포괄적으로 특성화하기 위해 2× 250 bp 또는 2× 300 bp 런 구성을 사용하여 수행되었습니다. 시퀀싱 품질은 플랫폼에서 생성한 품질 지표를 사용하여 진행 기간 내내 모니터링되었습니다. 시퀀싱이 완료된 후, 각 샘플에 대해 원시 쌍말 FASTQ 파일을 내보내 후속 생물정보학 분석을 수행했습니다. 시퀀싱 데이터셋은 샘플당 충분한 읽기 깊이, 적절한 Q30 품질 점수, 성공적인 바코드 할당을 보여줄 때 허용 가능하다고 여겨졌습니다.

원시 서열 처리

원시 쌍말 FASTQ 파일은 미생물군 생물정보학 분석 파이프라인에 가져와 후속 처리를 수행했습니다. 서열은 각 샘플에 할당된 바코드를 기준으로 탈다중화되었습니다. 이후 품질 필터링을 통해 저품질 점수, 모호한 기준, 또는 시퀀싱 아티팩트가 포함된 읽기를 제거하였습니다. 리드 끝에 위치한 저품질 염기들은 품질 점수 분포에 따라 절단하여 전체 서열 신뢰성을 개선하였습니다. 품질 관리 후, 쌍 끝 리드를 겹치는 영역에 병합하여 전체 길이 서열을 재구성했습니다. 이후 마이크로바이옴 분석을 위해 고품질 병합된 서열만 보존되었습니다.

앰플리콘 서열 변이(ASV) 생성 및 분류학적 주석

시퀀스 잡음 제거는 DADA2 또는 디블러 등 검증된 잡음 제거 알고리즘을 사용하여 시퀀싱 오류를 수정하고 시퀀스 정확도를 향상시켰습니다. 키메라 서열은 잡음 제거 과정에서 확인되고 제거되었습니다. 각 샘플에 대해 대표적인 ASV 서열과 해당 ASV 풍부도 표가 생성되었습니다. ASV 서열의 분류학적 할당은 나이브 베이즈 분류기를 사용해 수행되었고, 분류학적 주석은 SILVA 138 참조 데이터베이스에 대해 수행되었습니다. 분류학적 풍부도 표는 문, 과, 속 수준에서 하위 분석을 위해 수출되었습니다. 최종 ASV 데이터셋에는 각 샘플에 대한 대표 서열, 개체 포도 정보, 그리고 이에 대응하는 분류학적 주석이 포함되어 있었습니다.

알파 및 베타 다양성 분석

Chao, ACE, Shannon, Simpson, Coverage 지수를 포함한 알파 다양성 지수가 샘플 내 미생물 다양성과 풍부도를 평가하기 위해 계산되었습니다. 알파 다양성 지수는 표준편차± 평균으로 표현되었습니다. 데이터 정규성은 샤피로-윌크 검정을 사용하여 평가하였다. 정규분포 변수는 DM군과 NM 그룹 간에 학생 t-검정을 사용해 비교되었고, 비정규 분포 변수는 Wilcoxon 랭크-합 검정으로 분석하였다. 이후 적절한 거리 행렬을 사용하여 샘플 간 미생물 군집 구성 차이를 평가하기 위해 베타 다양성 거리를 계산하였습니다. 주요 좌표 분석(PCoA)을 수행하여 그룹 간 미생물 군집 구조의 차이를 시각화하였습니다. 또한, 유사성 분석(ANOSIM)을 통해 집단 간 차이가 집단 내 변이보다 더 크는지 확인하고, 이에 대응하는 ANOSIM R 및 p 값이 보고되었습니다. 알파 다양성 분석은 표본 내 미생물 다양성을 반영한 반면, 베타 다양성 분석은 그룹 간 미생물 군집 구성 차이를 평가했습니다.

차별 분류학 분석

미생물 군집 구성은 문, 과, 속 수준으로 요약되었습니다. 개별 샘플과 연구 그룹 간 우세 분류군의 상대적 풍부도를 시각화하기 위해 쌓인 막대 그래프가 생성되었습니다. DM군과 NM 그룹 간 공유 및 그룹별 ASV를 비교하기 위해 팬/코어 곡선과 벤 다이어그램이 추가로 구성되었습니다. 그룹 간 분류군 풍부도 차이는 윌콕슨 랭크 합 검정을 사용하여 평가하였다. 이후 LEfSe 분석이 수행되어 집단 간 구별에 가장 크게 기여한 미생물 분류군을 식별하였습니다. 차별 분류학적 분석을 통해 DM 그룹 또는 NM 그룹에 풍부해진 미생물 분류군을 식별할 수 있었습니다.

함수 예측

PICRUSt2 또는 이에 상응하는 검증된 기능 예측 파이프라인을 사용하여 16S rDNA 시퀀싱 프로필에서 미생물 기능 경로를 추론하였습니다. ASV 풍부도 데이터는 선택된 분석 파이프라인의 요구사항에 따라 정규화되었고, 예측된 함수들은 KEGG 또는 MetaCyc 경로 주석에 매핑되었습니다. 이후 DM군과 NM 그룹 간에 경로 풍부도를 예측하여 비교하였다. 히트맵이나 기타 적절한 그래픽 접근법을 사용해 상당히 다른 경로가 시각화되었습니다. 예측된 함수는 직접 측정된 대사산물 풍부도가 아니라 추정된 미생물 대사 잠재력으로 해석되었습니다. 기능 예측 분석을 통해 그룹 간 차이가 있는 후보 미생물 경로, 특히 탄수화물 및 아미노산 대사와 관련된 경로를 식별할 수 있었습니다.

멘델 무작위화 분석

장내 미생물군에 대한 유전체 연관 연구(GWAS) 요약 통계는 공개된 데이터셋에서 얻어졌습니다.¹⁰. NHGRI-EBI GWAS 카탈로그(https://www.ebi.ac.uk/gwas/)에서 GCST90032172부터 GCST90032644까지의 등록 번호를 사용하여 미생물 분류군에 대한 유전체 유의미한 연관 데이터를 수집하였습니다. 추가 메타게놈 데이터는 유럽 유전체 현상 아카이브(연구 ID: EGAS00001005020)를 통해 FINRISK 2002 코호트에서 접근되었습니다. 제2형 당뇨병에 대한 GWAS 요약 통계는 NHGRI-EBI GWAS 카탈로그(등록번호: ebi-a-GCST006867)에서 수집되었습니다. 미생물 분류군과 관련된 유전적 변이는 미리 정의된 통계 임계값에 따라 도구 변수로 선정되었고, 연관 불균형 변이는 제외하였다. 노출 및 결과 데이터셋을 조화시켜 대립유전자 방향성을 일관되게 했습니다. 이후 멘델 무작위화 분석이 주요 분석 접근법으로 역분산 가중(IVW) 방법을 사용해 수행되었습니다. 민감도 분석은 MR-에거 및 가중 중앙값 방법을 사용하여 수행되었습니다. 기기 강도는 F-통계량을 사용해 평가했으며, 기기 변수 간의 이질성은 코크란 Q 검정을 사용해 평가하였습니다. 수평 다증성은 MR-Egger 인터셉트 테스트를 사용하여 검사하였다. 여러 비교를 고려하기 위해 본페로니 보정이 적용되었다. 멘델 무작위화 결과는 명확한 인과관계 증거보다는 유전적으로 예측된 연관성으로 해석되었습니다.

데이터 출력 및 종료

최종 분석 결과물로는 ASV 풍부도 표, 분류학적 구성 플롯, 알파 다양성 지표, 베타 다양성 분석, 차등 분류학 결과, 예측된 기능 경로 프로필, 멘델 무작위화 추정치가 포함되었습니다. 시퀀싱 데이터셋 내 모든 표본 식별자는 해당 식별 해제된 연구 코드와의 일치를 보장하기 위해 검증되었습니다. 원시 시퀀싱 파일, 처리된 ASV 테이블, 통계 출력, 도표 소스 파일이 하위 분석 및 데이터 관리를 위해 보관되었습니다. 고품질 시퀀싱 데이터, 분류학적 프로필, 다양성 지표, 예측된 기능 경로 분석, 멘델 무작위화 결과가 성공적으로 생성되고 검증되면서 프로토콜은 완성된 것으로 간주되었습니다.

결과

최초 선별 임상 코호트의 기초 인구통계학적 및 임상 특성은 표 1에 제시되어 있습니다. 12명의 신규 진단 T2DM과 12명의 NM 참가자로 구성된 대표 하위군이 16S rDNA 시퀀싱과 하위 마이크로바이옴 분석을 위해 선정되었습니다.

시퀀싱 깊이 평가

섀넌 지수를 계산하고 희석 곡선을 그려 시퀀싱 깊이를 평가하였습니다. 모든 샘플에서 총 1,064,930개의 서열이 검출되었으며, 4,770개의 ASV를 포함해 높은 군집 풍부도를 나타냅니다. 모든 곡선이 평평하게 처리되어 시열분석 데이터 양이 충분하며 샘플 내 주요 박테리아 군집을 반영함을 시사합니다(그림 1).

미생물(알파) 다양성 분석

토론

최근 몇 년간 인간 마이크로바이옴, 특히 장내 미생물군이 숙주 대사, 면역 조절, 질병 발병에 복잡하고 영향력 있는 요인으로 부상했습니다. 건강한 숙주에서는 장내 미생물군이 면역 항상성과 장 장벽의 완전성에 기여합니다^. 불균형은 대사 장애, 자가면역 질환, 악성 종양 등 다양한 병리학적 상태와 연관되어 있습니다^{12, 13, 14, 15, 16}. 장내 미생물군 구성의 변화도 T2DM 환자에서 관찰되었으며, 이는 미생물 불균형이 질병 발병과 관련이 있음을 시사합니다^12,17

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
16S rRNA Primers (V3–V4)	Sangon Biotech	Custom	박테리아 16S 영역에 대한 범용 프라이머
80 °C Freezer	Haier Biomedical	DW-86L626	장기 샘플 보관
Agarose Gel System (Sub-Cell GT)	Bio-Rad	170-4401	PCR 제품 검증
AMPure XP Magnetic Beads	Beckman Coulter	A63880	DNA 정제 및 크기 선택
Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E)	MP Biomedicals	116913050	미생물 세포의 기계적 용해
Bioinformatics Workstation	Dell	Precision 7920	QIIME2 및 R을 사용한 데이터 분석
DADA2 파이프라인	Bioconductor	버전 1.28	시퀀스 노이즈 제거 및 ASV 생성; https://benjjneb.github.io/dada2
Deblur	QIIME2	버전 2023.5	시퀀스 노이즈 제거 및 오류 수정; https://docs.qiime2.org
European Genome-Phenome Archive	EMBL-EBI	EGAS00001005020	공개 메타게놈 데이터세트 저장소; https://ega-archive.org
GWAS Catalog	NHGRI-EBI	Accessions GCST90032172–GCST90032644	공개 게놈 전체 연관성 요약 통계 데이터베이스; https://www.ebi.ac.uk/gwas
Illumina MiSeq Sequencing System	Illumina	SY-410-1003	고처리량 시퀀싱 플랫폼
KEGG 데이터베이스	Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes	릴리스 107	기능적 경로 주석 데이터베이스; https://www.genome.jp/kegg
MetaCyc 데이터베이스	SRI International	버전 27.1	대사 경로 데이터베이스; https://metacyc.org
Microcentrifuge	Eppendorf	5424R	샘플 준비용 냉각 원심분리기
Nextera XT Library Prep Kit	Illumina	20018705	시퀀싱용 라이브러리 준비
PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix)	Takara Bio	RR350A	고충실도 PCR 용
PCR 열 주기기	Bio-Rad	T100	PCR 증폭 장치
PICRUSt2	PICRUSt2 개발 팀	버전 2.5.2	16S rDNA 시퀀싱 데이터로부터 기능적 경로 예측; https://github.com/picrust/picrust2
QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit	QIAGEN	51504	대변 샘플로부터 DNA 추출
QIAquick Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704	아가로스 겔로부터 DNA 정제
Qubit Fluorometer	Thermo Fisher Scientific	Q33226	DNA 정량
R 소프트웨어	R Foundation for Statistical Computing	버전 4.3.1	통계 분석 및 멘델 무작위화 분석; https://www.r-project.org
SILVA 138 데이터베이스	SILVA ribosomal RNA 데이터베이스 프로젝트	릴리스 138	분류학적 주석을 위한 참조 데이터베이스; https://www.arb-silva.de
Stool Collection Tube	Sarstedt	76.9923.001	무균 대변 시편 수집 튜브
Stool DNA Kit	Omega	D4015-02	DNA 추출 키트
TwoSampleMR 패키지	MR-Base	버전 0.5.7	R에서의 멘델 무작위화 분석; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR

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