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이 연구는 화중과학기술대학교 동지 의과대학 리위안 병원 윤리위원회의 승인을 받았습니다 [승인 번호: 2026IEC(RYJ016)]. 모든 환자는 사전 동의를 제공했으며, 임상 샘플의 수집 및 사용은 헬싱키 선언의 관련 윤리 지침을 준수하였습니다. 이 연구에 사용된 주요 실험 재료와 기기는 재료표에 나열되어 있습니다.
임상 조직 샘플 채취 및 CDCP1 발현 검출
2019년 1월부터 2019년 12월까지 우리 병원에서 비인두암 진단을 받은 7명의 환자로부터 수술 조직 샘플을 수집하였습니다. 동시에 비염 환자 6명의 비강 조직 샘플을 대조군으로 채취하였다. 모든 조직 샘플은 수집 후 즉시 액체 질소에 냉동되어 이후 RNA 추출을 진행했습니다.
RNA 추출 및 실시간 정량적 PCR 검출
총 RNA는 제조사의 지침에 따라 조직 샘플에서 추출되었습니다. 각 샘플마다 50–100 mg의 조직을 조직 균질제를 사용해 1mL 추출 시약에 얼음 위에서 처리했습니다. 균질화는 30초간 수행되었고, 조직이 완전히 파괴되도록 3회 반복되었다. 조직 파열 후 각 용해액에는 200 μL의 클로로포름이 투여되었습니다. 관들은 15초간 소용돌이로 격렬하게 흔들렸고, 3분간 실온에 보관된 후 4°C에서 12,000 × g 에서 15분간 회전시켜 상을 분리했다. 투명한 수층은 간기를 방해하지 않고 제거하여 새로운 튜브로 옮겼습니다.
이 수용 분획에서 1:1 부피 비율로 이소프로판올을 첨가하여 RNA를 회수했습니다. 상온에서 10분간 배양한 후, 샘플은 12,000 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 RNA를 펠릿으로 만들었습니다. 상원액은 버려졌고, 펠릿은 75% 에탄올 1mL로 한 번 헹구었습니다. 7,500 × g에서 4 °C에서 5분간 두 번째 원심분리 과정을 거친 후, 에탄올 세척액이 제거되었습니다. RNA 펠릿은 실온에서 5–10분간 자연 건조한 후 RNase 무첨가 물 20 μL에 재현탁했습니다. RNA 양과 순도는 분광광도측정법으로 결정되었습니다.
cDNA 제조를 위해 역전사를 위해 총 RNA 1 μg가 사용되었습니다. 반응은 37°C에서 15분간 수행된 후 85°C에서 5초간 가열되었다. 이후 TB Green Premix Ex Taq II를 이용한 실시간 PCR 시스템에서 정량적 실시간 PCR(qPCR)이 수행되었습니다. 각 20 μL 반응에는 2 μL cDNA 주형, 0.4 μmol/L 양방향 및 역방향 프라이머, 10 μL SYBR 그린 프리믹스, 그리고 뉴클레아제 무첨가 물이 포함되어 있었습니다. 증폭 프로토콜은 95°C에서 30초간 변성으로 시작되었습니다. 이후 40회 사이클이 이어졌으며, 각 사이클은 5초당 95°C, 어닐링/연장 시 30초 동안 60°C로 구성되었습니다. 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있습니다.
CDCP1 단백질 발현의 면역조직화학적 검출
조직 표본은 먼저 4% 파라포름알데히드에 24시간 고정되었고, 이후 표준 탈수, 파라핀 박출, 4 μm 두께의 절편 준비가 진행되었습니다. 파라핀 절편은 자일렌으로 처리되어 파라핀을 제거하고, 등급 에탄올 용액으로 순차적으로 재수화했습니다. 항원 차단을 위해 슬라이드는 시트레이트 버퍼(pH 6.0)에 넣고 용액이 끓은 후 압력솥에서 3분간 가열했습니다. 내인성 과산화효소 활성은 절편을 3% 과산화수소에 10분간 노출시켜 억제하였다.
내인성 효소 활성을 차단한 후, 절편들은 4°C에서 하룻밤 동안 배양했으며, 항CDCP1 1차 항체는 1:200 비율로 희석되었습니다. 다음 날, 슬라이드를 상온에서 30분간 고추냉이 결합 2차 항체로 처리하였다. 신호 시각화는 DAB 기판 키트를 사용하여 수행되었고, 이후 절단 부위를 헤마톡실린으로 염색하였습니다. 마지막으로 슬라이드를 탈수하고 장착한 후 광학 현미경으로 검사했습니다.
세포 배양 및 그룹화
CNE2 및 HK1 인간 비인두암 세포는 고포도당 DMEM에 10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 유지하였다. 세포는 5% CO₂가 포함된 인큐베이터에서 37°C에서 배양되었습니다. 세포가 70%–80% 합류에 도달하면 다음 그룹에 따라 형질전환이 이루어졌습니다: 대조군(Control): 빈 벡터 또는 음성 대조군 siRNA로 형질전환; CDCP1 과발현군(CDCP1-OE): CDCP1 과발현 플라스미드로 형질전환; CDCP1 침묵 그룹(si-CDCP1): CDCP1 siRNA로 형질전환; 구조 실험군(CDCP1-OE + U0126): CDCP1 과발현을 근거로 ERK1/2 특이적 억제제 U0126(10 μmol/L)으로 48시간 동안 처리됨. 과발현.
형질전환은 제조사의 지침에 따라 진행되었습니다. 세포는 형질전환 24시간 전에 6웰 플레이트에 2×10개의 5 세포/웰에 플레이트링되었으며, 각 웰에는 2mL의 항생제 무첨가 배지를 포함하였습니다. 배양 양이 약 70% 합류에 도달했을 때 형질전환이 시작되었습니다. 배양 배지를 제거하고 신선한 혈청 무첨가 배지로 교체했습니다. 각 웰마다 5 μL 형질전환 시약과 별도로 2 μg 플라스미드 DNA 또는 100 pmol의 siRNA를 준비했으며, 각 구성 요소는 환원 혈청 함유 배지 250 μL에 희석되었습니다. 두 혼합물 모두 실온에서 5분간 보관했습니다. 희석된 핵산과 형질전환 시약을 결합하여 상온에서 20분간 방치하여 형질전환 복합체를 생성했습니다. 이 복합체들은 세포에 점적 단위로 첨가되어 웰 전체에 부드럽게 분포한 후 세포와 함께 6시간 배양했습니다. 배양 기간이 끝나면 형질전환 혼합물을 제거하고, 세포에 10% FBS가 포함된 완전한 배지를 공급했습니다.
세포 증식 분석
형질전환 후 48시간, 각 그룹에서 CNE2와 HK1 세포를 96웰 플레이트에 3× 103 셀/ 웰 밀도로 시딩하고, 웰당 100 μL의 배지와 5개의 복제 웰을 사용했습니다. 세포를 24시간, 48시간 또는 72시간 배양한 후, 각 웰에 5 mg/mL의 MTT 용액 10 μL을 첨가했습니다. 판은 다시 37°C에서 5% CO₂와 함께 4시간 더 배양했습니다. 이 배양 후 배양 상청액은 조심스럽게 버려졌고, 각 웰에 100 μL의 디메틸 설폭산(DMSO)을 첨가하여 포름잔 결정체를 용해했다. 판은 완전히 용해되도록 10분간 교반되었다. 이후 마이크로플레이트 리더기로 570nm 파장에서 630nm를 기준 파장으로 사용하여 흡광도를 기록했습니다.
아폽토시스 활성 분석
형질전환 후 48시간 후, 각 그룹에서 CNE2 세포를 수집하였고, 제조사 지침에 따라 카스파제-3 활성 분석 키트를 사용해 카스파제-3 활성을 검출하였습니다. 총 100 μL의 용해 버퍼를 10×6 개 세포에 첨가하고, 얼음 위에 15분간 용해한 후 12,000 × g에서 4 °C에서 10 분간 원 심분리했습니다. 생성된 상정액은 후속 분석을 위해 옮겨졌습니다. 카스파제-3 분석의 경우, 각 웰은 50 μL 반응 버퍼와 5 μL 카스파제-3 기판(DEVD-pNA)을 투여했습니다. 이후 플레이트는 37°C에서 2시간 동안 유지되었고, 마이크로플레이트 리더기로 405nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다.
서부 블롯 분석
형질전환 후 48시간경에 각 실험군에서 CNE2와 HK1 세포를 채취하여 단백질 추출을 진행했습니다. 세포는 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 버퍼에서 파손하고 30분간 얼음 위에 보관했습니다. 생성된 용해액은 12,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리한 후 상청액 분획을 수집했습니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트로 측정하였습니다.
웨스턴 블롯 분석을 위해 각 샘플에서 총 단백질 30 μg를 5배 로딩 버퍼와 혼합하여 100 °C에서 10분간 가열하여 단백질을 변성시켰습니다. 샘플은 120V 10% SDS-PAGE 겔에 90분간 분리된 후, 300 mA 일정 전류의 PVDF 막에 90분간 옮겨졌습니다. 이식 후에는 5% 무지방 우유로 실온에서 1시간 동안 막을 막았습니다.
막들은 CDCP1(1:1,000), E-카데린(1:1,000), 비멘틴(1:1,000), p-ERK1/2(1:2,000), ERK1/2(1:1,000), GAPDH(1:5,000)에 대한 1차 항체와 함께 4°C에서 하룻밤 배양하였습니다.
다음 날에는 막을 TBST에서 3번 헹구었으며, 각 세척은 10분간 지속되었습니다. 그 후 고추냉이 과산화효소 결합된 2차 항체에 실온에서 1시간 노출되었습니다. 추가로 세 번의 TBST 세척 후, 단백질 신호는 ECL 화학발광 기질을 사용해 시각화되었습니다. 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어로 측정되었고, GAPDH가 정규화 제어로 사용되었습니다.
통계 분석
모든 실험은 독립적으로 3회 수행되었습니다. 결과는 표준편차(SD)± 평균으로 제시됩니다. 여러 그룹 간 차이는 일방향 분산 분석(ANOVA)으로 평가되었으며, 투키의 방법은 쌍별 사후 비교에 사용되었습니다. P-값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.