전사체 분석 결과 아토피 피부염 병변에서 미토콘드리아 주도 소그룹이 드러난다

Yingyao Yu; Yuanyuan Shang; Xinhong Ge; Lingdi Dong; Kexin Li

doi:10.3791/70240

Research Article

전사체 분석 결과 아토피 피부염 병변에서 미토콘드리아 주도 소그룹이 드러난다

DOI:

10.3791/70240

⸱

May 26th, 2026

Yingyao Yu¹ , Yuanyuan Shang¹ , Xinhong Ge¹ , Lingdi Dong¹ , Kexin Li¹

¹Department of Dermatology, General Hospital of Ningxia Medical University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아토피 피부염(AD)은 분자적으로 이질성이 높은 만성 염증성 피부 질환입니다. 이 연구는 미토콘드리아 유전자 발현과 면역 침투의 차이에 의해 구동되는 두 가지 전사체적으로 구별되는 AD 아그룹을 확인하고, 네 개의 허브 유전자가 환자 층화의 잠재적 바이오마커임을 밝혀낸다.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아토피 피부염(AD)은 전 세계적으로 흔하고 만성적인 염증성 피부 질환입니다. 임상적 이질성과 복잡한 분자 기전은 효과적인 치료법 개발에 큰 도전 과제를 제기합니다. 병변 피부 전사체 데이터를 이용해 AD의 분자 이질성을 탐구하고, 생물학적 및 면역 프로필을 특성화하며, 분화의 핵심 유전자를 규명하는 것. 차등 발현 유전자는 DESeq2를 사용하여 확인되었고, 이후 각각 GSEA와 WGCNA 를 통한 경로 및 공동 발현 분석이 이루어졌습니다. 미토콘드리아 관련 유전자는 DEG와 WGCNA 모듈을 MitoCarta3.0 데이터베이스와 교차시켜 추출했으며, GO 및 KEGG 농축을 통해 기능적 관련성을 평가하였습니다. 허브 유전자는 단백질-단백질 상호작용 네트워크 분석을 통해 확인되었으며, 이후 분류 모델을 구축하는 데 사용되었습니다. 전사 조절 인자는 hTFtarget을 사용하여 예측되었고, 면역 세포 침투는 CIBERSORT를 사용하여 정량화되었습니다. 두 개의 분자 하위 그룹이 확인되었습니다. 클러스터 1은 세포 신호 전달과 부착 경로가 풍부했으며, 클러스터 2는 산화 인산화 및 프로테아좀 관련 과정의 상향 조절을 보였다. 에너지 대사에 주로 관여하는 총 85개의 미토콘드리아 관련 유전자가 클러스터 간에 차별적으로 발현되었습니다. PPI 네트워크 분석을 통해 클러스터 1에서 유의하게 상향 조절된 네 개의 허브 유전자(BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2)가 확인되었습니다. 허브 유전자 기반 분류기는 강한 구별력(곡선 아래 면적> 0.7)을 보여주었습니다. 예측된 주요 전사 조절 인자로는 ATF3, BRD2, BRD4, CEBPA가 포함되었습니다. 면역 프로파일링 결과, 클러스터 1에서 조절 T 세포 침윤이 더 높았고, 클러스터 2에서 난포 보조 T 세포가 증가하는 것으로 나타났습니다. 본 연구는 분자적·면역학적으로 구별되는 두 가지 AD 아형을 밝혀내며, 이들은 미토콘드리아 기능과 면역 미세환경 신호의 차이를 특징으로 합니다.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아토피 피부염(AD)은 흔하고 만성적인 염증성 피부 질환으로, 어린이의 최대 20%, 성인의 10%에 영향을 미칩^니다. 심한 가려움과 반복적인 습진 병변이 특징입니다². 임상적으로 AD는 다유전자 감수성(예: FLG 기능 상실 돌연변이), 면역 조절 장애, 저습도 및 미생물 불생물 노출과 같은 환경 노출의 역동적 상호작용에서 발생합니다^. AD는 건선과 일부 병태생리학적 특징을 공유하지만, 임상 증상은 상호 배타적이며, 공유 경로에서 유전적 영향과 면역 변화가 뚜렷하게 나타납니다.

AD는 다양한 환자군과 질병 증상에 따라 다양한 전사체 프로필을 특징으로 하는 이질적인 질병입니다^. 피부 조직과 말초 혈액 단핵세포의 통합 분석 결과, 홍반과 구두와 같은 임상적 특징이 국소 피부와 전신 면역 반응 간의 상호작용을 반영하는 뚜렷한 면역학적 특징과 연관되어 있음을 보여주^{었습니다.} 대규모 전사체 연구는 IL-13 경로가 AD 발병 기전에서 중요한 역할을 하는 점을 더욱 강조하며, AD는 건선보다 더 큰 분자 이질성을 보이며, 유전자 발현 패턴의 변이가 질병의 중증도, 발병 연령, 유전적 배경과 연관되어 있습니다 ^5,7. 이러한 차이점은 AD 발병 기전의 복잡성과 연구 및 치료에서 개인 맞춤형 접근의 필요성을 강조합니다.

미토콘드리아 단백질은 산화 스트레스 조절 장애와 대사 경로를 통해 AD 병인에 중요한 역할을 합니다. 연구들은 비병변성 AD 각화세포에서 미토콘드리아 복합체 I 및 II 활성이 증가하여 장쇄 지방산의 과도한 산화와 ROS 생성 증가를 촉진하여 표피 장벽 기능 장애를 증가시키는 것으로 밝혀졌습니다 ^8,9. 동시에 프로테오믹 분석은 AD 표피에서 감소된 NRF2-항산화 경로 단백질과 미토콘드리아 성분을 확인하여 산화 스트레스 해상도를 낮춥니다¹⁰. 미토콘드리아 DNA 손상은 염증 반응에 추가로 기여하며, 미토콘드리아 표적 항산화제를 사용하는 중재법은 ROS^11,12를 완화하여 표피 항상성을 회복하는 데 효과적임을 보여줍니다. 이 발견들은 미토콘드리아 단백질이 AD 병리의 원인이자 잠재적 치료 표적임을 강조합니다.

최근 AD의 전사체 분석은 그 유전적 구조와 분자 이질성에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 최초의 RNA 시퀀싱 프로파일링에서 TREM-1 경로와 IL-36 사이토카인¹³의 발현이 증가한 것이 밝혀졌습니다. 유전자 발현 프로필을 기반으로 한 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석은 HSPA4, LCE3E, LCE3D 등 염증 반응과 각화를 조율하는 뚜렷한 분자 모듈과 허브 유전자를 추가로 밝혀내어 잠재적 치료 표적을 강조했습니다¹⁴. 이 연구들은 질병 예측을 정교하게 하고 AD의 복잡한 기초를 밝히는 데 있어 다조직 전사체학과 다유전자 위험 모델링의 가치를 강조합니다. 그러나 기존 연구들은 주로 전체 AD 전사체에 초점을 맞추었으며, 분자 하위 그룹 정의에서 미토콘드리아 유전자의 역할을 구체적으로 해결하지 못했습니다. 본 연구는 여러 GEO 데이터셋을 통합하여 합의 군집 기반 AD 하위군을 식별하고, 차별 발현 유전자, WGCNA 모듈, 엄선된 미토콘드리아 유전자 카탈로그를 체계적으로 교차시켜 하위 그룹 정체성을 정의하고 새로운 바이오마커로 활용될 수 있는 허브 미토콘드리아 유전자를 정확히 찾아내는 방식으로 이전의 전사체 분석을 넘어선 것입니다.

병변성 AD 피부가 미토콘드리아 유전자 발현의 차이를 특징으로 하는 분자적으로 구별되는 전사체 소그룹을 보유하고 있으며, 이는 AD의 임상 이질성을 뒷받침할 수 있다는 가설을 제기합니다. 이를 검증하기 위해 본 연구는 발표된 연구에서 얻은 RNA 시퀀싱 데이터를 통합하고, 266명의 AD 환자의 병변 피부 샘플의 유전자 발현 데이터를 수집하였습니다. 분자 하위 그룹은 유전자 발현의 합의 군집을 기반으로 확인되었고, 두 분자 하위 그룹 간의 유전자 발현을 비교하였습니다. 이 차이를 유발하는 유전자들은 세포 신호전달과 산화적 인산화에서 기능 풍부도를 보입니다. 더 나아가 두 분자 그룹을 구분하는 미토콘드리아 유전자를 조사했고, 단백질-단백질 상호작용 네트워크 내에서 핵심 허브 유전자가 확인되었습니다. 이 발견들은 AD 질환의 유전적 이질성을 강조하고, AD병리에서 미토콘드리아 단백질의 역할에 대한 지식을 확장시켰습니다.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 연구는 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터베이스에서 공개된 유전자 발현 데이터셋을 사용했습니다. 환자 식별 가능한 데이터는 접근하지 않았으며, 새로운 환자 샘플도 수집되지 않았습니다. 따라서 공개된 데이터에 대한 이 2차 분석에는 기관심사위원회(IRB)의 승인이나 환자 동의가 필요하지 않았습니다. 사용되는 소프트웨어와 데이터베이스는 재료표에 나열되어 있습니다.

1 데이터 및 자원

아토피 피부염(AD) 환자의 전사체 데이터는 GEO 데이터베이스에서 얻었으며, 여기에는 GSE121212 (N = 55)⁵, GSE157194 (N = 57)¹⁵, GSE193309 (N = 111)¹⁶ , GSE277961 (N = 43)¹⁷ 연구가 포함되어 있습니다. 모든 데이터셋은 병변 피부 생검에서 얻은 원시 또는 사전 정규화 카운트 데이터를 포함하고 있었습니다. 원시 카운트 매트릭스를 다운로드하여 연구 간에 통합하였습니다. 교차 연구 배치 효과는 ComBat-seq 방법(sva R 패키지, v3.44.0)을 사용하여 네 개의 GEO 데이터셋 간 발현 프로필을 조화시키기 위해 후속 분석 전에 보정하였습니다. 네 가지 데이터셋 모두 인간 피부 생검 샘플에 대한 RNA-seq를 기반으로 하며, 연구별 파이프라인을 통해 인간 참조 유전체 GRCh38과 정렬되었습니다. 유전자 수준 발현 정량은 Ensembl 유전자 주석(v105)을 사용하여 수행되었습니다.

2 합의 군집

ConsensusClusterPlus R 패키지(v1.64.0)¹⁸ 을 사용하여 AD 환자의 병변 피부 샘플 266개를 전사체 프로필에 따라 층화하는 비감독 합의 군집 분석이 수행되었습니다. 클러스터링 전에 모든 연구의 원시 계수 데이터가 병합되었고, limma 패키지의 removeBatchEffect 함수를 사용해 교차 연구 배치 효과를 보정했습니다. 유전자 발현 데이터는 DESeq2를 사용해 분산 안정화 변환(VST)을 처리하고, 변이가 가장 큰 상위 5,000개 유전자를 유지하도록 필터링했습니다. 클러스터링은 계층적 클러스터링을 사용해 Pearson 상관과 평균 연관성을 사용하여 1,000회 반복에 걸쳐 샘플의 80%를 서브샘플링했습니다. 최적의 군집 수(k는 2에서 10 범위)는 합의 누적 분포 함수(CDF), 델타 영역 플롯, 군집-합의 점수를 평가하여 결정되었습니다. 결과된 클러스터는 합의 히트맵과 PCA를 사용하여 검증되었으며, 하위 생물학 및 임상 분석에 활용되었습니다.

3 차별 유전자 발현 분석

유전자 발현 수준은 DESeq2 R 패키지(v1.46.0)를 사용하여 분자 하위 그룹 간 비교되었다¹⁹. 원시 계수 데이터를 입력하여 유전자별 분산을 추정하고 음의 이항 모델을 적합시켰습니다. Wald 검정을 통해 차별발현 유전자(DEGs)를 확인하였고, 결과는 조정된 p-값 0.01과 절대 log² 변화 <> 1의 유의성 임계값을 사용해 필터링되었습니다.

4 유전자 집합 풍부화 분석

유전자 집합 풍부 분석(GSEA)은 clusterProfiler R 패키지(v4.12.6)²⁰을 사용하여 수행되었습니다. 모든 유전자는 차등 발현 분석에서 log² 중수 변화로 순위를 매겼으며, GSEA 함수는 eps = 0, minGSSize = 10, maxGSSize = 500 매개변수로 적용되었으며, 다른 설정은 기본값으로 유지되었습니다. 풍부화는 MSigDB Hallmark 유전자 집합에 대해 수행되었습니다. 각 분자 클러스터(클러스터 1 및 클러스터 2)에 대해, 명목 p-값과 정규화 농축 점수(NES)를 기준으로 상위 세 가지 농축 경로가 선정되었습니다. 결과는 GseaVis R 패키지(v0.1.0)²¹을 사용하여 시각화되었습니다.

5 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석

WGCNA는 R 패키지 WGCNA (v1.73)²²를 사용하여 전사체 아형 동일성과 관련된 유전자 발현 모듈을 식별하기 위해 AD 환자의 유전자 발현 프로필을 수행했습니다. 유전자는 모든 샘플에서 가장 높은 분산을 가진 상위 75%를 유지하도록 필터링되었습니다. 부호 있는 공동표현 네트워크는 1에서 30까지 선택된 소프트 임계값 배정 몫을 사용하여 스케일 프리 토폴로지를 근사하도록 구성되었습니다. 유전자 모듈은 계층적 군집화와 동적 나무 절단을 통해 확인되었습니다. 모듈-형질 연관성은 공동 발현된 모듈 고유유전자를 분자 하위 유형 라벨과 상관관계로 연구했으며, 분자 하위 유형과 유의미한 상관관계(p < 0.05)를 보이는 모듈을 선정하여 후속 분석을 수행하였습니다.

6 AD 분자 하위 그룹의 미토콘드리아 단백질

DEGs 및 WGCNA 모듈 내 미토콘드리아 관련 유전자를 식별하기 위해, 이 유전자 세트는 MitoCarta3.0²³에서 선정된 미토콘드리아 단백질 목록과 겹쳤습니다. 교차하는 유전자들은 AD 질환 맥락과 관련된 추정 미토콘드리아 단백질로 간주되었습니다.

7 유전자 온톨로지와 KEGG 풍부 분석

분자 하위 그룹을 구분하는 주요 세포 기능과 생물학적 과정을 규명하는 것. 클러스터프로파일러를 사용하여 미토콘드리아 관련 유전자에 대해 GO 및 KEGG 풍부 분석을 수행하였습니다. GO 농축은 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC), 분자 기능(MF) 범주별로 OrgDb = "org."를 사용하여 enrichGO 함수를 사용하여 별도로 수행되었습니다. Hs.eg.db", ont = "ALL", 그리고 기본 매개변수를 포함합니다. KEGG 경로 농축은 생물체를 "has"로 설정한 상태에서 enrichKEGG 함수를 사용하여 수행되었습니다. 조정 p-값 0.05< 풍부한 항은 유의미한 것으로 간주되었습니다.

8 단백질-단백질 상호작용 네트워크

85개의 DEG와 AD와 관련된 모듈 중첩 미토콘드리아 유전자를 STRING 데이터베이스(https://string-db.org)²⁴ 에서 조회하여 알려진 및 예측된 PPI를 검색하였습니다. 네트워크 위상수 분석은 각 단백질의 노드 중요성을 순위 매기기 위해 7가지 지표(Degree, Closeness, Betweenness, Eigenvector, PageRank, Hub, Authorities)를 사용하여 수행되었습니다. 각 측정값의 상위 30위 유전자를 선정하고, 7가지 접근법 모두의 교차점을 UpSet 플롯을 통해 시각화했습니다. 측정에서 교차하는 4개의 유전자를 사용하여 유전자 발현 수준을 기반으로 분류 모델을 구축하였습니다. 분류 성능을 평가하기 위해 모델 정확도, 민감도, 특이도, ROC 곡선 하 면적(AUC)을 계산하였습니다.

9 전사 조절 분석

hTFtarget 데이터베이스 (http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget)²⁵ 를 쿼리하여 네 개의 교차하는 허브 유전자에 대한 실험적으로 지원되는 TF-표적 상호작용을 검색하였습니다. 결과적으로 tf-유전자 조절 네트워크는 igraph²⁶ 과 ggraph²⁷ R 패키지를 사용하여 구축 및 시각화되었습니다.

10 대량 RNA-seq-면역 세포 침윤 분석

CIBERSORT²⁸ 알고리즘(https://cibersort.stanford.edu/)은 병변 피부 전사체 데이터에서 22가지 면역세포 유형의 상대적 비율을 추정하는 데 사용되었습니다. 정규화된 유전자 발현 데이터는 LM22 서명 행렬과 함께 CIBERSORT(v0.1.0)에 입력되었습니다. 분석은 1,000개의 순열과 분위수 정규화가 비활성화된 상태에서 수행되었습니다. CIBERSORT 출력 p-값이 0.05< 샘플을 하위 분석에 고려했습니다. 추정된 면역세포 분율은 Wilcoxon 랭크합 검정과 FDR 보정을 사용하여 22개 면역 세포 유형에 대한 다중 비교(p.adjust.method = "FDR")를 사용하여 분자 하위 그룹 간 비교되었으며, ggplot2²⁹ R 패키지를 사용한 박스플롯으로 결과를 시각화하였습니다.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아토피 피부염에서의 전사 소그룹

266명의 AD 환자 샘플에서 추출된 RNA-seq 데이터를 분석하여 질병 내 전사 이질성을 조사하였습니다. 여러 연구에서 품질 관리 및 배치 효과 보정을 거친 후, 감독 없는 합의 집집화 결과, 두 개의 뚜렷한 분자 하위 그룹이 나타났습니다(그림 1A). 군집 안정성과 최적 군집 수는 누적 분포 함수(CDF) 플롯(그림 1B), 델타 면적 플롯(그림 1C), 그리고 합의 행렬 히트맵(그림 1D)을 사용하여 평가하였습니다. 이 결과들은 AD에서 두 가지 강력한 전사 아형의 존재를 지지하며, 이는 기저된 유전적 이질성을 반영합니다.

AD 소그룹 간 유전자 발현 차이

정규화된 유전자 발현 행렬을 기반으로 한 t-SNE 플롯은 합의 클러스터링으로 확인된 전사 하위 그룹을 추가로 검증했습니다. t-SNE 플롯은 이전에 정의된 하위 그룹 중 하나에 해당하는 두 개의 잘 분리된 클러스터를 보여주었으며(그림 2A), 이는 AD 환자들 사이에 뚜렷한 분자 프로필의 존재를 뒷받침하였다. 두 하위 그룹 간 차등 발현은 DESeq2를 사용해 분석되었으며, 임계값은 조정된 p < 0.01이고 |log₂ 중변화|를 사용했습니다. > 1. 결과물인 화산 플롯(그림 2B)은 차등 발현 유전자(DEGs)를 보여주어 강한 전사 분기(transcription divergence)를 나타냈다. 상위 10개의 상향 조절 유전자는 클러스터 1에 속하는 ABHD2, ADAR, ADCY3, ADCY9, ADD1, ADD1, ADIPOR2, AFF1, AGFG1, AGRN , AHNAK 이며, 클러스터 2에는 C2orf68, CTTN, GPR108, HERPUD1, LRPAP1, MAP1LC3B2, NKIRAS2, NR1H2, PDE5D , PMPCA 가 있습니다(그림 2C).

AD 하위 그룹 관련 유전자 집합

유전자 집합 풍부화 분석(GSEA)은 두 전사체 클러스터 간에 뚜렷한 기능 풍부 프로필을 밝혀냈습니다(그림 3A). 클러스터 1은 세포 신호전달과 부착에 관여하는 경로, 예를 들어 국소 부착(그림 3B)과 MAPK 신호 경로(그림 3C)에서 유의미한 비축을 보였으며, 세포-세포-세포외 기질 상호작용과 증식이 강화된 활성 상태를 시사합니다. 반면, 클러스터 2는 산화적 인산화(그림 3D)와 프로테아좀 기능(그림 3E)에서 강한 농축을 보여, 활발한 산화 및 단백질 분해 대사 표현형을 시사합니다.

AD 분자 그룹에서 공동 발현 유전자들

전사체 아형과 관련된 공동발현 모듈을 식별하기 위해 데이터 전처리 후 WGCNA가 수행되었습니다. 이상치 샘플은 먼저 식별되고 하위 네트워크 구축의 견고성을 보장하기 위해 표본 거리의 계층적 군집화를 기반으로 제거되었습니다(그림 4A). 그 후 척도가 없는 위상수 기준을 사용하여 소프트 임계값 몫곱을 선택했으며, 척도 없는 R² > 0.85를 달성하기 위해 6의 거듭제곱을 선택했다(그림 4B). 유전자 모듈은 계층적 군집화와 동적 나무 절단을 통해 확인되었으며, 이어서 밀접한 관련 모듈들을 병합하는 고유유전자 군집화가 진행되었습니다(그림 4C 및 그림 4D). 생성된 유전자 네트워크는 위상적 겹침의 열맵을 사용하여 시각화되었으며, 뚜렷한 유전자 공동 발현 패턴의 존재를 확인했습니다(그림 4E). 모듈-형질 관계 분석 결과, MEyellow 모듈(N_유전자 = 743)과 분자 하위 그룹 사이에 강하고 유의미한 상관관계가 있음을 보여주었습니다(그림 4F).

AD 아그룹과 관련된 미토콘드리아 유전자의 기능적 풍부화

이후 DEGs 간 교차 유전자(N = 85), MEyellow 모듈 내 유전자, 그리고 MitoCarta3.0의 미토콘드리아 단백질 목록(그림 5A)에 대해 GO 및 KEGG 농축 분석을 수행하여, 클러스터 간 전사 차이를 유발하는 미토콘드리아 관련 유전자의 기능적 역할을 조사하였습니다. KEGG 경로 분석은 산화적 인산화 및 대사 경로의 농축을 확인했습니다(그림 5B). GO 농축 분석 결과, 양성자 동기 유발 미토콘드리아 ATP 합성, 호흡 사슬 복합체, NADH 탈수소효소 활성 등 미토콘드리아 기능과 관련된 용어들이 유의미하게 과대표되어 있어(그림 5C), 이들 유전자가 주로 미토콘드리아 에너지 대사 및 에너지 조절과 관련이 있음을 시사합니다.

AD 분화 과정에서의 허브 미토콘드리아 유전자

85개의 미토콘드리아 전사체 아위군 관련 유전자에서 핵심 유전자를 식별하기 위해 PPI 네트워크가 구축되었습니다(그림 6A). 7가지 위상 측정값 각각의 순위를 바탕으로 상위 30개의 유전자를 선정하고, 이들의 교차점을 UpSet 플롯(그림 6B)에서 시각화했습니다. 이 분석 결과, 모든 순위 기준(BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2)에 따라 네 개의 허브 유전자가 일관되게 중심 노드로 확인되었습니다. 두 전사체 클러스터에서 발현 프로필을 조사한 결과, 클러스터 1에서 네 개의 허브 유전자 모두 클러스터 2에 비해 유의미하게 상향 조절된 것으로 나타났습니다(그림 6C). 쌍별 유전자 발현 상관관계 분석 결과, 네 유전자 모두 양의 상관관계가 나타나 조절 조정이 이루어졌음을 나타냈으며, CHCHD5 와 ISOC2 가 가장 강한 상관관계를 보였습니다(그림 6D). 더욱이, 이 네 유전자의 발현을 이용해 구축한 분류 모델은 두 군집 간에 강력한 분별력을 보여주었으며, ROC 곡선은 곡선 아래 면적(AUC) > 0.7을 보여준다(그림 6E). 또한, 네 개의 확인된 허브 유전자의 발현을 조절하는 조절 메커니즘을 연구하기 위해 전사인자(TF) 조절 네트워크 분석도 수행되었습니다. 허브 유전자를 조절할 수 있는 모든 알려진 및 예측된 전사 인자를 hTFtarget에서 쿼리하였고, 결과는 전사 조절 네트워크로 통합되어 시각화되었습니다(그림 7). TF-허브 유전자 조절 네트워크에서 BAD 가 가장 많은 TFs를 보유했으며, ATF3, BRD2, BRD4, CEBPA 가 각각 네 개의 허브 유전자와 상호작용하여 공유된 조절 메커니즘을 시사합니다.

AD 하위 그룹 간 면역 세포 침윤 비교

전사체 소그룹과 관련된 면역학적 환경을 조사하기 위해, CIBERSORT를 이용한 면역 세포 침윤 분석이 수행되었으며, 이는 대량 전사체 데이터를 기반으로 22가지 면역 세포 유형의 상대적 비율을 추정합니다(그림 8). 면역 하위 집합 중 조절 T 세포(Tregs)가 클러스터 1에서 유의미하게 더 풍부하게 나타났으며, 이는 미토콘드리아 활동과 신호 전달 경로가 상향 조절되는 면역억제 미세환경과 관련이 있음을 시사합니다. 반면, 난포 보조 T 세포는 클러스터 2에서 유의미하게 풍부해져, 이 아그룹에서 더 활발한 적응 면역 반응이 있을 가능성을 시사합니다.

데이터 가용성:

이 연구에서 분석된 전사체 데이터는 유전자 발현 옴니버스(GEO) 저장소에서 GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) 등록 번호로 공개되어 있습니다.

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그림 1: 전사체 프로필을 기반으로 한 아토피 피부염 병변 샘플의 합의 군집. (A) 아토피 피부염(AD) 샘플 전반에 걸친 합의 행렬의 히트맵 및 계층적 군집화. (B) 최적 클러스터 수를 결정하는 데 사용되는 합의 누적 분포 함수(CDF) 플롯 (k = 2–10). (C) 각 k에 대해 CDF 곡선 아래 면적의 상대적 변화를 보여주는 델타 면적 플롯. (D) k = 2에 대한 합의 군집 할당. 각 열은 개별 샘플을 나타내며, 색상은 클러스터 소속을 나타냅니다(클러스터 1, 빨간색; 클러스터 2, 청록색). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 아토피 피부염 분자 아형의 차등 유전자 발현. (A) AD 샘플의 t-분산 확률 이웃 임베딩(t-SNE) 플롯. 각 점은 2차원으로 투영된 샘플을 나타내며, 클러스터 할당에 따라 색칠됩니다. (B) 클러스터 1과 클러스터 2 사이의 차등 발현 유전자(DEG)의 화산 그래프. 각 점은 유전자를 나타내며, log2 접수 변화(x축)와 −log10 조정된 p-값(y축)으로 그래프를 그립니다. 빨간색과 파란색 점은 각각 클러스터 1과 클러스터 2에서 유의미하게 상향 조절된 유전자를 나타내며, 회색 포인트는 유의하지 않은 유전자를 나타냅니다. (C) 클러스터 1과 클러스터 2에서 상위 10개의 고발현 유전자의 히트맵. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 3: 아토피 피부염 분자 아형의 유전자 집합 풍부화 분석. (A) 클러스터 1과 클러스터 2 사이의 GSEA 결과를 보여주는 양면 막대 플롯으로, 상단 경로가 유의미하게 풍부해졌습니다. 클러스터 1에 풍부해진 경로는 오른쪽에, 클러스터 2에 풍부해진 경로는 왼쪽에 표시되어 있습니다. (B–E) 국소 부착, MAPK 신호 전달 경로, 산화 인산화, 프로테아좀 경로에 대한 대표적인 농축 플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 4: 아토피 피부염 샘플의 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석. (A) 유전자 발현 프로필을 기반으로 한 샘플 군집 수단도. (B) 척도가 없는 위상 적합 지수와 소프트 임계 멱(1–30) 간의 평균 연결성. (C) 모듈 고유유전자의 클러스터링 및 열맵, 색상은 쌍별 상관관계를 나타냅니다. (D) 유전자를 공동 발현 모듈로 묶어 보여주는 계층적 군집 수목도. (E) 위상 중첩 행렬(TOM)의 열맵으로, 유전자 쌍 간의 공동 발현 유사성을 나타냅니다. (F) 모듈-형질 관계의 열맵으로, 모듈 고유유전자와 임상 형질 간의 상관관계를 보여줍니다. 상관계수는 각 셀 내에 표시되며, 색상 강도는 상관관계의 강도와 방향(빨간색, 양수, 파란색, 음수)을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 5: 아형 관련 미토콘드리아 유전자의 유전자 온톨로지 및 KEGG 경로 풍부화. (A) DEGs, 하위 유형 관련 모듈 유전자, 미토콘드리아 유전자 간의 중복을 보여주는 벤 다이어그램. (B) 교차하는 유전자의 상위 20개 농축된 KEGG 경로의 버블 플롯. (C) 생물학적 과정(BP), 세포 구성 요소(CC), 분자 기능(MF)에 대한 상위 10개의 풍부한 유전자 온톨로지(GO) 용어. 모든 농축 분석은 유의점 임계값으로 0.05(거짓 발견율)< 조정된 p-값을 사용하여 수행되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

figure-results-6
그림 6: 단백질-단백질 상호작용 분석 및 허브 유전자 식별. (A) 85개의 교차하는 유전자로 이루어진 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크. 노드는 단백질을 나타내며, 간선은 STRING 데이터베이스에서 예측되거나 실험적으로 검증된 상호작용을 나타냅니다. (B) 7개의 네트워크 중심성 측정을 기반으로 상위 30개 유전자 간 교차점을 보여주는 UpSet 플롯. (C) 클러스터 1과 클러스터 2에서 네 개의 허브 유전자의 발현 수준을 보여주는 박스플롯. (D) 네 개의 허브 유전자 간 쌍별 상관관계 분석. (E) 분류 성능을 보여주는 수신자 작동 특성(ROC) 곡선, 민감도는 특이도에 따라 그래프로 표시됨. 곡선 아래 면적(AUC)은 전체 정확도를 나타냅니다. 패널 (C)의 통계적 유의성은 윌콕슨 랭크합 검정(*p < 0.05)을 사용하여 평가하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 7: 허브 유전자의 조절 네트워크. 빨간 원은 허브 유전자를, 파란 원은 관련 전사인자(TF)를 나타냅니다. 가장자리는 조절 상호작용을 나타냅니다. 각 허브 유전자 노드의 크기는 상호작용하는 TF의 수를 반영합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

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그림 8: 아토피 피부염 아그룹간 면역 세포 침윤 비교. 각 클러스터에서 추정되는 22가지 면역 세포 유형의 비율을 보여주는 박스플롯(클러스터 1, 빨간색; 클러스터 2, 청록색). 별표(*)는 클러스터 간 통계적으로 유의한 차이를 나타내며, 다중 비교에 대해 윌콕슨 랭크 합 검정과 거짓 발견률 보정을 사용해 평가합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

아토피 피부염은 흔하고 유전적으로 이질적인 염증성 피부 질환으로, 개인 맞춤형 치료 전략에 큰 도전을 제기합니다. 이 연구는 AD 환자의 266개 병변 피부 샘플에서 두 가지 뚜렷한 전사 소그룹을 확인함으로써 AD의 분자 이질성에 대한 통찰을 제공합니다. 이 하위 그룹들은 서로 다른 생물학적 기능 풍부도와 면역 세포 침윤을 보이며, 클러스터 1은 활발한 세포 신호 전달과 부착 경로, 조절 T 세포(Tregs)의 풍부함이 특징이고, 클러스터 2는 산화적 인산화와 프로테아좀 기능이 증가하고 난포 보조 T 세포가 증가하는 특징으로 정의됩니다. 중요하게도, 클러스터 1에서 상향 조절되는 네 개의 미토콘드리아 관련 유전자(BAD, BOLA1, CHCHD5, ISOC2)가 확인되었습니다. 이들은 두 가지 전사체 아형을 정의하는 85개 유전자로 이루어진 PPI 네트워크의 허브 유전자이며, ATF3, BRD2, BRD4, CEBPA를 포함한 전사 인자에 의해 동시에 조절될 수 있습니다.

두 개의 뚜렷한 군집은 유전자 발현 패턴을 바탕으로 확인되었으며, 이는 AD가 상당한 유전자 발현 이질성을 보인다는 것을 시사합니다. 이전 연구들은 이러한 이질성이 유전적, 후생유전학적, 면역매개 메커니즘에 의해 촉진될 수 있음을 보여주었으며, 이는 ^5,30,31 등 뚜렷한 분자 내형을 정의합니다. 두 군집 사이에는 면역 세포 침윤도 다르게 관찰되었는데, 클러스터 1은 조절 T 세포가 특징이고, 클러스터 2는 난포 보조 T(Tfh) 세포로 풍부해져 AD(AD 코호트)에서 면역학적 이질성과 잠재적으로 다른 질병 기전을 보인다. 트레그 우세한 클러스터는 조절 메커니즘이 두드러지는 면역 환경을 시사하며, 이는 염증 조절 시도나 만성 면역 활성화에 대한 보상 반응을 반영할 수 있다^32,33. 하지만 AD에서는 수치가 증가해도 Treg 기능이 저하될 수 있어 염증을 효과적으로 억제하지 못할 수 있습니다. 반면, Tfh 풍부 클러스터는 B 세포 도움 증진, 생식중심 활동 증가, 그리고 알레르기 반응과 더 심하거나 외인성 형태의 특징인 IgE 생성 증가를 시사^합니다. Tfh 세포는 B 세포 분화와 항체 클래스 전환을 지원하는 것으로 알려져 있으며, 이들의 확장은 질병 활동 및 알레르기 감작과 상관관계가 있습니다³⁶. 이러한 뚜렷한 군집의 존재는 서로 다른 임상 표현형, 질병 중증도, 치료 반응을 반영할 수 있으며, 이는 AD 연구와 치료에서 개인 맞춤형 접근의 중요성을 강조합니다.

미토콘드리아 기능 장애가 표피 장벽^{유지, 활성} 산소 종^{생성 38}, 면역 세포 반응^{조절 39} 등의 메커니즘을 통해 AD의 병인에 중요한 역할을 한다는 것이 알려져 있습니다. 네 개의 미토콘드리아 단백질이 전사체 분화와 관련된 유전자의 중심 노드로 확인되었으며, 이는 분자 아형을 높은 정확도로 예측할 수 있습니다(AUC>0.7). 이전 연구에서는 이 유전자들이 AD와 직접적으로 연관이 있음을 보여주지 않았지만, 이 결과들은 AD 환자 층화 및 AD의 미토콘드리아 기능 장애 평가에 잠재적 바이오마커가 될 수 있음을 시사합니다. BAD (BCL2 관련 세포사멸 작용제)는 미토콘드리아 세포자사멸사 신호 전달에 관여하는 BCL-2 계열의 친세포자멸사 구성원입니다; 클러스터 1에서의 상향 조절은 이 하위 유형에서 미토콘드리아 세포자멸사 프라이밍이 강화된 것을 반영할 수 있습니다. BOLA1 은 철-황 군집 생합성과 산화 스트레스 조절에 관여하는 미토콘드리아 단백질입니다. CHCHD5 (코일드-코일-헬릭스-코일드-코일-헬릭스 도메인, 5 포함)는 크리스테 조직과 전자 전달 사슬 효율성과 관련된 미토콘드리아 내막 단백질입니다. ISOC2 (2를 포함하는 등코리스마타제 도메인)는 대사 과정과 미토콘드리아 기능과 연관되어 있습니다. 클러스터 1에서 이 네 유전자의 조정된 상향 조절은 이 AD 아그룹에서 미토콘드리아 대사 활동과 세포자멸사 신호 전달이 증가한 상태를 시사합니다.

이 연구에는 몇 가지 한계가 있습니다. 이 연구는 미토콘드리아 유전자에서 뚜렷한 유전자 발현과 분리된 면역 세포 침윤을 가진 두 분자 아그룹을 확인했으나, 병의 심각도 및 종단 치료 반응과 층화를 연관시킬 수 있는 상세한 임상 표현형 데이터가 부족합니다. 클러스터 1에서 이 네 개의 허브 유전자가 높은 발현이 의미하는 바를 완전히 이해하려면, 향후 연구는 포괄적인 임상 메타데이터를 통합하고 이상적으로는 각질세포 또는 마우스 모델에서 기능적 검증을 수행해야 합니다. 또한, 이 연구는 공개된 대량 RNA-seq 데이터에 의존합니다; 대규모 분석에서는 강력하지만, 특정 세포 유형에서는 해상도가 부족합니다. 이러한 한계로 인해 관찰되는 미토콘드리아 유전자의 차등 발현이 각화세포, 침투 면역세포, 또는 다른 피부 거주 세포 집단에서 기원하는지 판단하기 어렵습니다. 단세포 및 공간 전사체 접근법의 광범위한 사용으로 인해, 향후 연구는 발현 신호를 디컨볼루션하여 세포 수준에서 전사체 프로필을 보다 정밀하게 파악하는 능력을 크게 활용할 것입니다. 또한 모든 데이터는 전층 피부를 샘플링하는 펀치 생검 표본에서 얻었습니다. 향후 테이프 스트립 RNA-seq를 포함하는 연구들은 표면 표피 전사체 프로파일링에 보완적인 비침습적 접근법을 제공할 수 있으며, 최소 침습 환경에서 확인된 소그룹 서명을 검증할 수 있습니다. 향후 단일 세포 RNA-seq 및 공간 전사체 데이터의 통합은 AD 피부 내 세포 유형 특이적 미토콘드리아 서명의 해상도를 더욱 발전시킬 것입니다.

결론적으로, 본 연구는 266개 샘플에서 AD의 전사체 이질성을 조사하고, 주요 미토콘드리아 유전자와 독특한 면역세포 침투를 확인하여 하위 그룹을 구분하였습니다. 이러한 발견은 AD 분자 이질성에 대한 이해를 높이고, 특정 분자 프로파일을 기반으로 한 정밀 치료 접근법 개발의 잠재력을 강조합니다.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
시버소트	스탠퍼드 대학교	v0.1.0; 면역 세포 해소; https://cibersortx.stanford.edu
clusterProfiler	생체도체	v4.12.6; GSEA 및 GO/KEGG 농축 분석; https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler
컨센서스클러스터플러스	생체도체	v1.64.0; 감독 없는 합의 집집; https://bioconductor.org/packages/ConsensusClusterPlus
DESeq2	생체도체	v1.46.0; 차등 유전자 발현 분석; https://bioconductor.org/packages/DESeq2
유전자 발현 옴니버스 (GEO)	NCBI	공개 전사체 데이터 저장소; 데이터셋 GSE121212, GSE157194, GSE193309, GSE277961; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo
GGPLOT2	크랜	데이터 시각화; https://ggplot2.tidyverse.org
g그래프	크랜	그래프 및 네트워크 시각화; https://ggraph.data-imaginist.com
GseaVis	GitHub (junjunlab)	v0.1.0; GSEA 시각화; https://github.com/junjunlab/GseaVis
hTFtarget	화중과학기술대학교	인간 전사 인자 표적 데이터베이스; http://bioinfo.life.hust.edu.cn/hTFtarget
igraph	크랜	네트워크 구축 및 시각화; https://igraph.org
림마	생체도체	removeBatchEffect 함수; https://bioconductor.org/packages/limma
미토카르타3.0	브로드 연구소	선정된 미토콘드리아 단백질 데이터베이스; https://www.broadinstitute.org/mitocarta
MSigDB (할마크 유전자 세트)	브로드 연구소	GSEA용 유전자 집합 데이터베이스; https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb
조직. Hs.eg.db	생체도체	인간 게놈 주석 데이터베이스; https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db
R	R 코어 팀	통계 컴퓨팅 환경; https://www.r-project.org
스트링	엠블	v12.0; 단백질-단백질 상호작용 데이터베이스; https://string-db.org
sva (ComBat-seq)	생체도체	v3.44.0; 배치 효과 보정; https://bioconductor.org/packages/sva
WGCNA	크랜	v1.73; 가중 유전자 공동 발현 네트워크 분석; https://cran.r-project.org/package=WGCNA

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전사체 분석 결과 아토피 피부염 병변에서 미토콘드리아 주도 소그룹이 드러난다

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