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방법 논문

티모퀴논이 쥐의 비스페놀 A 유발 신경독성, Keap-1/Nrf-2 신호, 산화 스트레스 및 행동에 미치는 영향 조사

255 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70242

⸱

2026년 3월 24일

 , 
1Department of Physiology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University, 2Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Kirsehir Ahi Evran University

이 논문에서

요약

이 연구는 비스페놀 A에 노출된 쥐의 티모퀴논이 산화 스트레스, Keap-1/Nrf-2 신호 전달 경로, 그리고 혈장, 대뇌 피질, 해마 내 행동에 미치는 영향을 조사하는 것을 목표로 했습니다.

초록

널리 사용되는 환경 내분비 교란제인 비스페놀 A(BPA)에 대한 만성적이고 저용량 노출은 점점 더 산화 스트레스 매개 신경독성과 연관되어 있습니다. 니젤라 사티바의 생리활성 성분인 티모퀴논(TQ)은 강력한 항산화 특성을 보이며; 그러나 BPA 유발 독성에 대한 신경 보호 잠재력은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. BPA 노출이 널리 퍼져 있는 상황에서 효과적이고 접근 가능한 신경보호 전략을 찾는 것이 점점 더 중요해지고 있습니다. 이 연구는 BPA에 노출된 쥐에서 TQ가 산화 스트레스, Keap-1/Nrf-2 신호 전달, 행동 및 조직병리학적 변화에 미치는 영향을 조사하였습니다. 총 24마리의 성체 수컷 Wistar Albino 쥐가 네 그룹(n=6/그룹)으로 무작위로 배정되었습니다: 대조군, BPA, BPA + 10 mg/kg TQ(BPA+TQ I), 그리고 BPA + 20 mg/kg TQ(BPA+TQ II). BPA(50 μg/kg)와 TQ는 30일간 위내로 투여되었습니다. BPA 노출은 심각한 행동 장애, 산화 스트레스, Keap-1/Nrf-2 신호 전달 장애, 그리고 해마와 대뇌 피질에서 뚜렷한 조직병리학적 손상을 유발했습니다. TQ 치료는 운동 활동과 우울증 유사 행동을 유의미하게 개선하고, 지질 과산화와 일산화질소 수치를 감소시키며, 글루타티온 관련 항산화 능력을 회복시키고, Keap-1과 Nrf-2 발현을 정상화했습니다(p < 0.001). 이러한 보호 효과는 더 높은 TQ 용량에서 더 두드러졌습니다. 이 결과들을 종합해 보면, 티모퀴논은 산화 스트레스와 Keap-1/Nrf-2 신호 전달 경로를 조절하여 BPA 유발 신경독성을 완화하며, 환경적으로 중요한 BPA 노출에 대한 신경보호 효과가 있음을 강조합니다.

서론

비스페놀 A(BPA)는 플라스틱과 에폭시 수지에 널리 사용되는 합성 화합물로, 식품 포장재, 상수도 시스템, 의료기기, 가정용품에서 흔히 검출됩니다. 지속적인 환경 노출은 특히 실제 인간 노출을 반영하는 만성 저용량 조건에서 잠재적인 신경독성 영향에 대한 우려를 불러일으켰습니다.

미국 식품의약국(FDA)과 환경보호청(EPA)과 같은 규제 기관들은 50 μg/kg/day를 관찰된 부작용 없는 수준으로 정의했지만, 새로운 실험 및 역학적 증거는 낮은 용량에서도 행동 및 인지 변화가 발생할 수 있음을 시사합니다. 따라서 유럽의 허용 가능한 일일 섭취량은 하루 4 μg/kg으로 줄어들었으며, 환경 관련 BPA 노출의 기전적 영향 조사 필요성을 강조합니다 1,2.

산화 스트레스는 BPA 유발 신경독성의 핵심 메커니즘으로 간주됩니다. BPA는 글루타티온(GSH)과 같은 항산화 방어를 감소시키고 말론디알데히드(MDA)를 포함한 지질 과산화 마커를 증가시켜 세포 산화 균형을 방해합니다3,4. 그러나 BPA 노출 하에서 항산화 반응을 조절하는 상류 조절 메커니즘은 아직 충분히 규명되지 않았습니다.

켈치 유사 ECH 관련 단백질 1(Keap-1)/핵 인자 적혈구 2 관련 인자 2(Nrf-2) 경로는 주요 내인성 항산화 방어 기전입니다. 산화 스트레스 조건에서 Nrf-2는 Keap-1에서 해리되어 핵으로 이동하고, 항산화 반응 원소 의존적 유전자 발현5를 활성화합니다. 세포 방어에서 확립된 역할임에도 불구하고, 환경 관련 BPA 노출 시 뇌에서 Keap-1/Nrf-2 신호의 영역 특이적 조절은 행동 결과와 함께 포괄적으로 조사되지 않았습니다.

티모퀴논(TQ)은 나이젤라 사티바 씨앗 오일의 주요 생리활성 성분으로, 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는 지친성 벤조퀴논입니다. TQ는 Nrf-2 신호 활성화와 내인성 항산화 능력 증진을 통해 항산화, 항염증, 항아포토스 특성을 보입니다5,6. 이전 연구들이 다양한 신경독성 모델에서 TQ의 보호 효과를 입증했으나, 동일한 BPA 노출 패러다임 내에서 산화 스트레스 표지자, Keap-1/Nrf-2 신호전달, 행동 매개변수를 평가하는 통합적 방법론적 접근법은 5,6,7이 부족합니다.

여기서는 환경 관련 BPA 노출 쥐 모델에서 산화 스트레스 바이오마커, Keap-1/Nrf-2 경로 발현, 행동 변화를 평가하고, 여러 뇌 영역에서 티모퀴논이 신경 보호 효과를 갖는 효과를 평가하는 재현 가능한 실험 프로토콜을 설명합니다.

우리는 저용량 BPA 노출이 산화 스트레스 매개 Keap-1/Nrf-2 신호 경로 조절 장애를 통해 행동 장애를 유발하며, 티모퀴논이 산화환원 균형을 회복하고 Nrf-2 의존성 항산화 반응을 활성화함으로써 이러한 영향을 완화한다고 가설을 세웠습니다.

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프로토콜

모든 실험 절차는 기관 동물 실험 지역 윤리 위원회(승인 번호: 68429034/07)의 승인을 받았습니다.

동물과 실험 설계
실험동물연구소에서 24마리의 성체 수컷 Wistar Albino 쥐(200-250g)를 실험동물연구소에서 확보하여, 통제된 조건(12시간 밝은/어둠 주기, 24± 2°C)에 개별적으로 보관되었으며, 표준 식사와 수돗물을 자유 롭 게 사용할 수 있었습니다. 동물들은 32일간 진행된 실험 전에 실험실 환경에 적응시켰습니다.

쥐들은 컴퓨터 생성 단순 무작위화 방법을 사용하여 선택 편향을 최소화하는 실험군에 무작위로 배정되었으며, 각 그룹에 동일한 수의 동물이 배정되었습니다(n=6명/그룹): 대조군, BPA, BPA + 10 mg/kg 티모퀴논(BPA + TQ I), BPA + 20 mg/kg 티모퀴논(BPA + TQ II). 표본 크기는 G*Power 소프트웨어(버전 3.1)를 이용한 사전 검정력 분석으로 결정되었습니다. 이전연구에서 보고된 효과 크기는 BPA 유발 신경독성 및 항산화 중재, 특히 생화학적 및 행동적 결과 측정에 관한 5,6,7편이며, 일방향 ANOVA의 통계적 검정력은 0.80으로 가정되었습니다. 이러한 조건에서 실험군 간 통계적으로 유의한 차이를 감지하려면 그룹당 최소 6마리의 동물이 필요했습니다.

BPA(50 μg/kg)와 TQ(10 또는 20 mg/kg)는 30일간 하루 1회 가비지로 위내로 투여되었습니다. 모든 치료는 신선하게 준비되어 총 용량 1 mL/kg로 투여되었습니다. 본 연구에서 사용된 BPA 용량(50 μg/kg/day)은 미국 환경보호청(EPA)과 미국 식품의약국(FDA)이 부작용 관찰 없이 지정한 기준 용량을 기준으로 선정되었습니다. 이 용량은 환경적으로 관련된 BPA 노출을 모델링하고, 이전에 안전하다고 여겨졌던 노출 수준에서 발생할 수 있는 잠재적 신경행동 및 생화학적 변화를 조사하는 실험 연구에 널리 사용되어 왔습니다. 중요하게도, 누적된 실험적 증거는 이 용량 이하에서 신경학적 및 행동적 부작용이 발생할 수 있음을 시사하며, 이는 저용량 BPA 독성 평가에 이 제품의 중요성을 뒷받침합니다 1,2. TQ 용량(10 및 20 mg/kg)의 선정은 독성을 유발하지 않으면서도 신경보호 및 항산화 효능을 입증한 이전 실험 연구들을 바탕으로 하였다 5,6,7. 이 용량들은 신경독성, 산화 스트레스, 신경염증의 설치류 모델에서 널리 사용되어 왔으며, 반복 투여 시 보고된 독성 임계치보다 훨씬 낮은 수준입니다. 파일럿 용량 탐색 연구는 수행되지 않았으며; 용량 선택은 문헌 선례와 안전성 프로파일을 기반으로 하여 효능과 중개 관련성을 모두 보장하였습니다.

BPA는 30일 연속으로 투여되었습니다. 최종 노출 후 31일과 32일에 행동 평가가 실시되었다. 동물들은 모든 행동 검사가 완료된 후 32일째에 희생되었습니다. 이 일정은 급성 취급이나 절차적 스트레스가 이후 생화학적, 분자적, 조직병리학적 분석에 미치는 잠재적 혼란 효과를 최소화하면서 행동 평가에 충분한 시간을 확보하도록 설계되었습니다. 티모퀴논은 BPA 투여 직후 하루 1회 같은 위내 경로를 통해 투여되었습니다. 최종 BPA 및 TQ 투여 후 행동 검사가 수행되었습니다. 실험 시간표는 그림 1에 요약되어 있습니다.

체중 측정
체중은 보정된 디지털 정밀 저울(±0.1 g 감도)로 측정되었습니다. 각 쥐는 치료 투여 전 아침에 개별적으로 체중을 측정했으며, 변동성을 최소화하기 위해 표준화된 조건 하에 1일, 10일, 20일, 32일에 측정을 기록했습니다(그림 2).

행동 평가
모든 행동 매개변수는 관찰자 편향과 관찰자 간 변동성을 최소화하기 위해 그룹 할당에 눈이 먼 단일 관찰자가 점수를 매겼습니다. 동물들은 신기함으로 인한 스트레스를 줄이기 위해 행동 검사 전 최소 30분 이상 검사실에 익숙해졌습니다.

개방 필드 검사(OFT)와 강제 수영 검사(FST)의 결합 사용은 BPA 유발 신경행동 독성을 포괄적으로 평가할 수 있게 하는데, BPA는 설치류에서 정서 반응성과 운동 활동 모두를 변화시키는 것으로 입증되었습니다 2,3. FST 불가동 해석 시 OFT 유도 운동 결과를 고려하여 운동 활동 변화와 관련된 잠재적 교란 효과를 최소화하였습니다.

FST: 우울증 유사 행동은 32일째 강제 수영 테스트를 통해 평가되었으며, 24시간 전에 15분간 사전 검사를 받았습니다. 쥐들은 각각 원통형 탱크(직경 35cm, 높이 50cm)에 수조(깊이 30cm, 25± 1°C)로 채워져 5분간 헤엄치도록 했습니다. 이동성 저하, 수영, 등반 행동은 비디오 카메라를 사용해 촬영하고 오프라인에서 분석하여 행동 절망을 평가하였습니다7.

OFT: 불안과 유사한 행동과 자발적 운동 활동은 31일째 개방 필드 검사를 통해 평가되었습니다. 각 쥐는 흰색 플렉시글라스 아레나(90cm x 35cm)에 개별적으로 배치되어 24개의 동일한 정사각형으로 나뉘어 5분간 자유롭게 탐색할 수 있었습니다. 움직임은 비디오 카메라로 기록되었다. 중앙 및 주변 영역에서 보낸 시간과 네 발 모두로 교차하는 횟수는 불안 관련 행동과 이동 지수로 정량화되었다8.

샘플 채취
32일째에는 쥐들에게 근육 내 케타민(45 mg/kg)과 자일라진(5 mg/kg)으로 깊은 마취를 시켰다. 페달 철수 반사가 없다는 점에서 충분한 마취 깊이가 확인되었습니다. 멸균 주사기를 이용한 심장 천자를 통해 혈액을 채취했으며, 각 동물로부터 약 3-5mL의 혈액을 채취했습니다. 안락사는 심마취 하에서 출혈 투사로 완료되었습니다. 혈액 샘플은 항응고제 함유관에 옮겨 3,000 x g 에서 4 °C에서 10-15분간 원심분리했습니다. 분리된 혈장은 분리되어 −80 °C에서 저장되어 생화학적 분석이 이루어질 때까지 보관되었습니다.

해마와 좌뇌반구는 신속히 해부되어 무게를 측정한 후 액체 질소에 급동하여 −80°C에서 저장하여 이후 생화학적 분석을 수행했고, 오른쪽 대뇌 반구는 조직병리학적 및 면역조직화학적 평가를 위해 10% 중성 완충 포르말린에 고정되었다. 방법론적 일관성을 확보하고 표본 간 변동성을 최소화하기 위해, 모든 동물의 생화학적 측정은 체계적으로 왼쪽 반구를, 형태학적 분석은 오른쪽 반구를 배정하였습니다. 중요하게도, 포르말린 고정은 조직학적 및 면역조직화학적 절차에 지정된 조직에만 엄격히 제한되었고, 단백질 기반 생화학적 검사에는 고정 조직이 사용되지 않아 고정 관련 단백질 분해를 방지했습니다. 생화학적 평가를 위해, 정의된 양의 냉동 뇌 조직(일반적으로 분석당 50-100 mg)을 분석별 균질화 완충제와 각 생화학적 매개변수의 요구에 따라 조직 대 완충 비율의 표준화를 사용하여 균질화했습니다. 모든 분석은 각 실험군 내에서 동일한 조직량을 사용하여 수행되었습니다.

조직 균질체 내 총 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 형광측정 단백질 분석법을 사용하여 측정되었습니다. 모든 생화학적 매개변수는 각 분석법 내에서 표준화되고 동일한 단백질 농도를 사용하여 샘플과 실험군 간의 비교 가능성을 보장하였습니다.

산화 스트레스 매개변수 평가
지질 과산화는 혈장 및 조직 샘플에서 티오바르비투르산 반응성 물질(TBARS) 방법을 사용하여 MDA 수치를 측정하여 평가하였다7. 5,5′-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB) 기반 분석법을 사용하여 환원된 티올(RSH) 및 GSH 수치를 분광광도법으로 측정하였다. 질산염 환원 후 Griess 반응을 이용해 혈장 및 조직 균질체의 총 일산화질소(NO) 농도를 측정하였다7. 모든 생화학적 매개변수는 그림 3 과 그림 4에 표시된 nmol/g 단백질 또는 μmol/g 조직으로 표현됩니다. 모든 생화학적 검사는 중복 수행되었으며, 통계 분석에는 평균값이 사용되었습니다.

뇌 조직 분석 외에도, BPA 노출로 인한 전신 산화 상태를 평가하기 위해 혈액 샘플에서 생화학적 추정이 수행되었습니다. 혈장 지질 과산화 농도는 TBARS 방법으로 측정되었으며, 결과는 MDA 상당량으로 표현되었습니다. 감소된 설피드릴(RSH) 농도는 DTNB를 사용하여 측정되었고,앞서 설명한 질산염 환원 후 그리스 반응을 통해 총 NO 수치를 평가하였다. 흡광도는 532nm(TBARS), 412nm(RSH), 540nm(NO)에서 분광광도측정법으로 기록되었습니다. 모든 분석은 표준화된 조건 하에 중복하여 수행되었습니다.

BPA는 전신 순환계에 들어가 다기관에 영향을 미치는 널리 퍼진 환경 독성 물질입니다; 따라서 순환하는 산화 스트레스 마커는 전반적인 산화환원 불균형을 반영하는 보완적 정보를 제공합니다 1,2. 혈액 기반 생화학 매개변수 평가는 중추 및 말초 산화 변성 간의 관계를 평가할 수 있게 하며, 이러한 마커는 환경 및 임상 연구에서 노출 관련 독성을 모니터링하는 데 흔히 사용되므로 연구 결과의 번역적 관련성을 높입니다.

서부 블롯 분석
서부 블롯 분석을 통해 해마 조직 내 Keap-1 및 Nrf-2 단백질 수준을 확인하였습니다. 약 50mg의 조직을 프로테아제 억제제 혼합물이 포함된 500 μL RIPA 버퍼에 균질화하였습니다. 균질액은 14,000 x g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 상원액을 수집했습니다. 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 형광측정 단백질 정량 분석법을 사용해 측정했으며, 농도는 표준 보정 곡선에서 계산되었습니다. 동량의 단백질(30 μg)을 β-머캡토에탄올이 포함된 라엠리 버퍼와 혼합하여 95 °C에서 5분간 가열한 후, 10% SDS-PAGE 겔에 분리한 후 PVDF 막에 110 V에서 60-90분간 옮겼습니다. 막은 3% BSA로 차단하고, Keap-1과 Nrf-2에 대한 1차 항체(1:3000)와 β-액틴(1:1000)과 함께 4°C에서 하룻밤 배양한 후 HRP 결합 2차 항체로 배양하였습니다. 단백질 밴드는 화학발광으로 시각화되었고, 밴드 강도는 덴시토미터 분석으로 정량화되어 β-액틴으로 정규화되었다.

조직병리학적 분석
우반구의 뇌조직 샘플은 10% 중성 완충 포르말린에 72시간 고정된 후, 등급별 에탄올 시리즈를 통해 탈수된 후 자일렌으로 정화된 후 표준 조직학적 절차에 따라 파라핀에 박혀있습니다. 신선한 조직은 생화학 분석용으로 예약되었다. 쥐 뇌 지도10을 기반으로 해마 및 내감피질 수준에서 관상절편(5 μm)을 얻었습니다. 조직학적 및 면역조직화학적 평가를 위해 동물당 4개의 연속 절편을 유리 슬라이드에 부착하여 균일한 절편 두께와 해부학적 위치를 보장했습니다. 절편은 탈파라핀, 재수화, 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색하였으며,11번 정기 염색 프로토콜에 따라 이루어졌습니다. 조직병리학적 검사는 편향을 최소화하고 관찰자 간 변동성을 제거하기 위해 실험 그룹에 눈이 가린 단일 훈련된 관찰자가 광학 현미경 검사를 수행했습니다.

면역조직화학적 분석
관심 영역인 해마와 내감피질은 BPA 유발 신경독성에 대한 취약성과 인지 및 정서 조절에서의 역할을 기준으로 선정되었다 1,2. Nrf-2와 Keap-1에 대한 면역조직화학적 염색은 파라핀이 함침된 뇌 절편에서 수행되었습니다. 절편은 자일렌에서 탈파라핀화되고, 등급 에탄올 시리즈를 통해 재수화되었으며, 시트레이트 완충제(pH 6.0)에서 열에 의해 항원을 회수하였습니다. 인인성 과산화효소 활성 역시 배양 전에 소금되었습니다.

절편은 4°C에서 Nrf-2(1:100)와 Keap-1(1:200)에 대한 1차 항체와 함께 하룻밤 배양하였다. 제조사 지침에 따라 시민적으로 구할 수 있는 즉시 사용 가능한 폴리머 기반 HRP 검출 시스템을 사용했으며, 이 시스템은 고추냉이 과산화효소와 결합된 종 특이적 2차 항체를 포함하고 있습니다. 면역반응성은 3,3′-디아미노벤지딘(DAB)을 염색제로 사용하여 시각화한 후 헤마톡실린으로 염색하였습니다. 일부 구간은 탈수, 정리, 미끄러짐 처리가 이루어졌습니다.

음성 대조군 절편은 1차 항체 배양 없이 병행하여 처리되었습니다. 정량적 분석을 위해 동물당 인접하지 않은 세 개의 절편을 평가하였습니다. 모든 그룹에 대해 동일한 노출 환경에서 이미지를 촬영하였습니다. 각 섹션당 16개의 겹치지 않는 필드가 ImageJ 소프트웨어를 사용해 분석되었습니다. 관심 영역은 수작업으로 구분하고, 배경 염색을 빼고, 면역반응성은 평균 회색값으로 표현하였다. 동물당 평균 값이 계산되어 통계 분석에 사용되었습니다.

조직병리학적 점수 부여
조직병리학적 변화는 H&E 염색된 절편에서 반정량적으로 평가하였다. 각 절개당 무작위로 선정된 겹치지 않는 10개의 필드를 조사하고, 병리학적 매개변수를 독립적으로 점수 매겼습니다. 해마와 후후피질 손상 심각도는 영향을 받은 세포 비율에 따라 4점 척도로 평가하였다: 점수 0(<5%), 점수 1(≤ 3분의 1), 점수 2(1/3에서 2/3), 점수 3(> 3%). 통계 분석에는 동물별로 평균 점수가 사용되었습니다.

통계 분석
데이터는 SPSS 소프트웨어(버전 29.0)를 사용해 분석되었으며, 평균 ± 표준편차(SD)로 제시되었습니다. 표본 크기는 이전 연구와 검정력 분석을 바탕으로 결정되었으며, 그룹당 6마리가 생물학적 관련성 차이를 감지하는 데 >80%의 검정력을 제공함. 데이터 분포의 정규성은 Shapiro-Wilk 검정을 사용하여 평가하였다. 분산의 균질성은 레빈 검정을 사용하여 평가되었다. 그룹 비교는 분산 일방향 분석(ANOVA)을 사용한 후 Tukey의 사후 검정을 시행하였습니다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 설정되었습니다.

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결과

체중
연구 1일차와 32일차 동안 그룹 간 체중에 통계적으로 유의한 차이는 관찰되지 않았습니다 (F(3,20)=2.750, p > 0.05; 그림 2).

행동 검사 결과
개방 필드 시험 분석 결과, BPA 노출이 대조군에 비해 교차 횟수 감소(p < 0.001)로 나타나 운동 활동이 유의미하게 감소함을 보여주었습니다. 10 mg/kg 및 20 mg/kg TQ 치료는 BPA 그룹에 비해 교차 수가 유의하게 증가했으며(p < 0.001), BPA+TQ II 그룹에서 BPA+TQ I에 비해 더 큰 증가가 관찰되었습니다(p < 0.001; F(3,20)=183.031; 표 1).

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토론

본 연구는 50 μg/kg 용량에서 USEPA가 안전하다고 판단한 폴리카보네이트 플라스틱의 구조 성분인 BPA가 쥐 뇌의 산화 스트레스, Keap-1/Nrf-2 신호 전달, 행동 및 조직병리학적 변화에 미치는 영향을 평가하였습니다. 또한, 항산화 특성이 잘 알려진 자연 생성 화합물인 TQ의 잠재적 신경보호 효과가 두 가지 용량(10 mg/kg 및 20 mg/kg)에서 조사되었습니다5,6,7. 연구 결과는 안전한 용량의 BPA 비만성 노출이 상당한 산화 불균형을 유발하고, Keap-1/Nrf-2 신호를 방해하며, 행동을 손상시키고, 뚜렷한 조직병리학적 손상을 유발하는 반면, 동시 TQ 치료는 용량 의존...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 선언할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 프로젝트는 대학 과학 연구 프로젝트 조정 사무소(프로젝트 번호 TIP)의 지원을 받았습니다. A4.24.003).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)Thermo Scientific  69-78-3 
Benchtop centrifuge NF048Nüve43560
Beta_Actin ThermoFisher Scientific, United States7D2C10
Bisphenol AMerck239658
BSA solution  Proteintech, United States)66201-1-Ig
Butylated hydroxytolueneSigma Aldrich128-37-0
Dijital Homojenizatör Daihan Scientifichttps://www.artlaboratuvarcih
azlari.com/urun/daihan-hg-
15d-dijital-homojenizator-set
-a?srsltid=AfmBOorx_az06ulc
HpSzKZsuP8-47Za4BkvLOM2
2Xhp00tgwWhJ-86Vc
Hematoxylin–eosin Bio OpticaW01030708
Hydrochloric acidMerck7647-01-0
Image J software program NIH; Washington, U.S.A.https://imagej.net/ij/
Immunohistochemical staining kit Lab VisionTM UltraVisionTM Large Volume Detection System: anti-polyvalentHRP, TA-125-HL
Leica Autocut 14051956472Germanyhttps://www.leicabiosystems.
com/histology-equipment/mic
rotomes/histocore-autocut/
Light microscope Nikon, Eclipse Ni-U, 940728
N-(1-Naphthyl)ethylenediamineThermo Scientific 1465-25-4
Nano Microplate ReaderBMG LABTECHSPECTROstar Nano
phosphate-buffered saline MerckP4417
Primary antibodies Keap-1 ProteintechCat No. 10503-2-AP, 1:200
Primary antibodies Nrf-2 ProteintechCat No. 16396-1-AP, 1/100
Qubit Protein BR Assay Kit ThermoFisher Scientific-INVITROGENQ33211
sodium citrateMerck03-04-6132
Sodium Dodecyl SulfateThermo Scientific 151-21-3
sodium hydroxideMerck1310-73-2
Sodium nitrateMerck7631-99-4
Streptavidin Peroxidase Thermo Scientific SHRP248-B
sulfanilamideThermo Scientific  63-74-1 
thiobarbituric acid Merck504-17-6
TQ CAYMAN 490-91-5
Tricarballylic acid, 99%Thermo Scientific Chemicals 139360500
Trichloroacetic acidThermo Scientific Chemicals76-03-9
Tris-HClThermo Scientific  1185-53-1 
Vanadium(III) chlorideSigma Aldrich7718-98-1
West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate and the iBright 750 Thermo Fisher Scientific systemhttps://www.clinxsci.com/product/mini
_chemiluminescence_imaging_system
?gad_source=1&gad_campaignid=
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UOOtoB8UD0deumBAMD8Xi-1l-&g
clid=CjwKCAjwgeLHBhBuEiwA
L5gNEXtK2CNSLS1GqllMuNgkrFYD
aW7yK585njQjFja485Fkwj9lRUEKD
BoCgLoQAvD_BwE
Zinc sulfate solutionMerck7733-02-0

참고문헌

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