하시모토 갑상선염에서 면역세포 특성과 혈장 대사산물에 대한 멘델 무작위화 연구

요약

두 표본 멘델 무작위화 및 매개 분석을 사용하여 이 연구는 하시모토 갑상선염과 인과적으로 연관된 32가지 면역세포 표현형과 9가지 혈장 대사산물을 확인하고, 부분적인 CD39+Treg-이소발러릴카르니틴(C5)-HT 면역대사 축을 지지합니다. 예비 유세포 분석과 대사체 데이터는 이 경로와 일치하는 초기 생물학적 타당성을 제공합니다.

초록

하시모토 갑상선염(HT)은 갑상선의 자가면역 질환입니다. 면역 세포가 그 병인에 관여하고 있지만, 그 구체적인 역할은 아직 완전히 명확히 밝혀지지 않았습니다. 면역세포 형질(ebi-a-GCST90001391에서 ebi-a-GCST90002121), 혈장 대사산물(GCST90199621-9020102), HT(ebi-a-GCST90018855)에 대한 대규모 공개 데이터셋의 유전체 전면 연관 연구(GWAS) 요약 통계를 통합하여 2표본 멘델 무작위화(MR) 분석이 수행되었습니다. 인과관계는 MR-Egger, 가중 중앙값, 제외 분석(leave-one-out) 분석을 사용하여 다재성 및 강인성을 평가하기 위해 역분산 가중법(IVW) 방법을 사용하여 추정하였다. 양방향 및 매개 MR 분석을 추가로 적용하여 방향성을 검증하고 대사산물 매개 경로를 식별하였습니다. CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Treg 세포는 유세포분석을 이용해 말초혈 샘플에서 정량하였다. 이소발러렐카르니틴(C5)은 액체 크로마토그래피 탠덤 질량분석법으로 측정되었습니다. IVW 분석에서 32가지 면역세포 표현형이 HT 위험과 유의미하게 연관되어 있음을 확인했습니다(FDR 교정 후 P < 0.05). 역방향 MR 분석 결과, HT는 2가지 면역 특성과 인과관계를 보였고, 4가지 면역 특성(모두 P < 0.05)은 HT와 역상관관계를 보였습니다. 감도 분석에서는 수평 다변성이나 이질성이 없음을 확인했습니다. 또한, IVW 방법은 위험 증가 C5(OR = 1.120, 95% 신뢰구간: 1.032-1.215, P = 0.006)와 보호성 에르고티오인(OR = 0.958, 95% 신뢰구간: 0.927-0.990, P = 0.010)을 포함하여 9가지 혈장 대사산물을 HT와 인과적으로 연관성을 확인했습니다. 2단계 MR 매개에서 C5가 CD3⁺ CD39⁺ Treg와 HT를 연결하는 후보 매개체로 확인되었습니다(매개 비율 8.89%, 95% 신뢰구간: 2.34%-15.4%, P = 0.008). 유세포검사 결과 HT 환자에서 CD39⁺Treg 수치와 혈장 C5가 상승했으며, C5는 CD39⁺Treg 세포 비율과 양의 상관관계를 보였습니다. 본 연구는 면역세포 표현형과 HT 간의 새로운 인과관계를 확립하고, 특히 C5를 포함한 혈장 대사산물이 HT 발병 기전의 잠재적 매개체임을 강조합니다. 이 발견들은 자가면역 갑상선 질환에 대한 기전적 이해를 심화시키며, 향후 바이오마커 및 치료 표적 발견을 이끌 수 있습니다.

서론

하시모토 갑상선염(HT)은 면역 체계가 갑상선을 공격하여 갑상선기능저하증을 일으키는 흔한 자가면역 질환입니다 ^1,2. 최근 연구들은 HT 발생률이 매년 꾸준히 증가하고 있다고 보고했습니다. 중국에서는 유병률이 0.2%에서 1.3% 사이로 추정됩니다^. HT의 정확한 원인은 알려져 있지 않으나, 유전적, 환경적, 면역계 요소의 복잡한 상호작용이 병인으로 추정됩니다 ^4,5.

HT 발달은 면역 체계의 영향을 크게 받습니다 ^6,7,8. 이상 면역 반응은 갑상선 조직을 표적으로 하여 항갑상선 과산화효소(anti-TPO)와 항갑상선글로불린(anti-Tg^)을 포함한 자가항체 생성을 촉진합니다9. 이 자가항체는 갑상선 세포와 상호작용하여 면역 매개 세포 사멸과 염증 반응을 유도하여 갑상선 기능 저하를 초래합니다¹⁰. 특정 병원성 경로, 특히 면역 세포 기능을 장애시키는 대사 신호는 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 조절 T 세포(Tregs), 특히 CD39를 발현하는 세포는 세포외 ATP를 가수분해하여 면역억제 아데노신으로 전환하여 면역 관용을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다. 트레그 기능이나 대사 환경의 교란은 자기 내성 붕괴를 초래할 수 있으나, 특정 트레그 하위 집합과 HT 간의 인과관계는 아직 밝혀지지 않았습니다 11,12,13,14,15,16.

전통적인 관찰 연구는 교란변수와 역인과관계 가능성에 의해 자주 제한되어 면역 세포 표현형과 HT¹⁷ 간의 명확한 인과관계를 규명하는 데 어려움을 겪습니다. 더불어, HT는 다양한 면역 하위 집합과 대사 중간체에 의해 영향을 받는 전신 질환이기 때문에, 개별 후보에 좁게 집중하면 새로운 병원성 동인을 간과할 수 있습니다¹⁸. 따라서 HT에 기여하는 면역대사 인자에 대한 편향 없고 포괄적인 지형을 제공하기 위해서는 대규모 선별 접근이 필요합니다. 최근 유전체 전체 연관 연구(GWAS)의 발전은 면역 세포 표현형과 혈장 대사산물에 대한 포괄적인 데이터를 제공하여 HT¹⁹의 기전을 탐구할 새로운 길을 열어주었습니다. 멘델 무작위화(MR)는 멘델 생식자 및 자유 조합의 무작위 할당 원^{칙을 따르}며, 단일 염기다형성(SNP)을 도구적 변수(IV)로 활용하여 노출이 결과에 미칠 잠재적 인과적 효과를 추론합니다^20,21. 이 방법은 교란 요인과 역인과관계의 영향을 완화하는 데 도움을 주며, 이는 전통적인 관찰 연구를 자주 복잡하게 만듭니다^16,22.

이러한 발전을 고려할 때, 본 연구의 목적은 두 가지입니다. 첫째, 2표본 MR 프레임워크를 사용하여 731개의 면역세포 표현형과 1,400개의 혈장 대사산물을 체계적으로 선별하여 HT의 새로운 후보 위험 인자를 규명하는 탐색적 가설 생성 분석을 수행했습니다. 둘째, 조절 T 세포와 HT 위험 연결 경로에서 이소발레릴카르니틴과 같은 확인된 대사산물의 특정 매개 역할을 평가하기 위한 가설 기반 연구로 전환하였습니다. 따라서 본 연구는 대규모 MR 선별검사와 매개 분석 및 예비 임상 검증을 통합하여 추정되는 면역대사 프레임워크(Treg–대사산물–HT)와 일치하는 유전적으로 뒷받침된 근거를 제공하며, 이 발견들의 탐색적 성격을 강조합니다. 이러한 정확한 인과 사슬을 규명함으로써 갑상선 자가면역의 대사 조절에 대한 새로운 관점과 향후 치료 표적화를 위한 강력한 후보가 제시됩니다.

프로토콜

이 연구는 내몽골 의과대학 제휴병원 의학윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 절차는 헬싱키 선언과 관련 윤리 지침에 따라 진행되었습니다. 연구 관련 절차 시작 전에 모든 참가자로부터 서면 동의서를 받았습니다. 이 연구에는 하시모토 갑상선염 그룹(HT, n = 10)과 건강한 대조군(건강, n = 10) 두 그룹이 포함되었습니다. 두 그룹은 나이와 성별에 따라 매칭되었습니다. 모든 말초 혈액 샘플은 외래 환자 또는 정기 건강 검진을 받는 개인으로부터 채취되었으며, 하룻밤 단식 후 아침에 혈액을 채취했습니다.

연구 설계

본 연구에서는 2표본 MR 분석과 매개분석을 통해 731개의 면역세포 표현형(7개 그룹)과 HT 간의 인과관계를 평가하고, 이 관계에서 혈장 대사산물의 잠재적 조절 역할을 탐구하였습니다. 분석 워크플로우는 5단계의 순차적 단계로 구성되었습니다: (1) 면역 표현형에 대한 노출 GWAS 데이터셋 선정; (2) HT를 위한 결과 GWAS 데이터셋 선정; (3) 기구 변수 식별 및 조화; (4) 1차 2표본 MR 분석 및 양방향 검증; 그리고 (5) 2단계 매개 MR 분석. 연구 설계의 개략적 개요는 보충 그림 1에 제시되어 있습니다. MR 분석에서 유전적 변이는 변형 가능한 노출의 대리 변수 역할을 합니다. 유효한 인과 추론을 위해서는 도구 변수(IV)가 세 가지 기본 기준을 충족해야 합니다: (1) 관심 대상의 노출과 강하게 연관되어 있음; (2) 노출과 결과 모두에 영향을 줄 수 있는 교란 요인과는 독립적이다; 그리고 (3) 대체 인과 경로 없이 노출만을 통해서만 결과에 영향을 미친다.

HT 데이터 소스의 GWAS

데이터셋 호환성을 보장하고 인구 계층화를 최소화하기 위해, 모든 GWAS 요약 통계는 주로 유럽계 혈통을 가진 개인에서 도출되었습니다. GWAS 데이터베이스(https://gwas.mrcieu.ac.uk/)가 HT 결과 데이터를 제공했으며, ebi-a-GCST90018855 데이터셋이 사용되었습니다. 연구는 395,640명의 유럽인(N_사례 = 15,654, N_대조 군 = 379,986)을 대상으로 GWAS를 수행했으며, 품질 관리 및 보간 후 2,4,146,037개의 SNP가 분석되었습니다. HT 특이적 교란변수(예: 성별, 연령)에 대해, 원래 GWAS(ebi-a-GCST90018855)는 GWAS 파이프라인의 표준으로 이 공변량들을 모델에 포함시켰습니다.

면역 세포에 대한 GWAS 데이터 소스

면역 세포 형질과 관련된 GWAS 요약 통계는 gwas 카탈로그에서 수집되었으며, ebi-a-GCST90001391부터 ebi-a-GCST90002121까지의 등록 번호를 포함하고 있습니다(https://www.ebi.ac.uk/gwas/ 에서 이용 가능). 분석에는 상대 세포 수(n = 192), 형태학적 매개변수(MP)(n = 389), 활성화 계수(AC, n = 118), 평균 형광 강도(MFI, n = 389)가 포함되어 표면 항원²³의 정도를 나타내는 총 731개의 면역학적 표현형이 포함되었습니다. 초기 GWAS가 면역 세포에 대해 기록한 것은, 3757명의 사르데냐인에서 731개의 면역 세포 표현형에 약 2,200만 개의 다형성이 영향을 미쳤다는 사실을 문서화했습니다.

혈장 대사산물에 대한 GWAS 데이터 소스.

GWAS 카탈로그(https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020)에서 총 1,400개의 혈장 대사산물에 대한 GWAS 요약 데이터가 수집되었으며, 1,091개의 개별 대사물 농도와 309개의 대사물 비율 형질을 포함합니다. 본 연구에서 MR 분석에 사용된 GWAS 데이터셋은 유럽계 혈통을 가진 개인으로부터 도출되었습니다. 사용된 혈장 대사산물 GWAS 데이터의 상세 특성은 보충 표 1에 제공되어 있습니다.

면역세포 표현형(사르데냐 코호트), HT(FinnGen/EBI-a-GCST90018855), 혈장 대사산물(유럽 코호트)에 대한 GWAS 데이터셋은 각 컨소시엄 출판물에서 확인된 바와 같이 샘플 중복이 없고 독립적입니다. 이는 2표본 MR에 대한 독립성 가정을 만족합니다.

기기 변수(IV) 선택

IV는 결과 변수와 독립적으로 노출과 강하게 연관되어 있다고 가정하였다. 또한, 노출 인자만이 결과에 직접적인 영향을 미칠 것으로 가설이 제기되었습니다. 적절한 IV를 찾기 위해, 노출 인자와 관련된 SNP를 5 × ^10-8로 유의수준으로 설정하여 선택하였다. 연관 불균형(LD)을 고려하기 위해 SNP는 10,000 킬로베이스(kb) 창 크기 내에서 R² 임계값 0.001을 사용해 집게로 묶었습니다. 이 거리 내에서 쌍별 R² > 0.001을 보이는 변이들은 선택된 기구 변수의 독립성을 보장하고 LD 상관관계를 제거하기 위해 제외하였다. 이질성 검사는 F-통계량이 10인 유의한 이질성 SNP< 배제하였습니다. 마지막으로, 교란변수가 IVs에 미치는 영향을 통제하기 위해 P < 1×^10-5 를 사용하여 회문 SNP와 부호환 SNP를 제거하고, 유효한 SNP는 도구 변수로 유지하였다.

2표본 멘델 무작위화 분석

면역세포 표현형과 HT 간의 양방향 인과관계를 평가하기 위해 2표본 멘델 무작위화(MR) 분석과 매개 MR 분석을 모두 수행하였습니다. 구체적으로, 두 표본 MR을 적용하여 여러 면역 세포 관련 형질을 평가하였습니다. 이 분석에는 역분산 가중치(IVW)²⁴, MR-에거 회귀²⁵, 가중 중간값 추정량(WME)²⁶, 모드 기반 단순 추정²⁷, 가중 모드 기반 추정 등 여러 보조 MR 방법이 사용되었습니다. 이 중 IVW가 주요 분석 접근법으로 지정되었으며, 통계적 유의성은 P < 0.05로 정의되었습니다. IVW 방법은 정밀도와 균형 잡힌 다면력 가정 간의 최적 균형 때문에 주요 MR 추정량으로 선택되었습니다. IVW 방법은 분산이 작은 SNP에 더 큰 가중치를 부여함으로써 정밀도를 높여 더 신뢰할 만한 인과 추정을 산출합니다. MR-에거 회귀는 다면형성 평가에 사용되었으며, 이는 유전자가 여러 표현형에 영향을 미치는 과정입니다. 인터셉트에서 유의미한 수평 다면형성(P > 0.05)이 없다면, 이 방법은 교차 평가를 결합하여 다면형성을 결정했다. 이질성은 MR-Egger 및 IVW 방법의 Q 통계량을 사용하여 평가되었으며, 이는 유전적 변이가 표현형에 미치는 영향을 측정하며, P > 0.05가 유의미한 이질성이 없음을 나타냅니다. 본페로니 조정 임계값은 731개의 면역 표현형(P < 6.84 × 10^⁻⁻)과 1,400개의 대사산물(P < 3.57 × 10^⁻⁻)을 고려하기 위해 적용되었습니다. 특별한 언급이 없는 한 중요한 결과는 수정 후에도 생존했습니다. 또한, 동일한 MR 방법을 사용하여 역인과관계를 평가하여 면역세포 특성이 HT에 의해 영향을 받는지 조사하였습니다. 역방향 MR 연구에서는 HT가 노출 인자로 간주되었고, 다른 면역세포 특성이 결과로 고려되었습니다.

본 연구에서는 2단계 MR 프레임워크를 사용하여 혈장 대사산물이 면역 세포 표현형과 HT를 연결하는 인과 경로에서 중개자로 작용하는지 여부를 조사하는 매개체 분석을 수행하였습니다. 이 접근법은 면역 세포 표현형이 HT에 미치는 전체 인과적 효과를 직접 효과와 확인된 대사 중간체를 통해 전달되는 간접 효과로 나눌 수 있게 합니다. 면역 세포가 HT에 미치는 총 효과를 먼저 추정한 후, 면역 세포가 대사산물(β1), 대사산물에 미치는 영향(β2), 매개체 효과(β1*β2)를 평가했으며, 직접 효과는 총 효과에서 매개체 효과를 뺀 값으로 계산되었습니다. 총효과(β_총) = 직접효과(β_직접 효과) + 간접 효과(β_간접); 간접 효과 = β1 × β2; 매개 비율(%) = (β1 × β2)/β총합은 100%×, 여기서 β1은 면역세포 표현형이 혈장 대사산물에 미치는 인과적 영향이고, β2는 혈장 대사산물이 HT에 미치는 인과적 효과입니다. 델타 방법을 사용하여 간접 효과에 대한 95% 신뢰구간을 추정했습니다. 또한, 전방향 MR 결과를 보완하고 인과관계 추론의 신뢰성을 높이기 위해 HT가 대사산물과 면역 세포에 미치는 인과적 영향을 조사하기 위해 역중개 MR 분석을 수행하였습니다. 모든 분석은 통계 컴퓨팅 환경과 관련 MR 관련 소프트웨어 패키지를 사용하여 수행되었으며, 이는 재료표에 나열되어 있습니다.

CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ 트레그 검출

항응고된 전혈 50 μL을 시험관에 완전히 혼합했으며, 각각 10 μL 표적 단클론 항체가 각각 10 μL씩 섞였다. 혼합물은 빛으로부터 보호되어 15분간 실온에서 유지되었습니다. 이후 1:10 희석된 FACS 용해체 용액 2mL를 첨가하였습니다. 튜브는 용해 과정에서 빛으로부터 보호된 채 실온에서 10분 더 배양되었다. 튜브는 ~300 x g 에서 5분간 원심분리한 후 상정액을 제거했습니다. 2mL의 인산염 완충액(PBS)을 추가한 후, 튜브는 다시 ~300 x g 압력으로 5분간 원심분리되었습니다. 상청액을 제거하고 500 μL PBS를 추가하여 검출했습니다. 검출은 다중 레이저 유세포계를 사용하여 수행되었고, 동반된 채취 및 분석 소프트웨어로 분석하여 CD3⁺CD4⁺CD25⁺Tregs의 비율과 CD39를 발현하는 부분집합(CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Tregs)의 비율을 얻었습니다.

이소발레릴카르니틴(C5) 수치 측정

환자의 C5 수치 데이터는 내몽골 의과대학 병원 임상실험실에서 수집되었습니다. 구체적으로, C5는 표준화된 실험실 절차와 품질 관리 프로토콜을 따라 일상적인 액체 크로마토그래피-텐덤 질량분석법(LC–MS/MS)의 일부로 측정되었습니다.

통계 분석

모든 통계 분석은 통계 소프트웨어 환경을 사용하여 수행되었습니다. 연속 변수는 정규 분포 데이터에 대해 학생 t-검정 을, 비정규 분포 데이터에 대해서는 윌콕슨 랭크합 검정을 사용해 비교하였다. 범주별 변수는 카이제곱 검정을 사용해 분석하였다. 피어슨 상관분석을 사용하여 상관분석을 수행하였습니다. p 값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

결과

면역 세포 표현형이 HT에 미치는 유전적 인과적 영향

잠재적 교란 요인을 배제하고 수평 다면형성(P > 0.05)이 없음을 확인한 후, 면역 세포 표현형이 HT 위험에 미치는 인과관계를 평가하기 위해 두 표본 MR 분석을 수행하였습니다. 노출 지표로 사용된 각 면역 세포 표현형에 대해 F-통계량을 계산하여 도구 변수의 강도를 평가하였다. 모든 기기가 F > 10이라는 기존 임계값을 초과하여 약한 기기 편향이 최소화되었음을 나타냈습니다. 본문에서 논의된 주요 면역 형질에 대한 상세한 F-통계는 보충 표 2에 제공되어 있습니다. 총 32종의 면역 관련 표현형이 HT 위험과 유의미한 연관성을 보였습니다(P < 0.05)(그림 1). 이러한 발견의 견고성은 산점도 분석(보충 그림 2A,B)과 생략 1-제거 접근법을 이용한 민감도 분석(보충 그림 3A,B)에 의해 뒷받침되었습니다.

주요 발견 중 Treg 표현형이 가장 광범위한 관여를 보였으며, CD3 내 CD3+가 Treg를 분비했습니다(OR = 1.063; 95% 신뢰구간: 1.023–1.105; P = 0.002) 및 CD39+ 활성화 Treg % 활성화 Treg (OR = 1.081; 95% 신뢰구간: 1.008–1.161; P = 0.030)이 이후 중재 분석에 우선순위가 부여된 주요 위험 관련 특징으로 부상했습니다. T 세포의 성숙 단계에서, CM CD8br에 적용된 CD3는 위험 관련 특징 중 가장 큰 효과 크기를 보였습니다(OR = 1.094; 95% 신뢰구간: 1.040–1.150; P < 0.001), 반면 TD DN (CD4⁻CD8⁻) AC는 주목할 만한 보호 연관성을 보였다(OR = 0.930; 95% 신뢰구간: 0.881–0.982; P = 0.009). B 세포 표현형 중에서는 HLA-DR 발현 골수계 세포 하위 집합이 일관되게 위험 상승 효과를 보였으며, CD33dim HLA DR+ CD11b⁻에 대한 HLA DR은 OR = 1.095에 도달했습니다 (95% 신뢰구간: 1.032–1.162; P = 0.003). cDC, Treg, T 세포 성숙 단계, TBNK, 단핵구, B 세포, 골수세포 표현형의 6개 면역 세포 범주 전반에 걸친 완전한 결과는 그림 1에 요약되어 있습니다.

민감도 분석을 통해 결과가 더욱 검증되었습니다. 관련 통계 평가를 근거로 이질성 및 수평 다면성에 대한 유의미한 증거는 발견되지 않았습니다(보충표 3 및 보충표 4). 이 결과는 '제외 제외(leave-one-out)' 분석으로 뒷받침되었습니다.

HT가 면역 세포에 미치는 인과 영향

결과는 HT가 두 가지 면역 특징과 긍정적 인과관계를 보였음을 밝혀냈습니다: 분비하는 CD4 조절 T 세포(1.143: 1.023-1.277; P = 0.018) 및 단핵구 골수계 유래 억제 세포(1.373: 1.058-1.782; P = 0.017). 반면, HT는 4가지 면역 특징과 음의 인과관계를 보였다: 활성화된 CD4 조절 T 세포(0.818: 0.679-0.987; P = 0.036), 활성화된 CD4+ 조절 T 세포(0.790: 0.676-0.924; P = 0.003), 활성화된 및 휴식 중인 CD4 조절 T 세포 (0.871: 0.780-0.974; P = 0.015) 및 CD25++ CD4+ T 세포 (0.855: 0.747-0.980; P = 0.017) (그림 2). 이 결과는 HT와 Treg 활성화 상태 사이에 상호관계가 있음을 시사하며, 이는 질병에 의한 면역 재형성을 반영할 수 있습니다. 산점도(보충 그림 4)와 '리브 원아웃(leave one-out)' 방법(보충 그림 5)을 통해 결과의 안정성이 검증되었습니다. 민감도 분석도 결과를 검증했습니다. 이 결과의 강도는 이질성과 수평 중복도 평가를 통해 확인되었습니다(보충표 5 및 보충표 6). 이러한 결론은 '빠짐 하나(leave-one-out)' 분석에 의해 뒷받침됩니다.

혈장 대사산물이 HT에 미치는 유전적 인과적 영향

적절한 도구 변수를 선택하고 사슬 불균형 및 약한 도구를 제외한 결과, 혈장 대사산물과 관련된 총 34,843개의 SNP가 확인되었으며, 최소 F-통계량은 19.50에 도달했습니다(보충표 7). IVW 방법을 사용하면, 9가지 혈장 대사산물이 HT와 인과적으로 연관된 것으로 예비적으로 확인되었습니다. 이 중 4가지 대사산물이 HT 위험 증가와 양의 상관관계를 보였다: 포도당 대 맥아당 비율(1.195: 1.082-1.319; P < 0.001), 타우로콜산 (1.190: 1.073-1.321; P = 0.001), 5-하이드록시메틸-2-푸로일카르니틴 (1.127: 1.046-1.215; P = 0.002), 그리고 C5 (1.120: 1.032-1.215; P = 0.006) (표 1).

반대로, 에르고티오네인을 포함한 5가지 대사산물은 HT 위험과 음의 상관관계를 보일 수 있습니다(0.958: 0.927-0.990; P = 0.010), 카르니틴과 프로피오닐카르니틴(C3) 비율(0.895: 0.825-0.970; P = 0.007), 아데노신 5'-이인산(ADP)과 N-아세틸뉴라민산 비율(0.890: 0.823-0.963; P = 0.004), 아르기닌과 글루타메이트 비율(0.882: 0.802-0.968; P = 0.009), 그리고 1-(1-에닐-팔미토일)-2-리놀레오일-GPE (p-16:0/18:2) (0.873: 0.798-0.955; P = 0.003).

민감도 분석도 결과를 검증했습니다. 이 결과의 강도는 이질성과 수평 중복도 평가를 통해 확인되었습니다(보충표 8 및 보충표 9). 이러한 결론은 '빠짐 하나(leave-one-out)' 분석에 의해 뒷받침됩니다.

혈장 대사산물에 의한 면역세포-HT 위험 매개에

기존에 확인된 면역 세포 표현형과 혈장 대사산물을 바탕으로, 두 표본 MR 전략을 적용하여 잠재적 매개 효과를 추정하였습니다. 첫 단계에서는 32개의 면역세포 표현형을 노출로, 9개의 혈장 대사산물을 결과로 사용하여 MR 분석을 수행하여, 10개의 면역세포 표현형과 8개의 혈장 대사산물 사이에 12개의 유의미한 인과관계가 있음을 밝혀냈고, 이에 대응하는 효과는 면역세포에서 대사산물로 β1로 추정된다. 이 중 가장 중요한 연관성은 CD39+ 분비 Treg 세포와 C5 수치 사이의 연관성이었습니다(1.050: 1.016-1.085; P = 0.004). 두 번째 단계에서는 C5를 노출로, HT를 결과로 다루었습니다. MR-PRESSO 이상치 검출과 이질성 및 수평 다면형성 평가를 포함한 MR 분석이 수행되었습니다. 이상치인 SNP나 이질성 또는 다면성의 증거는 검출되지 않아(표 2), 혈장 대사산물에서 HT(β2)에 미치는 인과관계를 추정할 수 있었습니다(보충 그림 6).

MR 분석의 마지막 단계에서는 면역 세포 표현형이 HT에 미치는 인과적 효과가 혈장 대사산물을 통해 매개되었는지 명확히 하기 위해 매개분석 과정을 수행하였다. 결과는 C5 수치 증가가 CD39+ 분비 Treg 세포를 연결하는 경로에서 매개 역할을 하여 HT 발병 위험 증가에 영향을 미친다는 것을 보여주었다(보충 그림 7 및 그림 3). MR-PRESSO 이상치 검출, 이질성 및 다면성 검사는 편향된 SNP와 이질성 또는 수평 다면형성의 징후를 발견하지 못했습니다(표 3, 보충표 10, 보충표 11). 그중 C5 수치의 매개 비율은 8.89%(2.34%에서 15.4%)였으며(P = 0.008), 마지막으로, 방향성 가정을 엄격히 검증하기 위해 역매개 MR 분석을 수행하였습니다. 면역 세포에 대한 대사산물의 경우, 역방향 MR(C5 수치를 CD3로 CD3으로 전환)을 통해 본페로니 보정 후 IVW P > 0.05를 보여줌으로써 단방향성을 뒷받침하였다(표 4). HT에서 대사산물에 대해서는, 역방향 MR(HT에서 C5 수준으로)에서 인과적 연관성이 없음(본페로니 보정 후 IVW P > 0.05)이 추정된 방향성을 뒷받침하였다(표 5). 양방향 MR의 총 효과가 미미하고 상호 증거가 부족한 점을 고려할 때, 이러한 매개 결과는 탐색적 것으로 간주되어야 합니다.

유세포검사 분석법 CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Treg 검출

대사체 분석 결과를 검증하기 위해, CD39⁺ Treg와 혈장 C5의 발현 특성을 평가하기 위한 시험관 내 실험 검증이 수행되었습니다. 유세포검사는 호르몬 호르몬 치료 환자와 건강한 대조군의 말초혈에서 Treg 세포(CD3⁺CD4⁺CD25⁺)와 그 CD39⁺ 소집합(CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺)을 정량하는 데 사용되었습니다. 그림 4A–C에서 보듯, HT 환자에서 Treg 세포(CD3⁺CD4⁺CD25⁺)와 CD39⁺ Treg 하위 집합 모두 건강한 사람에 비해 유의하게 증가했습니다(P < 0.001). 또한 연속 질량분석법을 이용한 표적 혈장 대사체 프로파일링은 HT 그룹에서 C5 수치가 현저히 높았음을 보여주었다(P < 0.001, 그림 4D). 또한 피어슨 상관관계 분석에서는 혈장 C5 수치와 CD39⁺Treg 하위 집합 빈도 사이에 양의 상관관계가 있음을 보여주었으며(그림 4E), 이는 MR에서 확인된 추정 CD39⁺Treg-C5-HT 경로와 일치합니다. 그러나 단면 설계와 작은 표본 크기로 인해 이러한 데이터만으로는 인과관계를 추론하기 어렵습니다.

데이터 가용성:

하시모토 갑상선염에 대한 전유전체 연관 연구(GWAS) 요약 통계는 GWAS 카탈로그(ebi-a-GCST90018855; https://gwas.mrcieu.ac.uk/)에서 얻어졌습니다. 면역 세포 특성에 대한 요약 통계는 GWAS 카탈로그(ebi-a-GCST90001391에서 ebi-a-GCST90002121; https://www.ebi.ac.uk/gwas/ 에서 수집됨). 혈장 대사물 GWAS 데이터는 GWAS 카탈로그(GCST90199621-GCST90201020; https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020)에서 수집되었습니다. 이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터는 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

그림 1: 하시모토 갑상선염에 대한 면역세포 형질의 인과 효과를 보여주는 포레스트 플롯. 이 연구에서 평가된 모든 면역세포 형질이 하시모토 갑상선염(HT)에 미치는 인과 효과를 요약한 숲 플롯. 약어: nsnp, 단일 염기다형성(SNP) 수; pval, P 값; 또는 오즈비; 신뢰구간(CI), 신뢰구간. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: 하시모토 갑상선염이 면역세포 표현형에 미치는 인과 효과를 보여주는 포레스트 플롯. HT가 다양한 면역세포 표현형에 미치는 인과 효과를 요약한 숲 플롯. 약어: nsnp, SNP 수; pval, P 값; 또는 오즈비; 신뢰구간(CI), 신뢰구간. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: CD39+와 하시모토 갑상선염 사이의 혈장 이소발레릴카르니틴(C5)의 매개 효과를 보여주는 숲 그래프. CD39+와 HT 간 연관성을 매개하는 혈장 C5의 인과 효과를 요약한 포레스트 플롯. 약어: OR, 오즈비; 신뢰구간(CI), 신뢰구간. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: 하시모토 갑상선염 환자에서 CD39+ 조절 T 세포 및 혈장 이소발레릴카르니틴(C5) 수치의 발현. (A) 조절 T(Treg; CD3+CD4+CD25+) 세포와 CD39+ Treg 세포가 포함됩니다. (B) 총 트레그 세포 수치. (C) CD39+ 트레그 세포 수치. (D) 혈장 이소발레릴카르니틴(C5) 농도는 탠덤 질량분석법으로 측정되었습니다. (E) 혈장 이소발러릴카르니틴(C5) 수치와 CD39+ Treg 세포 비율 간의 피어슨 상관관계 분석. 약어: SSC-A, 측면 산란 영역; FSC-A, 전방 산란 영역; FSC-H, 전방 산란 고도. P < 0.001과 건강한 대조군. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: 하시모토 갑상선염에 유의미하게 연관된 9가지 혈장 대사산물의 인과관계.  이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 이소발레릴카르니틴(C5) 수치가 하시모토 갑상선염(β₂)에 미치는 인과 효과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3: CD3+CD39+ 조절 T 세포가 하시모토 갑상선염에 미치는 인과 효과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 4: 이소발러릴카르니틴(C5) 수치가 CD3+CD39+ 조절 T 세포에 미치는 인과 효과. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 5: 하시모토 갑상선염이 이소발레릴카르니틴(C5) 수치에 미치는 인과관계. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 1: 연구 설계 및 분석 워크플로우. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 2: 32가지 면역세포 형질과 하시모토 갑상선염 간의 연관성에 대한 인과 추정치를 보여주는 산점도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 그림 3: 하시모토 갑상선염에 대한 32가지 면역세포 형질의 인과적 효과를 평가하는 생략 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 4: 하시모토 갑상선염이 6개의 면역 세포 표현형에 미치는 인과 영향을 보여주는 산점도. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 5: 하시모토 갑상선염이 여섯 가지 면역세포 표현형에 미치는 인과적 영향의 견고성을 평가하는 생략 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 그림 6: 이소발레릴카르니틴(C5) 수치와 하시모토 갑상선염 위험 간의 인과관계. (A) 이소발레릴카르니틴(C5) 수치가 HT 위험(β₂)에 미치는 인과관계를 보여주는 숲 그래프. (B) 각 SNP가 HT 위험에 미치는 인과 효과 추정치를 보여주는 산점도. (C) 멘델 무작위화(MR) 추정치의 이질성을 평가하는 깔때기 플롯 작성. C5 수준이 HT 위험에 미치는 영향. (d) 전체 위험 추정치가 개별 SNP에 의해 실질적인 영향을 받지 않았음을 입증하는 생략 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

추가 그림 7: CD3+CD39+ 조절 T 세포와 하시모토 갑상선염 위험 간의 인과 연관성. (A) CD3+CD39+ 조절 T 세포가 HT 위험에 미치는 전체 인과관계를 보여주는 숲 플롯. (B) 각 SNP가 HT 위험에 미치는 인과 효과 추정치를 보여주는 산점도. (C) CD3+CD39+ 조절 T 세포가 HT 위험에 미치는 MR 추정치의 이질성을 평가하는 깔때기 플롯. (d) 전체 위험 추정치가 개별 SNP에 의해 실질적인 영향을 받지 않았음을 입증하는 생략 분석. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 1: 멘델 무작위화 분석에 사용되는 혈장 대사산물의 유전체 연관 연구 데이터셋의 특성.  이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 2: 멘델 무작위화 분석에서 노출로 사용되는 주요 면역세포 표현형에 대한 도구 변수(SNP) 및 F-통계량의 특성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 3: 하시모토 갑상선염에 대한 면역세포 표현형의 멘델 무작위화 분석을 위한 다면형성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 4: 하시모토 갑상선염에 대한 면역세포 표현형의 멘델 무작위화 분석을 위한 이질성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 표 5: 하시모토 갑상선염의 면역세포 표현형에 대한 멘델 무작위화 분석을 위한 다면성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 표 6: 면역세포 표현형에 대한 하시모토 갑상선염의 멘델 무작위화 분석을 위한 이질성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 7: 혈장 대사산물과 관련된 단일 염기체 다형성. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 8: 하시모토 갑상선염에 대한 멘델 무작위화 혈장 대사물 분석의 다면성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 표 9: 하시모토 갑상선염에 대한 혈장 대사산물의 멘델 무작위화 분석을 위한 이질성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 10: 혈장 대사산물에 의한 면역세포 표현형 매개–하시모토 갑상선염 연관성 매개를 위한 다면형성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충표 11: 혈장 대사산물에 의한 면역세포 표현형–하시모토 갑상선염 연관성 매개를 위한 이질성 평가. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 이 연구 결과를 뒷받침하는 데이터. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구에서는 멘델 무작위화를 적용하여 면역세포 표현형이 하시모토 갑상선염(HT)에 미치는 인과적 영향을 조사하고, 혈장 대사산물의 매개체 역할을 탐구하였습니다. 수지상세포, 조절 T세포, T 세포 성숙 단계, B 세포, 골수계 세포 등 32가지 면역 표현형이 HT 위험과 연관되어 있으며, 위험 촉진 및 보호 효과를 모두 지니고 있습니다. 더불어, 9종의 혈장 대사산물은 HT와 인과관계를 보여주었으며, C5가 CD39⁺ 분비 Treg 세포의 CD3 발현과 HT 간의 연관성을 부분적으로 매개할 수 있음을 관찰하였습니다. 이러한 발견은 직접적인 기전적 확인보다는 유전 기구에서 추론된 추정 인과적 효과의 증거로 해석되어야 합니다.

cDC 표현형 중 CD62L- 형질세포 DC %DC와 HLA DR은 형수세포체 DC에서 HT 위험 증가와 관련이 있었으며, CD62L+ 골수체 DC에서는 CCR2, 단핵구에서는 CD39+ 활성화된 Treg %활성화 Treg, 단핵구에서는 CD62L이 증가했습니다. 특정 면역세포 표현형과 HT 간의 연관성은 질병의 발병 기전에 대한 새로운 통찰을 제공합니다. 예를 들어, HT 위험은 HLA DR과 같은 형질세포 DC 및 CD62L 형질세포 DC의 특성과 상관관계가 있어, 이러한 세포 유형이 갑상선에 대한 자가면역 반응을 시작하거나 유지하는 데 필수적일 수 있음을 시사^합니다. 수많은 연구에서 HLA DR+ 갑상선 상피세포가 HT 28,29,30,31 환자의 갑상선 내 면역 반응을 적극적으로 자극한다는 것이 입증되었습니다. 이 연구는 HLA DR이 형질세포체에 대해 보고하고 HT 위험 증가 간의 상관관계를 밝혀내어, HLA DR이 형질세포체에 대한 HLA DR이 HT의 원인일 수 있음을 시사합니다. 이전 연구들은 생물정보학 방법을 통해 HT에 대해 높은 진단 정확도를 가진 핵심 유전자를 확인했으며, 면역분석법에서는 단핵구 침윤이 핵심 유전자 발현과 음의 상관관계를 보임을 보여주었습니다. Xu 등은 단핵구에서 CD62L 발현 수준이 높을수록 HT 위험 감소와 연관이 ^{있다고 보고했으며}, 이는 현재 연구 결과와 일치합니다. 구체적으로, CD62L+ 골수상 세포의 CCR2와 단핵구의 CD62L과 같은 표현형은 보호 효과와 연관되어 갑상선 자가면역을 완화할 수 있는 조절 또는 억제 역할을 시사합니다.

수많은 증거가 Th17과 Treg 세포 균형이 HT^33,34 진행에 중요한 역할을 한다는 점을 지적합니다. 이 연구는 HT와 여러 Treg 특성 간의 인과관계를 밝혀냈습니다. 구체적으로, HT 발병 위험은 CD39+ 안정 조절 T 세포에서 CD25 발현과 역비례 관계가 있었으며, HT³⁵ 진행 시 Th17/Treg 비율이 증가하는 것이 관찰되었습니다. 조절 T 세포가 면역 내성을 유지하고 자가면역 질환을 예방하는 복잡한 기능을 한다는 점은, 다양한 Treg 표현형이 HT 위험 증가와 낮춤 모두와 강한 상관관계를 보여준다는 점에서 강조됩니다. 트레그 세포는 이중 구조로, 일부 하위 세포는 자가면역 반응을 악화시킬 수 있고, 다른 세포는 억제합니다. 이는 HT에서 이들의 역할을 정확히 정의하기 위한 추가 연구의 필요성을 강조합니다.

더불어, T 세포 성숙 단계인 TBNK, 단핵구, B 세포 그룹에서는 일부 면역 표현형이 HT 위험 증가와 연관된 반면, 다른 세포는 보호 효과를 주는 일관된 패턴이 관찰되었습니다 32,36,37,38. 이는 면역 세포가 HT 발달에 얼마나 복잡하게 관여하고 있는지를 강조합니다. 또한 HT가 면역세포 특성에 미치는 영향을 조사하기 위해 역MRI 분석도 수행되었습니다. 분석 결과 HT는 CD4 조절 T 세포 및 단핵구 MDSC 분비 등 특정 면역 세포 표현형의 증가와 관련이 있으며, 특히 활성화된 CD4 조절 T 세포와 CD25+ CD4+ T 세포 등 다른 세포의 수치를 감소시키는 것으로 나타났습니다.

특히, 매개 분석은 면역세포 표현형에서 HT 발달로의 진행에서 C5 수치의 인과적 역할을 강조합니다. 이전 연구들은 혈장 C5 수치가 당뇨병성 말초 신경병증 발병에 기여^{하며, 근} 감소증과 골격근 지수 감소와 상관관계가 있음을 보여주었다⁴⁰. 또한, 지질 대사 측면에서 허약 표현형⁴¹을 가진 개인에서 이소발레릴카르니틴 농도가 낮아지는 것이 관찰되었습니다. 본 연구에서 관찰된 매개체 비율 8.89%는 C5가 CD39⁺ Treg–HT 경로에서 기전적 연관성을 나타낼 수 있음을 시사하며, 전향적 실험 및 임상 연구에서 후보 바이오마커 및 치료 표적으로서 추가 연구가 필요하다.

이 연구는 귀중한 통찰을 제공하지만, 몇 가지 한계가 고려할 만합니다. 첫째, MR 접근법은 사용된 도구 변수가 유효하며 교란 요인이나 다면성(^42,43,44)에 영향을 받지 않는다는 가정에 기반합니다. 둘째, 주요 MR 분석은 유럽 조상 GWAS 데이터를 기반으로 했으며, 면역 세포 GWAS는 독특한 연관 불균형 구조가 일반화 가능성을 제한할 수 있는 사르데냐 창립 집단에서 유래했습니다; 집단 특이적 적용성을 확인하기 위해서는 다양한 비유럽 코호트에서의 향후 연구가 필요합니다. 셋째, 매개 분석 결과 C5가 탐색적 연관성을 나타낼 수 있는 요인으로 확인되었습니다. 이러한 연관성을 확인하고 잠재적 인구 특이적 효과를 탐구하기 위해 더 다양한 코호트를 포함하는 향후 연구가 필요합니다. 마지막으로, 유세포분석과 혈장 검증 실험이 MR 소견에 대한 지지 증거를 제공했으며; 하지만 표본 크기는 비교적 제한적이었습니다. 이러한 면역 대사 상호작용을 검증하고 CD39⁺Treg 세포나 관련 대사 경로를 표적으로 삼는 것이 HT에 새로운 치료 기회를 제공할 수 있는지 탐구하기 위해 더 큰 실험 및 임상 연구가 필요합니다.

결론

결론적으로, 본 연구는 면역세포 표현형, 특히 CD39⁺ Tregs와 HT 간의 인과관계에 대한 새로운 통찰을 제공하며, 탐색적 매개 분석을 통해 C5가 이 경로의 후보 매개 물질로 확인되었습니다. 이 발견들은 새로운 면역대사 축을 밝혀내며, 자가면역 갑상선 질환에 대한 바이오마커 개발 및 치료 개입을 위한 기전적 통찰과 잠재적 표적을 제시합니다. 향후 더 큰 전향적 코호트를 대상으로 한 연구를 통해 이러한 발견을 더욱 검증하고 HT 치료에서 면역조절의 적용 가능성을 탐구할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD25-PE 단일 클론 항체	BD Biosciences	340938	유인 CD25 검출을 위한 유체 세포계 항체
CD39-PE-Cy7 단일 클론 항체	BD Biosciences	567526	유인 CD39 검출을 위한 유체 세포계 항체
CD4-FITC 단일 클론 항체	BD Biosciences	340133	유인 CD4 검출을 위한 유체 세포계 항체
D3-APC 단일 클론 항체	BD Biosciences	555333	유인 CD3 검출을 위한 유체 세포계 항체
FACS 용해 용액	BD Biosciences	349202	유체 세포계 샘플 준비를 위한 적혈구 용해 버퍼
유체 세포계	BD Biosciences	FACSCanto II	면역 표현형 분석을 위한 다색 유체 세포계 기기
유체 세포계 분석 소프트웨어(FACSDiva)	BD Biosciences	—	유체 세포계 데이터의 수집 및 분석을 위한 소프트웨어
gwasglue 패키지	R 패키지	—	GWAS 데이터셋의 조화
ieugwasr 패키지	R 패키지	—	IEU GWAS 데이터베이스 인터페이스
액체 크로마토그래피–탠덤 질량 분석계 시스템(LC–MS/MS)	Thermo Fisher Scientific	—	혈장 이소발레릴카르니틴(C5)의 정량화에 사용
인산염 완충 생리용액(PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9624	세척 및 재현을 위한 멸균 PBS, pH 7.4
R 소프트웨어	오픈 소스 소프트웨어	버전 4.4.1	통계 분석 환경
TwoSampleMR 패키지	R 패키지	—	멘델 무작위화 분석 패키지
VariantAnnotation 패키지	Bioconductor	—	변이 데이터 주석