연구 논문

진행성 비소세포폐암 환자에서 다양한 냉동 보존 시간 및 처리 방법 하에서 PBMC의 RNA 품질에 미치는 영향

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DOI:

10.3791/70261

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2026년 4월 21일

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1Biobank, Jilin Cancer Hospital, 2Medical Oncology Translational Research Lab, Jilin Cancer Hospital

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

본 연구는 NSCLC 환자의 PBMC 냉동 보존을 위한 삼중 분리 시약(TRIzol)과 고전적 용액(FBS + DMSO)을 비교합니다. TRIzol은 최대 6개월간 만족스러운 RNA 무결성을 유지하여 고품질 RNA 보존에 권장됩니다.

초록

냉동 보존 말초혈 단핵세포(PBMC)는 RNA 시퀀싱(RNA-seq)에 널리 사용되며, RNA의 품질이 검사 결과에 직접적인 영향을 미칩니다. 그러나 동온 보존은 PBMC에서 RNA 분해를 쉽게 초래할 수 있으며, 장기 냉동 보존 중 RNA 품질을 어떻게 개선할지에 대한 문제는 아직 해결되지 않았습니다. 진행성 비소세포폐암(NSCLC) 환자에서 채취한 신선한 혈액 샘플에서 채취한 PBMCS를 대조군으로 사용하였습니다. PBMC 샘플의 RNA 보존 효과는 고전적 세포 냉동 보존 용액(90% 태아 소 혈청[FBS] + 10% 디메틸설폭증[DMSO])과 일반 RNA 추출 시약(TRIzol) 사이에서 -80 °C에서 1, 3, 6개월 동안 비교되었습니다. RNA 농도, 순도, 무결성(RNA 무결 수[RIN]으로 측정)은 다중 샘플 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계와 자동 마이크로유체 전기영동 생물분석기를 사용하여 고품질 RNA 샘플 보존을 위한 이론적 기초를 마련하였습니다. 이 연구는 PBMCs에서 RNA의 농도, 순도, 무결성이 동면 보존 기간이 길어질수록 감소함을 보여주었습니다. 두 처리 방법은 RNA 농도에는 영향을 미치지 않았지만, RNA의 순도와 무결성에는 영향을 미쳤습니다. TRIzol로 6개월간 냉동 보존된 PBMC의 RNA 무결성은 만족스럽게 유지되었습니다. 우리의 연구 결과는 TRIzol이 효과적인 냉동 보존에 기여하고 고품질 RNA를 유지한다는 것을 보여줍니다.

서론

NSCLC 환자에서 PBMC의 RNA-seq는 면역치료 효능 평가에 중요한 역할을 합니다. 비소세포폐암(NSCLC)은 전 세계적으로 흔한 악성 종양이며, 약 70%의 환자가 후기 단계에서 예후가 좋지 않은 상태로 진단됩니다 1,2. 면역치료는 NSCLC 치료 패러다임에 혁신을 가져왔으며, 혁신적인 치료 전략을 제공합니다 3,4. 면역 체크포인트 억제제(ICI) 치료에서, NSCLC 환자로부터 얻은 말초혈 단핵세포(PBMC)의 RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 통해 면역치료의 임상적 이점 변화를 모니터링할 수 있습니다. RNA-seq의 샘플 소스는 종양 조직과 PBMCs 6,7이며, PBMC는 임상시험과 기초 과학 연구 모두에서 중요한 생물학적 표본으로 활용됩니다. 냉동 보존은 장기 샘플 저장의 주요 방법을 나타내며, 세포와 조직을 생물학적 잠재력과 특성을 보존하면서 조용한 상태를 유지하는 것입니다. 따라서 PBMC의 냉동 보존은 실현 가능하고 널리 채택된 접근법으로 떠올랐습니다. 냉동 보존 PBMC는 샘플의 배치 분석을 용이하게 하고, 실험실 내 및 실험실 간 변동성을 최소화하며, 자원 활용을 최적화합니다 8,9. 예를 들어, 연구들은 40% 태아 송아지 혈청(FCS)과 20% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 보충한 냉동 RPMI-1640 배지를 PBMC 냉동 보존에 사용하면, CD39와 CD73 조합을 발현하는 T 및 B 세포의 비율이 저장후 6개월 이내에 비교적 안정적으로 유지됨을 보여주었습니다. 한 연구에서는 세 가지 상업용 냉동 보존 키트와 두 가지 냉동 보호제(90% RPMI-10% DMSO, 90% 혈장-10% DMSO)를 비교하여, 모든 방법으로 유사한 세포 생존율(81.0%)과 회복률(73.7%)을 보였습니다. 그러나 모든 냉동 보존 PBMC는 신선한 샘플에 비해 생존율이 현저히 저하된 것으로 나타났다. 추가 연구에서는 TRIzol 시약에 재현탁된 PBMC 침전물이 즉시 -80 °C에서 냉동됨이 입증되었습니다. 1–2일 후, PBMCs의 RIN 값이 전혈 샘플보다 높다는 것을 관찰했다11.

또 다른 연구에서는 TRIzol, RNAlater 및 기타 시약으로 처리된 백혈구 샘플을 비교했으며, 모든 방법을 통해 RNA 무결 수(RIN) 값>7을 달성했습니다. RNA 무결성은 자동 미세유체 전기영동 생물분석기를 사용해 평가되었고, RIN은 RNA 품질의 정량적 측정 지표로 계산되었습니다. RIN ≥7을 포함한 샘플은 RNA-seq 분석에 적합하다고 판단되었습니다12. 특히, 백혈구 + RNA후기군은 백혈구 + TRIzol그룹에 비해 유의미하게 낮은 RNA 수율을 보였다. 그러나 현재 PBMC 냉동 보존 연구는 주로 해동 후 세포 생존력과 면역 세포 표현형 분석에 초점을 맞추고 있습니다; 다양한 보존 조건에서 RNA 품질의 체계적이고 장기적인 평가에는 제한적인 관심이 집중되어 왔습니다. 더불어, RNA 무결성을 보존하기 위한 PBMC 샘플의 냉동 보존 프로토콜은 아직 미개발 상태입니다 13,14,15. 이 격차는 특히 NSCLC 면역치료에서 중요한데, 종단 수집된 PBMC 단백질에서 고품질 RNA가 신뢰할 수 있는 바이오마커 발견과 치료 반응 모니터링에 필수적입니다.

본 연구에서는 냉동 보존 방법 선택이 PBMC에서 유래한 RNA의 장기적 무결성과 품질에 큰 영향을 미치며, 최적화된 프로토콜이 RNA-seq와 같은 민감한 분석법에 대한 RNA 적합성을 유지할 수 있다고 가설을 세웠습니다. 이를 해결하기 위해 진행된 NSCLC 환자에서 채취한 혈액 샘플에서 신선히 분리한 PBMC를 대조군으로 사용했습니다. PBMC 샘플의 RNA 보존 효능은 -80°C에서 두 가지 처리 방법(90% FBS + 10% DMSO 및 TRIzol)을 1개월, 3개월, 6개월 동안 비교하였다(그림 1). RNA 농도, 순도, 그리고 RIN으로 측정된 무결성은 다중 샘플 마이크로볼륨 UV-Vis 분광광도계와 자동 미세유체 전기영동 생물분석기를 사용하여 평가되었습니다. 본 연구는 고품질 RNA 샘플 보존을 위한 이론적 토대를 제공하고, 종양 정밀 의학에서 중개 연구 및 샘플 보존을 발전시키는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

본 연구에서 인간 조직 샘플과 임상 표본을 포함한 모든 시술은 기관 지침을 준수하였으며, 지림암병원 윤리위원회(윤리 승인 번호 202507-002-01)의 승인을 받았습니다. 샘플 수집 전에 모든 참가자 또는 그 법적 보호자로부터 서면 동의를 받았습니다. 지린 암 병원에서 진행성 비소세포폐암(NSCLC) 환자 19명으로부터 말초혈액 샘플(환자당 10mL)을 채취하여 총 133개의 RNA 샘플을 얻었습니다. 실험실 안전을 보장하기 위해 유해 화학물질이 관련된 모든 작업은 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되었습니다.

실험에 사용된 기기, 시약, 소모품에 대한 자세한 정보는 재료표에 제공되었습니다.

PBMC의 격리
말초 혈액 샘플은 채취 후 2시간 이내에 PBMC 분리를 위해 처리되었습니다. PBMC는 상온에서 400 × g 의 피콜-파크 밀도 구배 원심분리를 통해 분리 및 정제되었으며, 제동은 비활성화된 상태였습니다. 원심분리 후, PBMC 포함 중간 우유빛 흰색 림프구층을 신중히 흡인했다16. 중요하게도, 각 샘플과 각 그룹별로 PBMC 입력 농도를 엄격히 표준화하여 모든 실험 조건에서 세포 수가 일관되게 확보되도록 하여 세포 입력과 처리로 인한 변동을 최소화했습니다. 이로 인해 관찰된 차이가 기술적 변동성보다는 서로 다른 보존 방식의 실제 영향을 반영합니다. 각 환자에 대해 분리된 PBMC는 7개의 튜브로 나뉘었고, 한 튜브는 즉각적인 RNA 추출에 사용되었으며, 농도, 순도, 무결성을 평가했습니다. 나머지 6개의 튜브는 분당 -1 °C의 냉각 속도로 냉동 보존되었으며, 3개는 90% FBS + 10% DMSO 1mL로, 나머지 3개는 1 mL TRIzol로 처리한 후 -80 °C에서 저장되었습니다. 1개월, 3개월, 6개월 냉동 보관 후 RNA 추출 및 품질 평가가 수행되었습니다.

RNA 추출
샘플은 -80 °C 저장에서 추출되어 4 °C에서 완전히 해동될 때까지 진행되었습니다. 90% FBS + 10% DMSO 또는 TRIzol 냉동 보존 용액으로 보존된 샘플은 PBS로 한 번 세척한 후 4°C에서 200 × g 에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 버려 세포 펠릿을 유지하였습니다. 총 RNA는 TRIzol을 사용하여 추출하였습니다. 구체적으로, 가공된 샘플이 담긴 마이크로 원심분리관에 TRIzol 시약을 첨가하여 반전시켜 혼합한 후 상온에서 5분간 배양하여 완전한 용해를 보장했습니다. 그 후 200 μL의 클로로포름을 첨가하고 흔들어 완전히 혼합한 후 실온에서 15분간 배큐했다. 2400 × g 에서 4°C에서 15분간 원심분리한 후, 상부 수용상을 신중하게 흡입하여 새로운 에펜도르프 튜브로 옮겼습니다. 그 후 이소프로판올(0.5mL)을 첨가하여 잘 혼합한 후 실온에서 5–10분간 배큐했습니다. 2400 × g 에서 4 °C에서 10분간 원심분리한 후, 상원액은 버려지고 RNA 침전물은 튜브 바닥에 남았습니다.

침전물을 75% 에탄올(1mL)에 부드럽게 흔들어 재현탁한 후, 1600 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리했습니다. 상청액은 버려지고 RNA 펠릿은 실온에서 5–10분간 자연 건조되었습니다. 마지막으로 RNA 샘플은 50 μL DEPC 처리수에 용해되어 55–60 °C 수조에서 5–10분18분간 배양했습니다. RNA 농도와 순도 검출. RNA 농도와 순도는 다중 샘플 마이크로부피 UV-Vis 분광광도계(측정 범위: 2.5–3000 ng/μL)를 이용한 자외선 흡광법을 사용하여 측정하였습니다. RNA 농도는 260 nm에서 흡광도(흡수도) 값을 기준으로 결정되었으며, RNA 순도는 A260/A280 비율로 평가되었습니다. 측정 소프트웨어가 출시되었고; "핵산"이 메인 인터페이스에서 클릭되었다. 검출 플랫폼은 이중 증류수로 두 번 세척한 후 1.5 μL RNA 샘플을 피펫으로 옮겼습니다. 샘플 유형으로 RNA-40 을 선택하고, '측정'을 클릭한 후 농도와 A260/280 순도 값을 기록했습니다. A260/A280 비율이 1.9에서 2.1 사이일 경우 높은 RNA 순도를 나타내고, 1.8 미만은 단백질 오염을 시사하며, 2.2 이상은 잠재적 RNA 분해 또는 잔류 이소티오시아네이트19를 나타냈다.

RNA 무결성 검출
RNA 무결성(RIN)은 자동화된 마이크로유체 전기영동 생물분석기 및 검출 키트를 사용하여 평가하였습니다. RIN은 1에서 10까지 범위가 있으며, 1은 매우 분해된 RNA를, 10은 온전한 RNA를 나타냅니다. 분석을 위해 1.2 μL의 RNA를 PCR 튜브에 넣고, 70°C에서 열변성기를 사용해 2분간 열변성한 후 즉시 얼음 위에 올려놓았습니다. 이후분석하기 위해 1μL 변성 RNA가 칩의 검출 웰에 추가되었습니다. 소프트웨어가 실행되고, 드롭다운 메뉴에서 "Assays"가 선택되었으며, "RNA"가 선택되었습니다. "진핵생물 총 RNA 나노 시리즈 II.xsy" 프로그램은 사용된 시약에 따라 선정되었습니다. "시작"을 눌러 탐지가 시작되었다. 약 10분 후, 사다리의 최고 수와 최고 높이가 정상인지 점검되었습니다.

통계적 방법
모든 데이터에 대해 정규성 검정이 수행되었습니다. 정규 분포 데이터는 표준편차(SD)± 평균 분포 데이터로, 비정규 분포 데이터는 중앙값(4분위 범위, IQR)으로 표현되었습니다. 정규 분포 데이터에 대해서는 쌍 t-검정을, 비정규 분포 데이터에 대해서는 관련 표본 비모수 검정을 사용하여 두 그룹 간 비교를 분석하였다. 세 개 이상의 그룹 간 비교에서는 정규분포 데이터에는 분산 반복 측정 분석을, 비정규 분포 데이터에는 관련 표본 비모수 검정을 사용하였다. 모든 통계 분석은 SPSS 19.0과 GraphPad Prism 9.*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001을 사용하여 수행되었습니다.

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결과

PBMC 샘플에서 서로 다른 냉동 보존 시간과 처리 방법이 RNA 농도에 미치는 영향
서로 다른 냉동 보존 기간의 영향: 진행된 NSCLC 환자의 신선한 PBMC 샘플이 대조군으로 사용되었습니다. 샘플은 TRIzol 또는 90% FBS + 10% DMSO로 처리되어 -80 °C에서 1, 3, 6개월간 보관되었습니다; 총 RNA를 추출하여 RNA 농도를 측정하였습니다. TRIzol 처리 샘플의 네 그룹 간 RNA 농도는 다음과 같았습니다: 신선한 523.5 (485.0) ng/μL, 1개월 후 279.3 (261.7) ng/μL, 3개월 후 217.9 (186.9) ng/μL, 6개월 후 195.8 (294.8) ng/μL이며, 이들 그룹 간 차이는 통계적으로 유의미했습니다(P = 0.0196)(그림 2A). 90% FBS + 10% DMSO로 저장된 샘플의 RNA ...

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토론

생물학적 샘플에서 RNA 품질에 영향을 미치는 요인은 사전 분석 변수, 운반 조건, 상온에서의 처리 기간, 조직 괴사, 온도 및 냉동 생성물, 알리코트 크기와 수, 저장 기간이 RNA 품질에 중요한 영향을 미칩니다. 동일한 샘플의 경우, 냉동 보존 시간과 처리 방식의 차이가 RNA 품질에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. 이전 연구들은 RNA 무결성의 중요성을 강조했는데, RIN 값이 낮을수록 분해된 RNA 분자 비율이 높아져 후속 실험 결과에 심각한 영향을 줄 수 있기 때문입니다.

본 연구는 TRIzol이 진행된 NSCLC 환자의 PBMC 장기(-80°C) 저장을 위한 고전적인 90% FBS + 10% DMSO 냉동 보존 용액을 대체할 수 있으며, RNA-seq에 적합한 고품질 RNA를 효과적으로 보존할 수 있음을 제안합니다. 우리는 표준화된 PBMC RNA 품질 평가 프로토...

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공개 사항

저자들은 이해 충돌이 없음을 선언한다.

감사의 글

실험에 도움을 주시고 기금을 지원해 주신 참가자분들께 감사드립니다. 이 연구는 지린성 과학기술부(보조금 번호 YDZJ202501ZYTS691), 지림성 보건위원회(보조금 번호 2023jc064)의 보조금으로 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
애질런트 2100 바이오분석기애질런트G2939BRNA 무결성 검출, RNA 무결 수(RIN) 생성을 통한 RNA 품질 평가
애질런트 RNA 6000 나노킷애질런트5067-1511  그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;Agilent 2100 바이오분석기와 함께 RNA 무결성을 위한 전용 시약과 칩을 제공합니다
원심분리기와 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;에펜도르프와 nbsp; 그리고 nbsp;5424RRNA 추출을 위해
원심분리기와 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;에펜도르프와 nbsp; 그리고 nbsp;5810RPBMC 추출을 위해
클로로포름   그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp; 그리고 nbsp;중국국가제약그룹공사20191031트리졸 방법을 통한 RNA 추출에는 RNA가 포함된 수상과 유기 상의 불순물을 분리하는 데 사용됩니다
디메틸 설폭사이드베이징 딩궈 창성DH105-2PBMC의 냉동 보존 솔루션으로서, -80 & 도도에서 샘플을 장기 저장할 수 있게 해줍니다. C
튜브코닝MCT-150-C샘플 저장, 시약 혼합, 원심분리 및 기타 실험 작업을 위해
에탄올산둥 리얼캉25071901A잔여물을 제거하기 위해 RNA 침전물을 세척하는 데 사용되는 트리졸 방법(Trizol method)에 의한 IIn RNA 추출
태아 소 혈청엑스비오메드C04001-500PBMC의 냉동 보존 솔루션으로서 장기 저장을 가능하게 합니다.
피콜 분리 해법베이징딩궈창성생명공학 주식회사CC0161밀도 구배 원심분리를 통한 PBMC 분리 및 정제를 위해
GeneTouch(Plus) 열 사이클러바이오어TC-EA-48DARNA의 열적 변성(70 & deg; C 2분간 측정), 이후 바이오분석기로 검출합니다
이소프로판올중국국가제약그룹공사20210929트리졸 방법에 의한 RNA 추출에서 RNA 침전에 사용됩니다
나노드롭 8000 분광광도계유전자 회사ND-8000자외선 흡수법을 사용하여 RNA 농도(260 nm 흡광도 기준)와 순도(A260/A280 비율 기준)를 측정하기 위해
PCR 튜브코닝PCR-02-CRNA의 열적 변성(70 & deg; C 2분간 측정), 이후 바이오분석기로 검출합니다
인산 완충 식염수 프로셀 시스템PB180327PBMC 또는 이후 총 RNA의 직접 용해 및 보존을 위해
삼중 격리 시약 아드신ADS60154PBMC 또는 이후 총 RNA의 직접 용해 및 보존을 위해

참고문헌

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