이 연구는 경피적 신동맥색전술과 빠른 심방 조율을 통해 만성 중등도 신폐부전과 심방세동을 결합한 새로운 생체 내 비글 모델을 확립했으며, 이 조합이 좌측 심방 내피 기능을 심각하게 저하시키고, 응고를 촉진하며, 염증 및 RAAS 매개 경로를 통해 혈전증 위험을 높인다는 것을 입증하였습니다.
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연구 논문
* These authors contributed equally
이 연구는 경피적 신동맥색전술과 빠른 심방 조율을 통해 만성 중등도 신폐부전과 심방세동을 결합한 새로운 생체 내 비글 모델을 확립했으며, 이 조합이 좌측 심방 내피 기능을 심각하게 저하시키고, 응고를 촉진하며, 염증 및 RAAS 매개 경로를 통해 혈전증 위험을 높인다는 것을 입증하였습니다.
심방세동(AF)과 신부전(RI)의 동반 현상은 임상적으로 복잡한 현상으로 높은 유병률을 보입니다. 본 연구는 만성 중등도 RI와 심방세동이 결합된 상태가 비글 동물의 좌심방내피 기능에 미치는 영향을 조사하였습니다. 만성 RI는 젤라틴 해면 과립을 이용한 왼쪽 신동맥 주요 분기의 경피적 색전술로 유도되었으며, 만성 신장 실질 손상이 발생하도록 동물을 3개월간 유지하였습니다. 이후 AF는 연속적인 급속 심방 박동(기본 주기 길이 60ms; 전압, 이완기 조박 임계치의 4배; 180분)에 의해 유도되었습니다. 조직학적 변화는 헤마톡실린과 에오신 염색을 사용하여 평가하였다. 혈장 및 심장 조직에서 내피 기능, 응고, 섬유소용해, 염증, 레닌-안지오텐신-알도스테론계(RAAS) 활성과 관련된 매개변수를 효소 연합 분석법, 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응, 웨스턴 블롯팅을 통해 조사하였습니다. 결과는 중등도 RI를 가진 만성 신장 손상 모델이 성공적으로 확립되었음을 보여주었으며, 혈장 크레아티닌, 요소 질소, 크레아티닌 제거율 감소로 확인되었습니다. RI와 AF가 복합된 비글에서 좌심방 내피 기능이 유의하게 손상되었으며, 응고 촉진 효과 증가와 섬유소용해 감소가 동반되었습니다. 염증 지표는 RI 시술 또는 AF 유도 후 상승했으며, RI+AF 복합군에서는 더욱 증가하였습니다. 또한, RI 이후 레닌과 알도스테론 수치 증가로 나타나는 RAAS 활성이 상승했으며, AF와 병용하면 더욱 증가했습니다. 요약하자면, 본 연구는 비글 동물에서 만성 중등도 RI와 AF가 결합된 생 체 내 동물 모델을 성공적으로 확립하여, 이 조합이 좌심방 내피 기능을 현저히 방해하고 혈전성 위험을 증가시킨다는 것을 입증하였습니다.
심방세동(AF)은 지속성 심장 부정맥의 가장 흔한 형태로, 불리한 임상 결과와 밀접한 관련이 있습니다. AF의 전신 병태생리학적 특성 때문에, 이 부정맥은 인지 저하, 우울증, 전신 색전증 등 다양한 동반 기존질환과 복잡한 병태생리학적 교차 관계를 자주 보입니다. 만성 신장 질환(CKD)은 AF 발생과 혈전색전증 발생 모두에 독립적인 위험 요인으로 확인되었습니다. CKD 진단 환자의 약 15%에서 20%가 심방세동에 영향을 받으며, 신장 대체 치료를 받는 환자 중 심방세동이 발병하는 비율은 15%에서 40% 사이입니다2. 한편, AF 진단을 받은 환자의 약 30%에서 60%는 경증에서 중등도의 신부전(RI)을 동시에 겪고 있습니다3. 따라서 AF와 RI의 공동 발생은 환자 집단에서 높은 유병률을 보이는 복잡한 임상 현상이 되었습니다. AF와 RI의 양방향 관계는 AF 발생 위험을 심각하게 증가시키고 신장 기능 장애의 진행을 악화시켜 결국 임상 결과 악화에 기여합니다.
이전 연구에서는 쥐를 이용해 RI 모델을 확립하는 경우가 많았으나; 하지만 심장 크기가 작아 심장 전기 생리학적 실험에는 적합하지 않습니다. 반면, 개는 중대형 동물 신부전 모델에서 자주 사용되며, 신장 절제술이 주요 모델링 방법입니다. 그럼에도 불구하고, 이 접근법은 제한된 모델링 성공률과 관련이 있습니다. 더 중요한 것은, 신장 절제술이 신장 실질에 직접 손상을 일으키지 않기 때문에 신부전의 병리학적 과정을 효과적으로 시뮬레이션하지 못한다는 점입니다. 따라서 RI와 AF를 갖춘 적합한 동물 모델을 구축하는 것이 필수적입니다. 주목할 만한 점은, Liang Z 등은 왼쪽 신장 신장 동맥의 작은 가지를 젤라틴 해면 과립을 이용해 2주간 색전술을 통해 비글에서 경미한 RI 모델을 성공적으로 확립했으며, 이는 AF6과 관련이 있었다; 그러나 만성 신병증의 특징인 사구체 경화증과 세뇨관 간질성 섬유증은 동물 모델에서 완전히 발달하려면 장기간의 지속적인 신장 실질 손상이 필요하기 때문에 임상 CKD를 시뮬레이션하기에 일반적으로 2주간의 관찰 기간이 충분하지 않다고 여겨집니다 7,8. 이는 임상 CKD의 진행적 특성을 더 충실히 재현하는 더 긴 관찰 기간의 만성 모델의 필요성을 강조합니다.
따라서 본 연구는 비글에서 왼쪽 신장 동맥의 주 줄기를 경피적 색전술로 시행하고, 동물을 3개월간 유지하여 만성 신장 병리가 확립되도록 하여 만성 중등도 RI와 AF가 결합된 동물 모델을 구축하는 것을 목표로 하였다. 또한, 이러한 병리학적 조건에서 좌심방 내피 기능 장애의 발병 기전을 탐구하여, 만성 중등도 RI와 AF의 결합이 염증 증진과 RAAS 활성화를 통해 좌심방 내피 기능을 시너지 효과로 저해하여 어느 한 질환만으로는 혈전증 위험을 증가시킬 수 있다는 가설을 검증하였습니다. 이 발견들은 만성 RI와 AF의 결합에 대한 이해를 더 깊이 제공하고, AF 및 RI 환자에서 항응고제 치료의 이점에 대한 추가 연구의 기초를 마련할 수 있습니다.
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이 연구는 미국 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(출판 번호 85-23, 1996년 개정판)의 권고사항에 엄격히 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜은 베이징 안전병원 기관 동물 관리 및 이용 위원회(승인 번호 81700293)에서 승인되었습니다. 연구 프로토콜은 우리 기관의 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 검토 및 승인되었습니다. 동물의 고통을 최소화하고 연구에 사용되는 동물 수를 줄이기 위한 모든 노력이 기울여졌습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.
1. 동물 모델 및 실험 설계
2. 만성 중등도 RI 유도를 위한 신동맥색전술
5F 다목적 카테터가 동맥막을 통해 삽입되었고, C암 형광투시 유도 하에 복부 대동맥으로 진입되었습니다. 선택적 좌측 신장 동맥 캐뉼 삽입이 시행되었고, 기초 신장 동맥 조영술은 3 mL/s 속도로 5–8 mL의 비이온 요오드 조영제를 주입하여 완전한 신장 동맥 나무를 시각화하였습니다. 성공적인 카테터 위치 확인은 혈관조영술 이미지에서 좌측 신장 동맥 전체와 그 가지를 시연하여 확인되었습니다.
그 후 흡수성 젤라틴 해면 과립(직경 50mg)을 이용해 좌신동맥 주 가지에 경피적 색전술을 통해 RI를 유도하였다. 젤라틴 스펀지 과립은 약 50mg의 과립과 조영제, 생리식염수를 1:1로 혼합하여 총 부피를 약 2–3mL로 만들어 슬러리로 제조했습니다. 색전술 슬러리는 카테터를 통해 수작업 주입하여 약 2–3분 동안 지속적으로 형광 투시 모니터링을 통해 천천히 주입되었습니다. 색전술은 반복된 좌측 신장 동맥 조영술로 확인되었으며, 색전된 가지에서 원위 동맥 불공화가 없음을 입증하였습니다. 혈관조영술 확인 후 카테터와 시스를 제거하고 대퇴동맥은 6-0 폴리프로필렌 봉합사로 봉합하였습니다. 수술 상처는 여러 겹으로 봉합되었고, 동물들은 면밀한 관찰 하에 회복할 수 있도록 허용되었습니다.
대조군과 AF 그룹(가짜 절차)에서는 동일한 카테터 삽입 과정이 수행되었으며, 신장 동맥 조영술 후 다목적 카테터를 통해 동일한 용량(2–3 mL)의 정상 식염수를 좌측 신장동맥에 주입하였습니다.
3. 급속 심방 조율에 의한 심방 유도
RI 시술(또는 가짜 시술) 3개월 후, AF군과 RI+AF 그룹에서 AF가 유도되었습니다. 총 12마리의 비글에서 AF가 유도되었으며(AF 그룹은 n = 6, RI+AF 그룹은 n = 6), 위에서 설명한 재마취 및 혈관 접근을 마친 후, 오른쪽 대퇴정맥을 캐닐레이팅하여 카테터 삽입을 하였습니다. 6F 쿼드리폴라 전극 카테터(재료표 참조)가 형광투시 유도 하에 진행되어 우심방 측벽에 설치되었습니다. 카테터 위치가 올바른 것은 심장 내 채널에 특징적인 심방 전전도를 기록하여 명확하고 날카로운 심방 편향을 보여주는 것으로 확인되었습니다. 이완기 조율 임계값 은 5V에서 0.1V 감소 단위로 자극기 출력 전압을 점진적으로 감소시켜 심방 포획 손실이 관찰될 때까지 결정했습니다; 최저 전압이 일관된 1:1 심방 포획을 달성한 것이 이완기 박동 임계치로 기록되었습니다. 고속 심방 조율(기본 주기 길이 60ms, 분당 1000회 박동에 해당; 출력 펄스 폭 2ms; 전압, 이완기 심박 임계값의 4배, 일반적으로 2–4 V에 해당)이앞서 설명한 심장 자극기를 사용해 180분 동안 연속적으로 투여되었습니다. 심방 유도의 성공은 표면 심전도에서 지속되는 불규칙한 R-R 간격과 심박 조박 중단 후 최소 1분 이상 지속되는 심방전위와 빠르고 혼란스러운 심방전위로 확인되었다. 12마리의 비글 모두(100%)는 페이싱 프로토콜 완료 후 지속 AF를 달성했습니다. 조율 중단 후 지속 심방 세동의 평균 지속 시간은 자발성 동동경전(동동리듬) 전 3분에서 8분 사이였다.
AF 감수성 평가에 사용되는 폭발 보조 프로토콜(일반적으로 3–10초 폭발)과 달리, 본 연구에서 사용된 180분 연속 신속 심방 조기 조기 심방 조기 조기 재형성을 유도하기 위해 특별히 설계된 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 개 AF 연구에서 잘 확립되고 광범위하게 검증되었습니다 9,10.
4. 실험 설계 및 그룹 배정
실험 동물들은 무작위로 네 그룹(n=6개)으로 배정되었습니다: 대조군, RI 그룹, AF 그룹, 그리고 AF(RI+AF) 그룹과 결합된 RI. RI 그룹과 RI+AF 그룹의 비글은 기저 시점에 RI 색전술을 받았고, 대조군과 AF 그룹의 비글들은 신장동맥에 가짜 생리식염수 주사를 받았습니다. 3개월 후, 앞서 설명한 대로 AF와 RI+AF 그룹에서 AF가 유도되었습니다. 전체 실험 설계와 일정에 대한 도식적 개요는 그림 1에 제시되어 있습니다.
5. 크레아티닌 제거 결정
크레아티닌 제거율(CCr)은 30분 내인성 크레아티닌 제거법11을 사용하여 측정하였습니다. 마취 후 잠시 동안 무균 상태에서 폴리 카테터를 요광에 삽입하여 방광을 완전히 비웠습니다. 이후 30분간의 소변 수집 기간이 시작되었으며, 이 기간 동안 모든 소변 배출물을 카테터 를 통해 보정된 수집 용기로 수집했습니다. 30분 채취 기간이 끝난 후, 소변이 완전히 회복되도록 방광을 다시 비웠습니다. 동시에 혈장 크레아티닌 측정을 위해 경정맥에서 중간 지점 혈액 샘플을 채취하였다. CCr는 표준 공식으로 계산되었습니다: CCr (mL/min/kg) = (소변 크레아티닌 농도× 소변 부피) / (혈장 크레아티닌 농도× 채취 시간), 체중에 정규화됨.
6. 조직 및 혈액 샘플 수집
혈액 샘플은 기저선 시점과 EDTA 항응고 및 일반 혈청 분리관에 희생되기 전에 경정맥에서 채취하였다11. 결국 모든 비글은 마취 회복 전 150 mg/kg 용량의 치사량 펜토바르비탈 나트륨을 정맥 주사로 안락사시켰습니다. 조직학적 검사를 위해 신장이 채취되었다. 심장을 채취한 후 좌심방 부속지(LAA)를 조심스럽게 해부하여 절제 후 5분 이내에 액체 질소에 급동하여 분자 분석할 때까지 −80 °C에서 보관했습니다. LAA는 AF 환자에서 혈전 형성이 가장 흔한 부위이기 때문에 조직 분석에 선정되었으며, 따라서 내피 기능과 혈전증 위험을 평가하는 데 가장 임상적으로 중요한 해부학적 부위를 나타냅니다.
7. 조직학적 관찰
신장 조직은 10% 중성 완충 파라포름알데히드에 24시간 고정되고, 등급별 에탄올 시리즈(70%, 80%, 90%, 95%, 100% 에탄올, 각각 1시간)를 통해 탈수한 후, 자일렌으로 정화(두 번, 각각 30분), 파라핀에 박힌 후 회전식 미세절기를 이용해 5 μm 두께의 슬라이스로 절단했습니다. 그 후, 절단부를 HE로 염색하여 조직병리학적 변화를 관찰하였습니다. 구체적으로, 절편은 자일렌에서 탈파라핀(두 번, 각각 10분씩), 하강 에탄올 시리즈를 통해 재수화한 후, 헤마톡실린 용액으로 5분간 염색, 1% 염산-에탄올로 30초간 분별, 흐르는 수돗물에서 10분간 세척, 에오신 용액으로 2분간 교환, 탈수, 투명화, 중성 발삼으로 부착하였습니다. 절편은 100× 400× 배율로 광학 현미경으로 검사되었다.
8. 효소 결합 면역흡착 검사법(ELISA)
혈액 샘플은 3000 × g 4 °C에서 20분간 원심분리한 후, 상청액(혈장)을 수집하여 −80 °C에서 저장하여 분석했습니다. 크레아티닌, 요소 질소, 폰 빌레브랜드 인자(vWF), 트롬보모듈린(TM), 비대칭 디메틸라르기닌(ADMA), 일산화질소(NO), 플라스미노겐 활성화제 억제제-1(PAI-1), 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA), 종양괴사 인자-α(TNF-α), 고민도 C-반응성 단백질(hs-CRP), 인터루킨-6(IL-6), 레닌, 알도스테론(ALD)의 혈장 수치를 제조사 지침에 따라 검사하였다. 간단히 말해, 항체 코팅된 96웰 마이크로플레이트에 100 μL 혈장 샘플 또는 표준 샘플을 첨가하고, 37 °C에서 2시간 배양, 워시 버퍼로 4회 세척, 37 °C에서 비오티닐화 검출 항체로 1시간 배양, 다시 세척, 스트렙타비딘-HRP 결합체로 37 °C에서 30분간 배양한 후, 어둠 속에서 15–20분간 TMB 기질 현상을 진행했습니다. 반응은 50 μL 정지 용액으로 중단되었고, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 450 nm 거리에서 흡광도를 측정했습니다. 모든 샘플은 두 차례로 분석되었습니다.
9. 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)
TRIzol 시약을 사용해 LAA 조직에서 총 RNA를 추출한 후, 260/280 nm 흡광도비(허용 범위 1.8–2.0)에서 분광광도계를 이용해 RNA 순도와 농도를 검출하였습니다. 총 1 μg의 RNA 가 PrimeScript RT 시약 키트를 사용해 상보적 DNA(cDNA)로 역전사되었습니다. 역전사 반응 은 37°C에서 15분간 수행되었고, 이후 85°C에서 5초간 비활성화되었습니다. 이후 SYBR 그린 마스터 믹스를 사용하여 PCR 시스템에서 정량적 실시간 PCR이 수행되었습니다. 열 사이클링 프로그램은 95 °C에서 5분간 초기 변성, 이어서 95 °C에서 10초간 변성, 60 °C에서 30초간 어닐링/연장 40회 사이클로 구성되었습니다. 각 확장 단계 종료 시 SYBR 그린 채널을 사용하여 형광 신호를 검출했습니다. 임계 주기(Ct) 값은 계측기 소프트웨어에 의해 자동으로 결정되었습니다. mRNA 수준 폴드 변화는 2−ΔΔCt 방법을 사용하여 측정되었습니다. β-액틴은 내부 통제 역할을 했습니다. 모든 샘플은 3부로 검사되었습니다.
10. 서부 블롯팅
총 단백질은 방사면역침전법(RIPA) 용해 완충제(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% 디옥시콜레이트 나트륨, 0.1% SDS, 프로테아제 및 인산효소 억제제 혼합물로 구성됨)를 사용하여 LAA 조직에서 추출되었으며, 재료표 참조). 조직은 얼음 위에 균질화되어 12,000 × g, 4 °C에서 15분간 원심분리한 후 상청액을 수집했습니다. 단백질 농도는 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 정량화하였습니다. 이후 동일한 양의 단백질(레인당 30 μg)을 12% SDS-PAGE에 노출하여 80 V에서 30분간 분리(스태킹 겔), 이어서 120 V에서 약 60분(해상 겔)을 사용한 후, 300 mA 용량의 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 막에 90분간 전달 버퍼(25 mM Tris, 192 mM 글리신)를 투여했습니다. 메탄올 20%입니다. 막은 5% 무지방 우유를 TBST(Tris 완충 식염수, 0.1% Tween-20)에 용해하여 실온에서 2시간 동안 차단한 후, 1차 항체(항체 출처, 카탈로그 번호, 희석 기준)로 4°C에서 밤새 탐침하였습니다. 다음 날에는 막을 TBST로 세 차례(각각 10분씩) 세척하고, 상온에서 해당 HRP 결합 2차 항체(재료표 참조)와 함께 2시간 배양했습니다. 추가로 세 번의 TBST 세척(각 10분) 후, 증강 화학발광(ECL) 키트와 화학발광 영상 시스템을 사용해 블롯을 시각화하였습니다. 글리세르알데히드-3-인산 탈수소효소(GAPDH)가 내부 대조군으로 작용했습니다. ImageJ 소프트웨어를 사용하여 덴시토미터 분석을 수행하였으며, 상대적인 단백질 발현 수준이 GAPDH로 정규화되었습니다. 검출된 단백질의 대략적인 분자량은 다음과 같았습니다: vWF(~260 kDa), TM(~60 kDa), 내피 질산화물 합성효소(eNOS, ~130 kDa), 유도성 일산화질소 합성효소(iNOS, ~130 kDa), PAI-1(~45 kDa), t-PA(~70 kDa), GAPDH(~36 kDa). 전체 길이의 자르지 않은 서부 블롯 이미지는 보충 그림 1과 보충 그림 2에 제공되어 있습니다.
11. 통계 분석
모든 값은 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용해 분석되었으며, 표준편차(SD)± 평균으로 제시되었습니다. 데이터 분포의 정규성은 모수 분석 전에 샤피로-윌크 검정을 사용해 평가하였다. 분산의 균일성은 레빈 검정을 사용하여 평가되었다. 정규성과 분산의 동질성 가정을 충족하는 데이터에 대해, 일원 ANOVA를 사용한 차별 비교를 수행한 뒤, 대조군과의 다중 비교를 위한 Dunnett의 사후 검정이 적용되었습니다. 정규성 가정을 충족하지 못하는 데이터에는 비모수 Kruskal-Wallis 검정과 Dunn의 사후 검정이 적용되었습니다. 이 연구에서 모든 변수는 정규성과 등분산 가정을 만족했으며; 따라서 전반적으로 모수 분석이 적용되었습니다. 분석 소프트웨어에서는 데이터를 그룹화된 데이터 테이블에 입력하고, 열분석 메뉴에서 일방향 ANOVA를 선택했으며, 사후 비교를 위해 Dunnett 검정을 선택했고, 유의의 임계치는 p < 0.05로 설정되었습니다.
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만성 중등도 RI 및 AF의 동물 모델
실험 설계와 일정에 대한 도식적 개요는 그림 1에 제시되어 있습니다. 그림 2A, B에 표시된 경피적 색전술 전후의 좌측 신장 동맥 조영술 대표 이미지는 경피적 색전술 후 작은 신장 동맥 가지가 성공적으로 폐쇄되었음을 보여주었으며, 반복 혈관조영술에서 원위 동맥 불투명화가 없음을 확인할 수 있습니다. RI 수술 3개월 후, 비글 고양이들이 희생되었고, 신장이 적출되어 사진이 촬영되었습니다. 왼쪽 신장은 오른쪽 신장에 비해 다초점 불규칙한 창백 부위를 가지고 현저히 크기가 줄어든 것으로 관찰되었습니다(그림 2C,D). HE 염색...
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본 연구는 중등도 RI와 심방세동이 결합된 생 체 내 동물 모델을 확립하고, 이러한 병리학적 조건에서 좌심방 내피 기능 장애의 발병 기전을 탐구하였다. 본 연구의 주요 결과는 다음과 같습니다: 첫째, 비글에서 3개월간 좌측 주신동맥 색전술을 시행하여 중등도의 RI를 성공적으로 유도하였습니다. 둘째, 비글 품종에서 AF 모델이 효과적으로 확립되었습니다. 셋째, RI와 AF 모두에서 좌심방 내피 기능이 유의미하게 저하되어 응고 촉진 효과 증가와 섬유소용해 감소가 동반되어 혈전증 위험 증가로 이어질 수 있습니다. 넷째, 만성 중등도 RI와 AF의 조합은 염증 반응을 유의미하게 촉진하고 RAAS 활성 향상과 연관되어 있었습니다.
RI와 AF가 결합된 환자의 혈전증 및 출혈 위험 평가는 임상 실무에서 매우 중요한 주제입니다. 최근 연구들은 신장 기능과 심방세동 간의 복잡한 상호작용이 혈전색전
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저자들은 상충하는 이해관계가 없다고 선언한다.
이 연구는 비전염성 만성질환-국가 과학기술대공사업(번호 2024ZD052500, 번호 2024ZD0521504), 중국 국가자연과학기금(보조금번호 81700293 및 81970272호), 베이징안전병원 고수준 연구비(자금 지원 프로젝트 번호 2025AZB5005)의 지원을 받았습니다.
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| ImageJ 소프트웨어 (버전 1.53) | 국립 보건원 | — | https://imagej.nih.gov/ |