방법 논문

최소 입력으로 영아 면역 지도화: 통합 단세포 및 다종체 프로파일링

DOI:

10.3791/70279

⸱

2026년 4월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 신생아 및 소아 환자의 혈액 샘플을 수집하고 보존하며, scRNA-seq, 단백질체학, 스펙트럼 유세포 분석을 적용하여 이 샘플에서 면역 세포 집단을 특성화하는 방법을 설명합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출생 시 신생아 면역 체계는 미생물과 환경 자극이 풍부한 근본적으로 다른 환경에 갑작스럽게 직면하게 됩니다. 점점 더 많은 증거는 조기 면역이 단순히 미성숙한 것이 아니라 이 발달 창의 독특한 요구를 충족하도록 독특하게 적응되어 있음을 시사한다. 이 기간 동안 면역 체계는 매우 역동적이며, 변화하는 외부 환경에 적응하기 위해 급격히 변화합니다. 이 복잡하고 진화하는 면역 환경을 이해하려면 신생아를 직접 연구해야 합니다. 그러나 이러한 연구의 주요 한계는 신생아의 총 혈액량이 낮다는 점(~100 mL/kg)으로, 특히 극저체중 출생아(ELBW)나 매우 미숙아에서 안전하게 연구를 위해 채취할 수 있는 양을 제한합니다. 최근 연구에서는 신생아 혈액의 미량을 이용해 고차원 면역 프로파일링을 수행할 수 있음을 보여주며 이 한계를 해결합니다. 우리는 초기 생애 전반에 걸친 종단 샘플링을 위한 최적화된 프로토콜을 도입하고, 유세포분석, 단백질체학, 단일 세포 RNA 시퀀싱 등 첨단 기법을 적용하여 최소한의 입력으로 얻는 정보를 극대화합니다. 이 방법들을 결합하면 신생아의 순환 면역 세포의 전사체 및 단백질체 서명을 포괄적으로 파악할 수 있게 되어, 초기 면역의 독특한 궤적에 대한 새로운 통찰을 제공합니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 채취 후 12시간 이내에 처리된 100-250 μL 혈액 샘플을 냉동 보존 또는 즉시 사용할 수 있도록 최적화되어 있습니다. 출생 시, 신생아 면역계는 이전의 보호된 자궁 내 환경에서는 없던 미생물 및 환경 자극으로 풍부해지는 근본적으로 다른 환경에 투입됩니다 1,2. 이 변화는 면역 체계가 다양한 새로운 항원에 적응하고 반응하도록 요구하며, 이는 생존에 필수적이지만 동시에 상당한 도전 과제도 제기합니다 1,2. 점점 더 많은 증거는 초기 면역이 단순히 미성숙하거나 성인 면역 체계의 축소판이 아님을 시사합니다. 대신, 이 중요한 발달기의 구체적인 요구에 맞게 독특하게 맞춤화되어 있습니다 3,4. 이 신생아 창기 동안 면역계의 다양한 T 세포, B 세포, 골수세포 등 세포 구성 요소들이 성숙하여 초기 생명에 특화된 독특한 특성과 기능을 발달시킵니다 5,6,7,8. 중요성에도 불구하고, 신생아 면역은 윤리적·실질적 제약 때문에 직접 연구하기 어렵습니다. 주요 제한은 신생아의 혈액량이 작다는 점으로, 평균 ~100 mL/kg 9,10입니다. 이 어려움은 임신 30주 이전에 태어난 극미숙아와 ELBW 아기의 혈액을 채취할 때 더욱 두드러집니다. 이들은 400g에 불과한 혈액 순환 중 400g에 불과합니다. 이는 안전하게 채취할 수 있는 혈액 양을 제한하며, 최소한의 샘플로 데이터 수확량을 극대화하는 접근법의 필요성을 강조합니다. 이 문제를 해결하기 위해, 저희 연구는 ELBW 영아에서 얻은 것과 같은 미세한 혈액량(100-250 μL)을 이용한 고차원 면역 프로파일링을 위한 최적화된 프로토콜을 시연합니다.

최근 혈액 채취 및 처리 기술의 발전으로 전통적으로 샘플 채취가 어려운 집단에서 면역 반응 연구가 가능해졌습니다. Tasso와 Touch 활성화 채혈 시스템과 같은 마이크로바늘 장치는 성인의 편리한 가정 내 혈액 채취를 위해 처음 개발되었습니다. 이후 영아용으로 개조되어 1차 보호자와 임상 팀이 최소한의 불편함 없이 샘플을 채취할 수 있게 되었습니다. 또한, 반복적인 임상 방문의 스트레스 없이 집에서 사용할수 있어 준수와 접근성이 향상됩니다. 장치에 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA) 마이크로튜브를 사용하고, 적절한 생물학적 위험 프로토콜을 준수한 상태로 실험실로 하룻밤 배송해야 합니다. 다음 날 아침 샘플이 도착하면 적혈구(RBC) 용해 기법을 사용해 순환 면역 세포를 포획해야 합니다. 주목할 점은, EDTA 튜브가 생세포 분리를 가능하게 하지만, 시간 고려가 중요합니다. 자극을 이용한 기능적 분석의 경우, 샘플은 채취 후 4시간 이내, 이상적으로는 2시간 이내에 처리되어야 합니다. 아래에 제시된 비기능성 표현형 검사의 경우, 세포 생존력이 시간이 지남에 따라 감소함에 따라 회복을 보장하면서 하룻밤 배송을 허용하기 위해 샘플을 12시간 이내에 처리해야 합니다. Ficoll을 이용한 전통적인 밀도-구배 분리와 비교할 때, 용해는 더 빠르고 노동 집약성이 적으며, 더 높은 회수율을 제공합니다13. 그러나 말초혈 단핵세포를 용해로 분리하면 오염된 과립구가 남겨져 순도가 떨어질 수 있으나, 이러한 세포 유형에 관심 있는 연구에는 유리할 수 있습니다14. 이러한 절충은 신생아와 같은 희귀하거나 민감한 임상 샘플을 연구할 때 방법론적 적응이 실현 가능성과 정확성의 균형을 맞추는 방식을 강조합니다. 분리된 세포의 하류 처리도 방법론적 개선으로 혜택을 받았습니다. 태아 소 혈청(FBS)과 디메틸설폭사이드(DMSO)를 이용한 냉동 보존은 특히 세포 생존력과 회복이 중요한 태아 및 신생아 혈액에서 면역 세포에 대해 여전히 견고한 접근법으로 남아 있습니다. 혈액 채취 과정을 최적화하는 것과 함께, 우리는 소량의 샘플에서 최대한 많은 정보를 추출할 수 있는 하위 기법도 도입했습니다. 우리는 초기 생애 전반에 걸친 샘플링을 용이하게 하여 시간에 따른 면역 역학을 상세히 검토할 수 있도록 최적화된 프로토콜 세트를 도입합니다. 저희 접근법은 스펙트럼 유동 세포분석, 단백질체학, 단일 세포 RNA 시퀀싱과 같은 첨단 기법을 활용하여 초기 생애 순환 면역 세포의 프로테오미 및 전사 서명을 독보적으로 보여줍니다. 또한, 스펙트럼 유동 세포분석은 최소한의 세포 입력으로 기능적 통찰을 얻을 수 있는 기회를 제공합니다.

수년간 전혈구 검사(CBC)와 같은 여러 기법이 혈액 유래면역세포 분석에 사용되어 왔으며, DNA 메틸화를 이용해 신생아 전혈 샘플의 면역 세포 비율을 분석하는 방법도 있었습니다16,17. 이러한 기법들은 알려진 면역 세포의 비율을 파악하는 데 도움이 되었지만, 다중 오믹스 시스템 없이는 세포에 대한 깊은 통찰을 얻는 데는 여전히 한계가 있습니다. CBC는 주요 혈액 세포 유형의 광범위한 측정만 제공하여 임상 환경에서 전반적인 면역 상태를 확립하는 데 유용하지만, 아형이나 기능 상태를 해독하는 데는 한계가 있습니다. 가장 최근에는 생후 첫 주부터 영아를 대상으로 혈장 유래 전사체 및 대사체 변화를 활용하여 이 한계를 해결하기 위한 연구들이 시작되었습니다. 질량분석법 기반 단백질체학은 신생아 샘플의 면역 프로필 연구에 적용되었습니다19. 이 방법은 다양한 단백질을 편향 없이 측정하고 잠재적 바이오마커를 식별하는 데 강력합니다. 하지만 주요 한계로는 비교적 많은 단백질 입력이 필요하고, 수용성 및 불용성 단백질을 모두 포착했음에도 불구하고 세포 정체성에 대한 직접적인 정보가 부족하다는 점이 있습니다. 표적 다중성 단백질체학 분석법(TMPA)은 저입력 샘플에 대한 대안을 제공합니다. 이 방법들은 표적 항체 기반 검출을 사용하여 제한된 재료의 샘플에 대해 고감도 프로파일링을 제공합니다. 특히 이 중 하나는 초기 면역 발달 경로를 종방향으로 추적하는 데 사용되었습니다.

유세포분석은 형광 표지된 세포를 집중 레이저 빔에 통과시켜 생성된 빛 산란과 형광 신호를 측정함으로써 단일 세포 수준에서 면역세포 단백질을 정량적으로 분석할 수 있게 합니다. 이 기술에서는 형광 표지된 항체가 특정 표면 또는 세포 내 단백질에 결합합니다. 이를 통해 여러 면역 세포 아형과 형광 프로필에 기반한 특징을 동시에 검출하고 정량화할 수 있습니다. 스펙트럼 유동 세포분석은 각 형광색소의 전체 방출 스펙트럼을 포착함으로써 이 접근법을 확장하여, 정밀한 스펙트럼 혼합과 단일 분석법21, 22, 23에서 35개 이상의 마커를 동시에 검출할 수 있게 합니다. 이로 인해 기존 유세포측 패널보다 훨씬 더 많은 마커를 분석할 수 있으며, 기존 유동 세포측 패널은 8~12개의 마커로 제한됩니다. 이러한 세포계 기법을 보완하는 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 최소한의 입력 물질로부터 고해상도, 편향 없는 전사체 프로파일링을 가능하게 하여 면역학 연구를 혁신했습니다24. 더 높은 비용과 세포 생존 의존도에도 불구하고, scRNA-seq는 대량 시퀀싱과 비교했을 때 초기 면역 이질성에 대한 탁월한 통찰을 제공합니다. 이러한 진전은 수집, 보존, 분석 분야의 혁신이 태아 및 신생아 면역 연구의 독특한 도전을 극복하기 위해 어떻게 적용되고 있음을 보여줍니다.

이 프로토콜은 연속 적혈구 용해를 통해 분리된 냉동 보존 말초 면역세포 분석에 최적화되었습니다. 연구자들은 특히 종단 분석이 중요한 소량 혈액(100-500 μL)에서 고해상도 면역 프로파일링이 필요한 연구를 위해 이 프로토콜을 고려해야 합니다. 이 방법은 만삭 및 조산아 모두에 널리 적용할 수 있으며, 다양한 후속 분석과 호환되어 신생아 및 소아 면역학 분야의 다양한 연구 질문에 적합합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

예일 대학교 기관심사위원회(IRB)에 따라 부모의 사전 동의와 관련 국가 윤리 규정의 완전한 준수가 보장되었습니다. 승인된 IRB 프로토콜에 명시된 대로, 연구팀은 아기 출생 후 첫 주에 부모에게 연락하여 등록 전에 동의를 얻었습니다. 문서화된 윤리 승인 이전에는 인간 유래 물질을 이용한 연구 절차가 시작되지 않았습니다.

1. 샘플 채취, 처리 및 보관 (그림 1)

  1. 입원 혈액 채취
    1. 영아 샘플을 받은 후 수집 및 처리하여 4°C에서 보관하고, 채취 후 12시간 이내에 처리하세요.
    2. ~250 μL의 전혈을 채취하여 항응고제 EDTA 혈액 채취관에 보관합니다. 혈액 채취관을 8번 뒤집어 항응고제를 섞으세요.
    3. 1.3절(전혈 샘플 처리)에 설명된 적혈 용해법을 통해 전혈을 처리하십시오.
    4. 건조한 혈흔을 채취하려면 멸균 란셋으로 깨끗이 닦은 발가락/뒤꿈치에 천공을 하세요.
      1. 또는 EDTA 튜브에서 추출한 혈액 ~25-30 μL의 혈액을 필터 페이퍼에 피펫으로 옮기세요. 필터 페이퍼를 피방울에 살짝 대세요.
    5. 최소 한 개의 원에는 자유롭게 흐르는 피를 채우고, 각 원마다 한 방울씩 떨어뜨리세요. 피 부위를 마르게 하세요. 피 얼룩이 완전히 마를 때까지 필터 페이퍼를 열어두세요.
    6. 채집 시간, 처리 날짜, 시점, 표본 식별 정보를 적절히 라벨링하세요.
    7. 투명 플라스틱 지퍼 보관 봉투에 넣으세요. 혈액 스팟 카드를 −20 °C 또는 −80 °C에 보관하여 단백질체 분석 준비 전까지 안정성을 연장합니다.
  2. 외래 혈액 채취
    참고: 예일 대학교 기관심의위원회(IEB)의 승인을 받아, 외래 환자 부모는 마이크로 바늘 자가 채취 장치를 사용해 집에서 혈액 샘플을 채취할 수 있는 선택권을 부여받았습니다. 이 장치는 피부에 삽입된 란셋을 통해 모세혈관 혈액을 채취합니다. 이 방법을 선택한 부모들은 시범 키트를 이용한 임상 교육을 받았고, 이후 상세한 서면 지침과 가정용 수집 키트를 제공받았습니다.
    1. 사용 전에는 반드시 손을 씻고 장갑을 착용하세요. 혈액 채취를 한 부모만 할 경우 거울을 포함한 필요한 모든 물품을 수집하세요.
    2. 도구를 도구 키트에서 분리하고 호환되는 튜브의 캡을 돌려 분리하세요.
    3. 튜브를 장치에 눌러 고정시키고, 채우는 선이 바깥쪽을 향하게 하세요.
    4. 아기의 기저귀를 벗기고 아기를 똑바로 세워 주세요.
    5. 히트팩의 지시를 따라 작동하세요.
      참고: 팩이 없다면 손과 같은 다른 온열 방법을 사용하세요.
    6. 열찜질팩을 엉덩이 부위에 2-4분간 대고 따뜻하게 하고 혈류를 증가시키세요.
    7. 알코올 패드로 부위를 닦고 말리세요.
    8. 빨간 버튼에서 투명 커버를 제거하세요. 기기에서 탭을 떼어내어 아기의 엉덩이 가장 풍만한 부분에 단단히 붙이고 똑바로 세우세요.
      참고: 적절한 혈액 채취를 위해 튜브가 완전히 수직으로 유지되도록 자세를 조정하세요.
    9. 버튼을 한 번 끝까지 누르고 놓으세요. 타이머를 5분으로 맞춰. 필요할 때 거울을 통해 튜브가 채워지는 것을 관찰하세요.
    10. 처음 1-2분 동안은 피가 나오지 않을 수 있습니다. 총 5분 이내에 피가 최상단 지표선까지 차면 그 이전에 장치를 제거하세요.
    11. 튜브를 장치에서 약간 비틀어 빼내고 아래로 당기세요. 캡을 빠르게 튜브에 완전히 닫아버립니다. 튜브를 최소 10번 뒤집어 혈액이 캡에 닿도록 하여 응고를 막으세요.
    12. 샘플을 수집 후 하룻밤 배송하세요.
  3. 전혈 샘플 처리
    1. 생물학적 안전 캐비닛에서 혈액 샘플을 처리합니다.
    2. 250 μL의 혈액을 10mL 적혈구 용해 완충제가 들어 있는 50 mL 원뿔 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 혈액 채취관을 10mL의 적혈구 용해 완충제로 비울 때까지 세척하세요. 세포를 실온(RT)에서 15분간 용해시키세요.
    3. 용해가 완료되면 RT에 ~30mL의 PBS를 추가해 430 × g 에서 4°C에서 5분간 세척하고 회전시킵니다. 진공청소기로 상청액을 흡인하되, 펠릿을 방해하지 마세요.
    4. 1.3.2 단계에 설명된 대로 샘플을 계속 옮기고 헹구며, 세포 펠릿에 눈에 보이는 적혈구가 없는 것으로 보입니다. 430 × g 에서 5분간 원심분리한 후, 펠릿을 방해하지 않고 조심스럽게 상청액을 제거하세요.
    5. 채취된 혈액 250 μL마다 얻은 세포 펠릿을 2mL의 냉동 배지(FBS에 10% DMSO를 넣음)에 재현탁한 후 보존을 위해 두 개의 크라이오비얼로 나눕니다.
    6. 트라이판 블루 배제법을 이용한 혈구세포계로 발화된 배지에 재현탁된 세포를 세어 세포 생존력을 확인한다.
    7. 각 1.3.5단계에서 1mL를 각 크라이오비아로 옮깁니다. 채집 시간, 처리 날짜, 시점, 표본 식별 정보를 적절히 라벨링하세요.
    8. 냉동 용기에서 -80 °C에서 아이소프로판올과 함께 중간 보관하세요. 24시간 후에는 냉동병을 액체 질소로 옮기고, 분석 준비가 될 때까지 보관합니다.

2. 건조 혈점 TMPA(DBS) (그림 2)

  1. 처리 당일에는 필터 페이퍼를 RT에 가져가세요. 3mm 금속 펀치를 사용해 혈액이 통과하는 곳에 2-3개의 원을 뚫어 혈액 부위 중앙에 최대한 집중시킵니다.
  2. 핀셋으로 각각 3mm 펀치를 집어 96웰 플레이트 또는 저결합 PCR 튜브에 20 μL 용출 버퍼(PBS 1개, 프로테아제 억제제 1개, 0.05% 트윈 20)를 넣습니다. 펀치가 용출 버퍼로 덮여 있는지 확인하세요.
  3. 튜브를 닫거나 플레이트를 플라스틱 스커트로 덮고, 600rpm으로 회전하는 디지털 보텍스에 60분 동안 RT 상태로 올려놓으세요.
  4. 배양 종료 시, 조심스럽게 용액을 새로운 저결합 튜브나 96웰 플레이트로 옮깁니다. 필터 펀치가 있는 튜브나 플레이트는 버리세요.
  5. BCA 분석법을 사용해 단백질 함량을 정량화하세요.
    1. 각 샘플 또는 BSA 표준액을 2μL씩 물에 넣어 1:10과 1:100의 연속 희석을 만듭니다. 희석된 샘플 또는 표준 샘플 15 μL를 1x 작업 용액 200 μL에 추가하여 샘플과 표준체를 두 배로 준비합니다. 샘플을 37°C에서 30분간 배양합니다.
    2. 플레이트 리더기로 562nm 신호를 읽어보세요. BSA 표준 기울기 및 용출 완충 배경을 바탕으로 최종 단백질 농도를 계산합니다.
  6. 샘플은 0.5-1 mg/mL 용량의 저결합 1.5 mL 스크류 캡 마이크로 튜브에 30 μL 분량을 만듭니다. 샘플을 -80°C에서 냉동하여 TMPA 서비스를 통해 나중에 제출할 예정입니다.

3. 용해된 적혈구의 스펙트럼 유동 세포검사 (그림 3)

  1. 실험 당일, 37°C 물욕에서 빠르게 해동한 적혈구 세포 한 병을 작은 얼음 한 방울만 남기도록 합니다.
  2. 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 넣고, 10mL의 예열(37 °C) 완전 RPMI(RPMI 1640 500 mL, FBS 50 mL, 페니실린-스트렙토마이신 5.6 mL, 글루타민 보충제 5.6 mL를 사용해 조제됨)를 넣습니다. 400 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리기를 사용하세요. 상정액을 조심스럽게 제거하고 버리세요.
  3. 펠릿을 3 mL의 완전한 RPMI에 부드럽게 재현탁한 후 적절한 방법으로 세포 수를 측정합니다.
  4. 재현유된 세포를 400 × g 에서 실온에서 5분간 돌립니다. 흡인하고 상정액을 버리세요.
  5. 세포 농도를 1 × 106 cells/mL로 완전 RPMI로 조절합니다. 웰당 100 μL(0.1 × 10⁶ 셀)을 96웰 V-바닥판에 투여합니다. 764 × g 에서 4 °C에서 2분간 원심분리기를 하고 상원액을 제거합니다.
  6. 1:2,000 희석 비율로 PBS에 100 μL 생/죽음 염료 스톡을 Fc 블록과 단핵구 블록(1:100 희석)을 첨가하여 모든 샘플에 첨가하되, 염색되지 않은 대조군은 제외합니다. 4°C에서 15분간 배양하세요.
  7. 100 μL PBS로 세척하고 원심분리기를 764 × g에서 4 °C에서 2 분간 세척 합니다. 상액을 조심스럽게 버리세요.
    참고: 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 반드시 Fc 블록과 단핵구 차단을 사용해야 합니다.
  8. FACS 완충제(500mL PBS, 2.5g 소 혈청 알부민(BSA, 2 mM EDTA, pH 8.5)로 희석한 표면 칵테일 100 μL 100 μL을 모든 샘플에 첨가하되, 염색되지 않은 대조군은 제외합니다. 4°C에서 30분간 배양하세요.
  9. 100μL FACS 버퍼와 원심분리기로 764 × g , 4 °C에서 2분간 세척합니다. 상액을 조심스럽게 버리세요.
  10. 각 샘플에 4% 파라포름알데히드 100 μL을 첨가하여 세포를 고정합니다. 어두운 곳에서 RT에서 15분간 부양하세요.
  11. 100 μL FACS 버퍼로 세척하고, 4°C에서 764 × g 원심분리기에서 2분간 두고, 200 μL FACS 버퍼에 재현탁합니다.
  12. 울트라 컴프 비즈를 단색 컨트롤로 준비하세요. 샘플과 동일한 프로토콜로 단일 색상 제어 비즈를 염색하며, 샘플이 고정되어 있다면 고정 처리도 포함합니다.
  13. 샘플과 동일한 절차를 사용하여 형광 마이너스 원(FMO) 대조제를 준비합니다.
    참고: 단일 색상 컨트롤과 FMO도 샘플과 동일하게 다루는 것이 중요합니다. 예를 들어, 샘플이 스테인팅 후 고정되었다면, FMO와 단색 조절도 고정되어야 합니다.
  14. 샘플, 단색 조절, 무염색 제어, FMO 제어를 일반 스펙트럼 유세포계에서 모두 실행하세요. 소프트웨어를 사용해 데이터를 분석하세요.
  15. 적절한 아이소타입과 FMO 컨트롤에 따라 게이트를 설정하세요. 첫째, 게이트 셀을 통해 전방 산란(FSC) 대 측면 산란(SSC) 플롯을 사용하여 백혈구 집단을 선택하는데, 이는 잔해를 배제하고 크기와 과립도를 기준으로 세포를 선택하는 데 도움을 줍니다.
  16. 백혈구 선택 후, 전방 산란 면적(FSC-A)과 전방 산란 높이(FSC-H)의 플롯을 사용하여 이중항체를 배제하는 게이트 셀.
    참고: 이로 인해 단일 셀(싱글렛)이 선택되며, 대각선을 따라 떨어진 셀은 싱글렛으로 간주하고 더블렛과 클럼프는 제외됩니다.
  17. 생존 가능성을 위한 게이트 세포를 이용해 죽은 세포를 배제하고, 이후 분석에서는 살아있는 세포만 포함하도록 합니다.
  18. 이러한 초기 게이팅 단계 이후, 특정 계통 마커를 위해 살아있는 단일 세포를 추가로 게이트하여 서로 다른 면역 세포 집단을 세분분류합니다. 살아있는 단일 세포를 CD33+ 골수세포와 CD33- 림프구로 분열시키고, CD33 발현을 바탕으로 합니다.
  19. CD33+ 집단 내에서 CD14+ 단핵구를 분화하고, CD11c+ 수지상세포(DCs)를 CD11c를 발현하지만 CD14는 발현하지 않는 세포로 식별합니다.
  20. CD33- 림프구 집단 내에서 CD3+ T 세포와 서브게이트를 통해 CD4+ 및 CD8+ T 세포 소집합을 식별합니다.
  21. 추가로, CD56+ 자연 살해(NK) 세포는 CD56 발현으로, CD19+ B 세포는 CD19 발현으로 게이트합니다.

4. 용해된 적혈구의 scRNA-seq(그림 4)

  1. 냉동 보존된 적혈구 용해된 세포 한 병을 37°C 물욕에서 해동합니다. 샘플을 15mL 원뿔형 튜브에 넣은 10mL의 T세포 배지에 첨가합니다. 430 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기. 상원액은 버리세요.
  2. 샘플에 1x PBS 10mL를 추가하세요. 원심분리기 430 × g에서 4 ° C에서 5 분간 가열합니다. 상원액은 버리세요.
  3. 트리판 블루로 세포 수를 세고 생존 가능성을 평가하세요. 생존 가능성이 70% 미만이라면 죽은 세포 제거 키트를 이용한 죽은 세포 제거를 진행하세요.
    1. 죽은 세포 제거
      1. 멸균된 이중 증류수를 사용해 20배 결합 버퍼 스톡을 희석하여 1배 작동하는 용액을 얻으세요.
      2. 세포 펠릿을 10×7개의 세포당 100μL 죽은 세포 제거 마이크로비즈에 부탁합니다. 충분히 섞은 후 실온(RT)에서 15분간 배양하세요.
      3. 자기 분리 컬럼을 적절한 자기 스탠드에 삽입하세요. 사용 전에 1x 결합 버퍼 500 μL로 컬럼을 세척하여 평형을 맞춥니다.
      4. 세포 부피를 500 μL로 1배 결합 버퍼로 올립니다. 세포 현탁액을 컬럼에 적용하고 새로운 1.7 mL 마이크로 원심분리관에 플로우스루를 수집합니다.
      5. 500 μL 결합 버퍼로 2번 세척하세요. 같은 마이크로 원심분리기 튜브에 플로우스루를 모으세요.
      6. 300 × g 에서 10분간 원심분리합니다. 상원액은 버리세요.
    2. 트리판 블루로 세포 수를 세고 생존 가능성을 평가하세요.
    3. 20,000개의 생존 가능한 세포를 40 μL PBS에 0.04% BSA를 사용한 새로운 1.7 mL 마이크로 원심분리관에 재현탁합니다.
    4. 세포를 즉시 얼음 위에 올려 유전체 코어 시설로 보내 라이브러리 생성과 서열 분석을 진행하세요. 시퀀싱 결과를 셀 레인저 출력 형식으로 수집하세요.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 10명의 극미숙아로부터 3시점(1주(n = 12), 1개월(n = 7), 2개월(n = 3)에서 DBS 카드를 수집하여 TMPA 단백질체 분석6 (그림 2A)을 수행하였습니다. 이 샘플들은 만삭 영아 제대혈(TCB; n = 4) 및 건강한 성인 혈액(AB; n = 5)과 함께 분석되었습니다. 92개의 면역 관련 단백질의 정규화된 단백질 발현(NPX)은 TMPA 플랫폼을 사용해 정량화되었습니다(그림 2B). 통계 분석은 조산아 말초혈에서 2개월 경 TCB보다 림프구 활성화 유전자 3(LAG3)과 신호 임계 조절 막 관통 어댑터 1(SIT1)의 발현이 유의하게 높음을 보여주었습니다(그림 2C).

우리는 환자의 적혈구...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

신생아 및 영아 혈액의 최소량으로 고품질 면역학 데이터를 얻으려면 여러 단계에 걸친 방법론적 적응이 필요합니다. 본 프로토콜에서는 네 가지 보완적 전략을 설명합니다: (i) 생존 가능한 세포를 보존하기 위한 최적화된 혈액 수집 및 냉동 보존, (ii) 다중 매개변수 면역표현형 분석을 위한 스펙트럼 유동 세포검사 적용, (iii) 고해상도로 면역 이질성을 해소하기 위한 scRNA-seq, 그리고 (iv) TMPA. 이 두 접근법은 제한된 표본 양과 취약한 세포 집단이라는 기술적 문제를 해결하는 동시에 데이터 수율을 극대화합니다.

혈액 채취와 보존은 후속 성공의 중요한 결정 요인입니다. FBS에 10% DMSO가 포함된 냉동 배지는 적혈구 용해 후 대부분의 면역세포에서 높은 회복력을 보이며, 이는 DMSO의 보호 효과에 관한 이전 연구 결과와 일치합니다28. 냉동 중에는 적절한 취...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 이해 상충이 없다고 선언한다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

예일의 다음 핵심 시설에 감사드립니다: 예일 유동 세포 측정 핵심; 예일 유전체 분석 센터. 예일 임상조사센터, 예일 의사과학자 및 과학자 개발 사무소, 소아 중환자 치료 및 외상 과학자 개발 프로그램/NICHD에 감사드립니다. 호흡 측정 연구는 예일 대학교 화학 대사 핵심 연구소에서 수행되었습니다. 이 연구는 다음 기관에 지원받은 연구비로 운영되었습니다: P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), 낭포성 섬유증 재단(L.K.); K08 AI177743 (N.N.B.), 하트웰 상(N.N.B.); 예일 의과대학 소아과(O.O.) K08DK133687 (O.O.); R01AI123204 (C.R.O). 내용은 전적으로 저자의 책임이며, 반드시 국립보건원(NIH)의 공식 입장을 대표하지는 않습니다. 그림 1 은 BioRender로 제작되었습니다. 가원, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
0.5 M EDTA, pH 8.0서모 피셔 사이언티픽  15575-038 
1x 적혈구 용해 버퍼 & nbsp;인비트로젠 3177165 
BCA 단백질 분석 키트  Abcam ab287853 
BD 마이크로테이너 MAP 마이크로튜브피셔 사이언티픽  22-253-270
벨아트 크라이오 세이프 -1° C 프리즈 컨트롤러 밀리포어 시그마와 nbsp;41122800 
소 혈청 알부민 (BSA)시그마-올드리치  A9647-100G 
브릴리언트 울트라 바이올렛 496 반인간 CD3 서모 피셔 사이언티픽  364-0038-42  
브릴리언트 울트라 바이올렛 661 반인간 CD11c BD 생명과학  612968 
브릴리언트 빌750 반인간 CD14 바이오레전드 367135 
브릴리언트 바이올렛 570 반인간 CD8a 바이오레전드 301038 
브릴리언트 바이올렛 711 반인간 CD56 바이오레전드 318336 
cOmplete, Mini, EDTA 프리 프로테아제 억제제 칵테일밀리포어 시그마와 nbsp;11836170001 
죽은 세포 제거 키트  밀텐이 바이오텍  130-090-101 
디메틸 설폭사이드(DMSO)와 nbsp;서모 피셔 사이언티픽  BP231-100 
둘벡코 인산염 완충 식염수(DPBS), 칼슘, 마그네슘 없음 및 nbsp;서모 피셔 사이언티픽  14190144 
태아 소 혈청(FBS) 깁코와 nbsp;A5256801 
피셔브랜드 디지털 보텍스 믹서 서모 피셔 사이언티픽  02215418 
고정 완충제 바이오레전드 420801 
글루타맥스 보충제깁코와 nbsp;35050061 
MACS 멀티스탠드 밀텐이 바이오텍  130-042-303 
MS 칼럼 밀텐이 바이오텍  130-042-201  
이름회사카탈로그 번호
옥토맥스 분리기(OctoMACS Separator) 밀텐이 바이오텍  130-042-109  
태평양 블루 반인간 CD4 바이오레전드 344619 
페니실린-스트렙토마이신 (10,000 U/mL)서모 피셔 사이언티픽  15140-122 
RB780 반인간 CD33  BD 생명과학  755606 
리어지 3mm 메탈 펀처  리어지 SDD231031PC-01 
RPMI 1640 미디엄깁코와 nbsp;11875-093 
스파크 UV 387 반인간 CD19 바이오레전드 302289 
타소 컬렉션 키트타소 해당 없음
Thermo Scientific 스크류 캡 마이크로 튜브서모 피셔 사이언티픽  14-755-287  
왓트맨 309 프로인세이버시티바와 nbsp;41111700 
좀비 NIR 고칠 수 있는 실행 키트  바이오레전드 423105 
소프트웨어 및 패키지
어도비 일러스트레이터2024
BBKNN1.5.1
플로우조10.8.1
그래프패드 프리즘9.4.0
이름버전
스캐피1.9.1
스럽릿0.2.3
<강>상업용 분석
크롬 단셀 5' 유니폼10X 유전체학PN-1000263
올링크  노출 또는 타겟 96 염증 패널올링크https://olink.com/products/olink-target-96

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

RNA

관련 논문