생쥐암 종양 내 면역치료 연구의 강력한 모델로서의 피내종양 이식

요약

종양 내 면역치료에 대한 관심이 높아짐에 따라, 접근 가능하고 실용적인 종양 모델을 선택하는 것이 필수적입니다. 피하 종양은 쉽게 진단할 수 있지만, 시각화하고 조작하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 가시성과 접근성을 높이는 피내종양을 생성하는 방법을 설명합니다.

초록

재현 가능한 쥐 종양 모델 구축은 암 생물학과 면역치료 전략을 평가하는 데 필수적입니다. 종양 내 면역치료는 면역자극 시약으로 확립된 종양을 치료하여 국소 면역 억제를 되돌리고 전신 항종양 면역을 자극합니다. 대부분의 암 연구는 쥐에서 종양이 피하 공간에 위치하도록 하는데, 이는 종양 내 주사를 시각화할 수 없어 실험적 종양 내 면역치료에 본질적인 어려움이 있습니다. 종양 세포의 피내주입은 정확하고 재현 가능한 종양 내 주입과 성장 동역학 및 치료 반응 모니터링을 지원하는 신뢰할 수 있는 접근법을 제공합니다. 여기서는 C57BL/6 마우스에서 쥐 B16F10 흑색종 모델을 사용하여 피내종양을 확립하고 치료하는 재현 가능한 방법론을 제시합니다. 종양 세포 현탁액은 피내로 주입되며, 종양 착상 후 7–10일 후 종양이 ~60 mm³에 도달하면 면역자극제 내 주사나 전기천공, 가열과 같은 물리적 치료를 직접 시행할 수 있습니다. 이를 통해 정밀 치료와 캘리퍼스로 종양 성장 측정이 가능하며, 피하 종양의 여러 치료 시 눈에 띄지 않는 변동성 문제를 피할 수 있습니다. 이 기술에 대한 상세한 통찰을 제공함으로써, 본 글은 재현성을 지원하고 종양 내 면역치료의 전임상 연구를 진전시키는 것을 목표로 합니다.

서론

쥐 종양 모델은 암 연구에 없어서는 안 될 도구입니다. 최적의 마우스 모델에서는 유전적 및 형태학적 수준 모두에서 인간 종양과 매우 유사한 종양을 유도할 수 있습니다^. 이를 통해 종양 내 면역치료(ITIT)를 포함한 다양한 분야에서 새로운 치료 접근법의 평가와 효율성을 높일 수 있습니다. ITIT는 종양 미세환경(TME)에 면역자극제를 직접 투여하는 암 치료 분야의 신흥 분야입니다. 이 국소 전달은 국소 면역 활성화를 강화하고, 면역억제 종양 미세환경을 역전시키며, 전신 항종양 면역 반응인 아브스코팔 효과(abscopal effect)를 유발할 수 있습니다^. 그러나 종양 내 투여의 효율성, 정확성, 일관성은 다양한 종양 모델에서 주사 매개변수를 시각화하고 제어할 수 있는 능력에 달려 있습니다.

대부분의 전임상 암 연구는 피하 종양 착상을 사용합니다. 그러나 이 방법은 수술을 하지 않는 한 주사 중 종양을 직접 시각화할 수 없기 때문에 종양 내 치료에는 한계가 있습니다. 많은 종양 내 면역치료 전략은 작은 마우스 종양에 시약을 정밀하게 전달해야 하며, 종종 이 작업을 여러 번 수행해야 합니다. 시각적 확인이 없으면 주입 정확도와 피하 종양 내 시약 보유 능력이 제대로 통제되지 않는 변수가 됩니다. 이로 인해 실험 데이터의 오해나 변동이 발생할 수 있습니다^.

피내종양 이식은 종양 관찰, 측정 및 종양 내 주입을 위한 직접적이고 접근 가능하며 시각화 가능하고 재현 가능한 대안을 제공하여 일관성을 향상시킵니다. 더욱이 연구에 따르면 피하 주사와 달리 피하 이식 종양이 면역원성을 높이고 종양 발생성을 억제하는 것으로 나타났습니다^. 피내주입 종양은 림프절로의 수지상세포 수송을 빠르고 강력하게 유도하여 종양 특이적 세포독성 T 세포의 더 빠르고 강력한 활성화를 이끌어냈습니다⁴. 본 연구는 C57BL/6 마우스에서 피내 B16F10 흑색종 종양을 확립하고 이후 종양 내 치료를 수행하는 상세하고 재현 가능한 프로토콜을 설명합니다.

프로토콜

모든 절차는 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC) 지침의 승인 및 준수 하에 수행되었습니다⁵. 모든 동물 시술은 다트머스 동물 시설에서 이루어졌습니다. 6주에서 8주 된 암컷 C57BL/6 쥐는 표준 조건 하에 통풍 선반 위에 음식과 물을 함께 보관했습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 쥐 면도

참고: 모든 직원은 이 절차를 수행하기 전에 살아있는 동물 취급 및 마취에 관한 기관 교육을 반드시 이수해야 합니다.

1. 피내 주사 전에 아래에 설명한 대로 각 쥐의 옆구리를 면도하세요; 오른쪽 옆구리는 주사와 설명된 절차에 사용되었다. 종양 세포 주사 전날에는 쥐를 면도하세요.
2. 마우스를 안정적인 표면에 위치시키세요. 왼손 엄지와 검지로 쥐의 목덜미 피부를 잡고, 몸통 왼쪽을 손바닥에 살짝 접어 오른쪽을 드러내세요. 약지나 새끼손가락을 사용해 왼쪽 다리와 꼬리를 잡아 오른쪽 옆구리가 완전히 노출되도록 하세요.
3. 뒷다리부터 갈비뼈 아래쪽까지 털을 면도하여 주사를 위한 깨끗한 부위를 만드세요.
4. 추가 연습 공간이 필요하면 양쪽 측면을 모두 깎을 수 있습니다.
   참고: 초보자는 면도와 올바른 수염 다듬기 연습 시 쥐에게 마취를 줄 수 있습니다.

2. 조영제 주사 연습

참고: 연습은 살아있는 마취된 쥐와 안락사 생쥐 모두, 그리고 어느 성별에든 할 수 있습니다. 수컷 쥐는 일반적으로 암컷보다 피부가 두껍고 유연하지 않아 기술적으로 더 어렵습니다. 이 때문에 남성 대상으로 연습하는 것은 숙련도를 키우는 데 유용합니다.

1. 식용 색소와 인산 완충 식염수(PBS)를 1.5mL 에펜도르프 튜브에서 혼합하여 용액이 어두워질 때까지 합니다(이 연구에서는 파란색 식용 색소가 사용되었습니다).
2. 연습용 쥐를 구입하여 기관 동물 관리 지침에 따라 마취하세요.
3. 마취된 쥐를 코 콘 아래에 두고, 몸을 기울여 오른쪽 옆구리를 드러내세요. 발바닥을 부드럽게 꼬집어 마취가 적절한지 확인하고, 반응이 없으면 됩니다.
4. 29 G 1/2인치 바늘을 사용해 0.3 mL 인슐린 주사기에 30 μL 염료 용액을 주입하세요. 모든 기포를 제거하세요.
5. 비우세 손을 사용해 다리와 피부를 부드럽게 꼬집고 늘려 매끄럽고 팽팽한 표면을 만듭니다(피부를 위로 들어 올리지 마세요). 바늘 베벨업 을 피부와 평행한 얕은 각도로 진층에 삽입하세요. 바늘을 표면 아래에 보이게 하여 피부 위치를 확인하세요.
   참고: 연습 중에는 다양한 손잡이 자세를 시도해 피부 긴장을 안정적으로 유지하면서도 손가락이 바늘 경로에서 벗어나도록 하세요. 바늘을 피부에 ~2mm 삽입하세요. 역류를 줄이기 위해 바늘을 ~3mm 삽입한 후 살짝 빼서 주입 전에 '주머니'를 만듭니다. 이렇게 하면 주입 부위에 염료가 잘 남아 있습니다.
6. 염료 약 30 μL 전부를 천천히 주입하여 피부 표면 아래에 작고 뚜렷한 '거품'이 형성될 때까지 진행하세요
   참고: 눈에 띄는 기포가 없다는 점은 주사가 피하 주사가 아닌 피하 투여되었음을 시사합니다. 베벨을 위로 유지하는 것은 정확한 진피 위치를 보장하고 과도한 주입을 방지하는 데 도움이 됩니다.
7. 꾸준히 피내 거품이 형성될 때까지 계속 연습하세요. 한 쪽에 최대 6회에서 8회까지 주사를 맞출 수 있습니다.
8. 연습 주사를 마친 후, 승인된 기관동물 보호 및 사용 위원회(IACUC) 프로토콜에 따라 쥐를 안락사시킵니다.⁵.

3. 주사를 위한 종양 세포 준비

참고: 멸균 후드에서 세포 관련 모든 절차를 수행하세요. 쥐 종양 계통마다 자라는 속도가 다르다는 점을 유념하세요.

1. 피내주사 며칠 전에 종양 세포(본 연구에서 사용된 B16F10)를 해동합니다.
2. 신선한 배지를 유지하면서 세포를 70%–80% 합류율로 배양합니다
   참고: 증식을 멈추고 종양 성장을 저해하는 100% 합류는 피해야 합니다.
3. 세포를 7 x 10⁶ cells/mL에서 1x PBS, 혈청 무첨가 RPMI 또는 세포 배양에 사용하는 다른 배지에서 수확하여 준비합니다.
   참고: 실험실에서 사용되는 B16F10 종양 모델은 30 μL에 2 x 10⁵ 세포를 사용합니다. 30 μL 주입 용량이 적절하지만, 원하는 종양 모델을 설정하기 위해 세포 수는 필요에 따라 조절할 수 있습니다. 세포는 튜브 바닥에 가라앉아 모이므로, 세포 농도를 일정하게 유지하기 위해 주기적으로 부드럽게 혼합하여 세포를 부유하게 유지하세요.
4. 처리 후에는 세포를 얼음 위에 보관하고 신속하게 주입하세요. 얼음에 장기간 보관하면 세포 생존성이 저하되어 살아있는 세포 수가 줄어들고 종양 형성에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다^.
   참고: 세포는 즉시 실험실에서 채취되어 사용됩니다. 주사는 세포를 처리하고 얼음 보관한 후 20분에서 60분 이내에 이루어집니다. 대규모 집단과 함께 작업할 때는 파트너를 활용해 얼음 위에서 시간을 최소화하세요.

4. 피내주사

1. 실험용 마우스를 마취하세요.
   참고: 실험실에서는 이소플루란 가스를 이용한 마취를 사용하지만, 주사형 마취제도 사용할 수 있습니다.
2. 마취 유도 후에는 마우스를 코 콘 아래에 놓고 몸을 오른쪽 옆구리가 완전히 노출되도록 위치시킵니다.
3. 세포 현탁액을 부드럽게 뒤집어 고르게 섞이세요.
4. 29 G 1/2인치 바늘로 0.3 mL 주사기에 세포 현탁액 30 μL을 뽑아내세요. 공기 방울을 제거하세요.
5. 비우세 손을 사용해 다리나 피부를 부드럽고 단단하게 옆으로 스트레칭하여 부드럽고 단단하게 만듭니다(위로 들어 올리지 마세요). 바늘을 얕고 평행한 각도로 진피에 삽입하세요. 바늘은 피부 아래에 보여야 하며, 너무 깊지 않다는 것을 보여줍니다.
   참고: 바늘 깊이는 피부 안쪽으로 ~2mm 정도 들어가야 합니다. 세포의 역류를 막기 위해 바늘을 피부에 ~3mm 삽입하고, 바늘을 약간 뒤로 당겨 세포를 주입할 '주머니'를 만듭니다. 이로 인해 역류가 크게 줄어듭니다.
6. 세포 30 μL의 부유액액을 아주 천천히 주입하여 피부 아래에 작은 눈에 보이는 '거품'이 형성될 때까지 진행합니다. 바늘을 제거하기 전에 5–10초를 기다립니다.
   참고: 바늘을 너무 빨리 빼면 압력으로 인해 용액이 피부에서 빠질 수 있습니다.
7. 이 과정을 마우스마다 반복합니다. 각 케이지(4–5마리)마다 주사기를 교체해 바늘이 무뎌지는 것을 방지하세요.
8. 마취에서 완전히 회복할 때까지 모든 쥐를 관찰하세요.
9. 쥐의 종양 형성 상태를 모니터링하세요.

5. 종양 내 주사

참고: 종양은 보통 착상 후 7–10일 이내에 적절한 크기에 도달하면 치료 준비가 완료됩니다. 실험실에서 적절한 크기는 ~50 mm³ 이상이며, 공식은 다음과 같습니다: 부피 = (길이/2) * (너비 *너비)^7,8.

1. 모든 치료 용액을 미리 준비하세요(예: 이 연구에서는 1x PBS가 사용됨). 특정 처리에 따라 얼음 또는 실온에 보관하세요.
2. 기관 지침에 따라 마취를 유도하세요.
3. 마취를 유지하기 위해 코 콘 아래에 쥐를 넣고, 종양이 노출되도록 위치를 잡으세요.
4. 필요한 양(예: 여기서 사용된 30 μL)을 29 G 1/2인치 바늘로 0.3 mL 인슐린 주사기에 뽑아주세요. 공기 방울을 제거하세요.
   참고: 치료 선택과 최적화된 조건에 따라 부피가 달라집니다.
5. 바늘을 종양에 수평으로 삽입하고 종양 덩어리 중심부로 진행합니다.
   주의: 위쪽이나 급격한 각도에서 주입하는 것은 피해야 하며, 이는 주사가 너무 깊거나 주변 조직에 닿을 수 있습니다. 설명된 치료는 단일 주사로 투여되었습니다. 용량과 빈도는 모두 선택한 치료와 최적화된 조건에 따라 달라집니다. 작은 종양의 경우 단일 용량으로 치료가 분포되지만, 큰 종양의 경우 종양 덩어리에 고르게 분포하기 위해 여러 차례 주사가 필요할 수 있습니다.
6. 치료제를 천천히 꾸준히 주입하세요. 10초간 잠시 정지한 후 천천히 바늘을 빼 역류나 누수를 최소화하세요. 일부 종양은 내부 압력이 높기 때문에 주사가 바늘 구멍을 통해 새지 않도록 주의해야 합니다.
7. 이 과정을 각 마우스마다 반복하세요. 4-5마리의 쥐를 우리에 넣을 때마다 주사기를 교체하고, 처리 그룹을 변경할 때는 교차 오염을 방지하세요.
8. 마취 후 쥐가 움직임과 정상적인 호흡을 회복할 때까지 모니터링하세요. 치료 반응과 전반적인 건강 상태를 매일 계속 모니터링하세요.
   참고: 세포주에 따라 종양이 발생하는 시기에 따라 궤양이 발생할 수 있다는 점을 유의하세요. 각 실험과 각 IACUC 프로토콜에는 명확한 평가 기준과 제외 기준이 명시되어 있습니다. 실험실에서는 쥐 실험의 평가 지점이 1500 mm³ 이며, 발생한 궤양은 인정되어 연구에서 제외되지 않습니다.

결과

조영 주사 시에는 안락사 없이도 주사 부위에 눈에 띄는 '거품'이 형성되는 것을 관찰하여 성공적인 피내내 분사를 확인할 수 있습니다. 적절히 시행된 피내 주사는 크고 뚜렷하며 솟아오른 '기포'를 생성합니다(그림 1A–F). 작거나 평평한 기포는 주사가 부분적으로 피하에 삽입되었을 가능성을 시사합니다. 만약 '기포'가 형성되지 않고 조영제나 세포가 피부 아래에 퍼져 있다면, 주사는 피하에 삽입되었을 가능성이 높습니다(그림 1G–J). 연습 주사 후 동물이 안락사될 경우, 피부를 열어 피하 공간에 누출된 주사를 확인할 수 있습니다.

피내주사 후 약 5일 후에 종양이 보이기 시작하고, 7일에서 10일 후에는 치료에 적합해집니다. 종양이 피하가 아닌 피내임을 확...

토론

이 프로토콜(그림 4)의 성공은 피하층이 아닌 진피층으로 주사를 전달하도록 피내의 주사 깊이를 일정하게 유지하고 바늘을 정밀하게 배치하는 데 달려 있습니다. 바늘 각도가 너무 가파르거나 주입 압력이 너무 높으면 염료나 종양 세포가 피부를 통해 피하 공간으로 침착될 수 있습니다. 주사 후에는 바늘을 천천히 빼기 전에 잠시 멈추는 것이 옆구리에 누설되거나 이중 종양('눈사람' 형태)의 형성을 방지하는 데 도움이 됩니다. 주사 연습과 쥐 다룰 때는 항상 바늘에 찔릴 위험을 최소화할 수 있도록 단단한 손잡이를 유지하세요. 문제 해결을 위해 올바른 피 내 위치를 나타내는 눈에 띄는 '기포'가 있는지 확인하고, 사용 전에 주사기에 기포가 없는지 확인하세요. 단단한 피부 긴장을 유지하면 정확도가 향상되며, 주사기를 정기적으로 교체하면 바늘이 둔해지는 것을 방지해 정밀도를 떨어뜨립니다. 피부가 두껍고 덜 유연한 수컷 마우스를 대상...

재료

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이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 mL 자연 원심분리관	USA Scientific	1615-5500
150 cm2 세포 배양 플라스크	Corning	430825
Fluriso	Vet One	13985-528-60	아이소플루란
식용 색소	Durkee		연습용
인슐린 주사기 0.33 x 12.7 mm	Exel	26018
미니 아르코	Wahl	08787-450A	쥐를 면도하기 위한 가위
PBS, 1X w/o 칼슘 및 마그네슘	Corning	06325002	pH 7.4 +/- 0.1
RPMI 1640, 1x	Corning	12225004
SomnoFlo 저유량 전자 기화기	Kent Scientific	SF-01	마취 기계

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