본 연구는 TWIK 관련 산에 민감한 K+ 채널 2(Task2)를 나노디스크로 재구성하는 절차를 설명합니다. 이 성공적인 조립은 단일 입자 크라이오전자 현미경으로 확인되었으며, 명확한 2차원 클래스 평균을 얻었다.
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이 논문에서
요약
초록
많은 막 단백질은 세제 기반 환경에서 추출할 때 안정성이 낮고 활성 저하, 샘플 이질성이 나타나 고해상도 냉동전자현미경 분석에 상당한 도전을 제기합니다. 나노디스크 기술은 막 스캐폴드 단백질(MSP)과 인지질을 이용해 표적 단백질을 토착 지질 이중층으로 재구성함으로써 이러한 한계를 해결합니다. 본 연구에서는 인간 칼륨 채널 Task2를 적절한 세제 사용 하에서 나노디스크 조립 전에 발현, 용해, 정제하였습니다. 결과물인 프로토콜은 주요 검증 단계에서 입증된 것처럼 Task2 나노디스크 재구성을 위한 재현 가능한 워크플로우를 확립합니다: 입자 확대를 확인하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로파일의 명확한 변화, SDS-PAGE에서 Task2와 MSP의 공동 이동, 그리고 2차 구조 특징이 명확히 정의된 2D 클래스 평균이 포함됩니다. 초기 3D 재구성은 나노디스크에 내장된 단백질의 무결성을 더욱 확인시켜 줍니다. 샘플 순도, 균일성, 입자 품질을 개선함으로써 이 접근법은 Task2의 고해상도 구조 연구를 위한 견고한 플랫폼을 제공하며, 다른 막 단백질에도 적용 가능한 방법론적 틀을 제공합니다.
서론
막 단백질은 세포 신호 전달, 대사물 수송, 세포 구조 완전성 유지, 면역 반응에 중요한 역할을 합니다. 막 단백질의 조절 장애는 다양한 질병과 관련이 있어 약물 개발의 주요 표적이 됩니다1. 크라이오전자현미경(cryo-em)의 등장으로 크고 역동적인 막 단백질의 구조적 연구가 가능해졌습니다2. 고해상도 구조를 얻는 주요 과제는 이 단백질들을 천연 지질 이중층에서 추출하면서 본래의 구조와 생화학적 기능을 보존하는 데 있습니다. 더불어, 막 단백질의 매우 역동적인 구조와 항체 스크리닝의 복잡성은 표적 신약 개발에 추가적인 장애물이 됩니다 3,4. 전통적인 막 단백질 추출 방법은 종종 소수성 지질 이중층의 특성을 모방하기 위해 세제를 사용합니다. 그러나 이 접근법은 종종 막 단백질의 안정성을 방해하여 응집 또는 부분 펼쳐짐을 초래합니다. 또한, 세제는 단백질 구조를 안정화하는 데 필수적인 지질 분자를 제거하여 단백질 구조를 변화시키거나 심지어 기능을 저하시킬 수 있어 항체 스크리닝 및 기타 후속 응용 분야....
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프로토콜
1. 지질 재료의 준비
- 지질 준비
- 세 가지 인지질을 사용하여 지질 혼합물을 제조합니다: 1,2-디올레올-sn-글리세로-3-포에탄몰아민(DOPE), 2-올레오일-1-팔미토일글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1-팔미토일-2-올레오일포스파티딜세린(POPS).
- 이 지질들을 미리 준비한 정액을 각각 25 mg/mL 농도로 클로로포름에 사용하세요.
참고: 클로로포름을 다룰 때는 개인 보호 장비가 필수이며, 모든 절차는 반드시 연기함 내에서 진행되어야 합니다. 클로로포름은 전용 화학 캐비닛에 보관하세요. - 클로로포름의 휘발성 때문에, 마이크로 주사기로 측정할 때 각 사용 전에 지질 용액의 부피가 처음 기록된 부피와 일치하는지 확인하세요. 증발이 발생하면 순수 클로로포름을 원래 부피로 보충하고 충분히 혼합하세요.
참고: 각 측정 전에 마이크로 주사기를 클로로포름으로 두 번 헹구세요. - 도프:팝시:팝스 = 2:1:1의 질량 비율을 가진 100 μL 지질 혼합물을 준비합니다. 이 비율에 따라 VDOPE 50 μL, VPOPC 25 μL, VPOPS 25 μ....
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결과
지질 스톡의 성공적인 준비는 초음파 검사 후 투명하고 투명한 용액이 형성됨으로 나타났습니다. MSP의 경우, 니켈-친화성 크로마토그래피는 약 3 mg/mL의 고순도 제품을 얻었습니다. SEC는 나노디스크 조립을 확인했으며, 특징적인 용출 프로파일을 보였습니다(그림 2). 나노디스크 조립 전에 얻은 Task2 SEC 프로필(그림 1)과 비교할 때, 조립 후 단백질 피크는 더 높은 용출부(나중에 용출)로 이동합니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이, SEC 프로파일은 두 가지 주요 피크를 나타냅니다: 조립된 나노디스크 복합체는 15.1 mL에서 용출되고 자유 MSP는 18.0 mL에서 용출됩니다. 우리는 피크 면적을 통합하여 조립 효율을 정량화했습니다. 조립된 나노디스크 피크 면적은 147.2였고, 자유 MSP 피크 면적은 31.5로, 조립 효율은 82.4%에 해당합니다(.......
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토론
이 방법은 세제를 제거하여 세제로 용해된 막 단백질을 나노디스크로 재구성하여 보다 자연스러운 지질 이중층 환경을 제공하는 데 제안됩니다. 이 조립 과정의 성공은 여러 핵심 요소에 달려 있습니다. 그중 가장 중요한 것은 막 단백질, MSP, 지질 간의 정확한 화학양론적 비율입니다. 부적절한 화학양론 비율은 단백질 응집이나 조립 실패로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 1:2:50 비율로 나노디스크를 조립하려는 첫 시도는 Task2의 완전한 집계로 이어졌습니다. 따라서 성공적인 조립을 위해서는 화학양론 비율을 최적화하는 것이 필요합니다. 지질 재료의 준비와 적절한 MSP 선정도 똑같이 중요합니다. 지질 조성은 자연 막을 모방하는 균질하고 투명한 용액을 형성하도록 최적화되어야 합니다. 또한, 나노디스크 직경을 결정하는 MSP 변이체 선택은 표적 막 단백질의 크기에 맞게 조정되어야합니다. 단백질보다 직경이 큰 나노디스크를 생성하는 M.......
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공개 사항
저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
저자들은 허난대학교 냉동전자기센터 직원들과 웨이 왕 교수님께 전문적인 지원을 제공해 주신 것에 감사를 표합니다. 자금은 중국 국가자연과학기금(BB)에서 지원했으며(32371261보조금은 B.L., 32301011는 R.Z.에 지원됨),
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 바이오 비즈 | 바이오 라디 | 1523920 | |
| 콜레스테릴 헤미숙시네이트 | 아나트레이스 | CH210 | |
| 클로로포름 | 시노어에이전트 | 훈 후드에서의 사용 | |
| 대박 | 아반티 | 850725P | |
| 메탄올 | 시노어에이전트 | ||
| n-도데실-베타-D-말토사이드 | 아나트레이스 | D310 | |
| N-펜테인 | 아다마스 | 훈 후드에서의 사용 | |
| POPC | 아반티 | 850457P | |
| 팝스 | 아반티 | 840034P | |
| SEC | 바이오 라디 | 제조사의 올바른 사용 프로토콜을 따르세요 | |
| 스네이크스킨 투석관 | 열학 | 68011 | |
| 슈퍼로스 6 증가 10/300 GL | 시티바 | 29091596 | |
| 초여과 스핀 컬럼 아미콘 울트라-15 | 밀리포어 | UFC905008 |
참고문헌
- Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
- Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
- Dodd....
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재인쇄 및 허가
