방법 논문

나노디스크 내 막 단백질 안정화 기법

DOI:

10.3791/70283

⸱

2026년 4월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구는 TWIK 관련 산에 민감한 K+ 채널 2(Task2)를 나노디스크로 재구성하는 절차를 설명합니다. 이 성공적인 조립은 단일 입자 크라이오전자 현미경으로 확인되었으며, 명확한 2차원 클래스 평균을 얻었다.

초록

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많은 막 단백질은 세제 기반 환경에서 추출할 때 안정성이 낮고 활성 저하, 샘플 이질성이 나타나 고해상도 냉동전자현미경 분석에 상당한 도전을 제기합니다. 나노디스크 기술은 막 스캐폴드 단백질(MSP)과 인지질을 이용해 표적 단백질을 토착 지질 이중층으로 재구성함으로써 이러한 한계를 해결합니다. 본 연구에서는 인간 칼륨 채널 Task2를 적절한 세제 사용 하에서 나노디스크 조립 전에 발현, 용해, 정제하였습니다. 결과물인 프로토콜은 주요 검증 단계에서 입증된 것처럼 Task2 나노디스크 재구성을 위한 재현 가능한 워크플로우를 확립합니다: 입자 확대를 확인하는 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 프로파일의 명확한 변화, SDS-PAGE에서 Task2와 MSP의 공동 이동, 그리고 2차 구조 특징이 명확히 정의된 2D 클래스 평균이 포함됩니다. 초기 3D 재구성은 나노디스크에 내장된 단백질의 무결성을 더욱 확인시켜 줍니다. 샘플 순도, 균일성, 입자 품질을 개선함으로써 이 접근법은 Task2의 고해상도 구조 연구를 위한 견고한 플랫폼을 제공하며, 다른 막 단백질에도 적용 가능한 방법론적 틀을 제공합니다.

서론

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막 단백질은 세포 신호 전달, 대사물 수송, 세포 구조 완전성 유지, 면역 반응에 중요한 역할을 합니다. 막 단백질의 조절 장애는 다양한 질병과 관련이 있어 약물 개발의 주요 표적이 됩니다1. 크라이오전자현미경(cryo-em)의 등장으로 크고 역동적인 막 단백질의 구조적 연구가 가능해졌습니다2. 고해상도 구조를 얻는 주요 과제는 이 단백질들을 천연 지질 이중층에서 추출하면서 본래의 구조와 생화학적 기능을 보존하는 데 있습니다. 더불어, 막 단백질의 매우 역동적인 구조와 항체 스크리닝의 복잡성은 표적 신약 개발에 추가적인 장애물이 됩니다 3,4. 전통적인 막 단백질 추출 방법은 종종 소수성 지질 이중층의 특성을 모방하기 위해 세제를 사용합니다. 그러나 이 접근법은 종종 막 단백질의 안정성을 방해하여 응집 또는 부분 펼쳐짐을 초래합니다. 또한, 세제는 단백질 구조를 안정화하는 데 필수적인 지질 분자를 제거하여 단백질 구조를 변화시키거나 심지어 기능을 저하시킬 수 있어 항체 스크리닝 및 기타 후속 응용 분야에서의 적용을 제한할 수 있습니다.

나노디스크 기술은 슬리가르와 동료들에 의해 처음 도입되었습니다. 7. 이 자가 조립 구조는 일반적으로 무지단백 A1(ApoA1) 유도체인 MSP와 합성 또는 천연 지질에 의해 형성되며, 막 단백질 7,8,9에 안정적인 환경을 제공합니다. MSP는 지질 이중층의 소수성 가장자리를 둘러싸며 원반 모양의 구조를 형성합니다. 이 구조는 소수성 표면을 가지고 있어 아실 지질 꼬리와 상호작용하여 막 단백질을 안정화시키고, 외부를 향한 친수성 표면을 가지고 있어 막 단백질이 수용성 용액에 잘 녹을 수 있도록 합니다10. 나노디스크는 막 단백질 연구를 위한 다목적 플랫폼 역할을 합니다. 정제된 막 단백질을 거의 천연 지질 환경에 보존함으로써 전통적인 세제 기반 방법의 한계를 극복하고 단백질의 구조와 생물학적 기능을 시험관 내에서 유지합니다. 그 결과, 이 방법은 막 단백질의 구조 연구에 강력한 도구가 되었습니다. 전통적인 세제 환경과 비교할 때, 나노디스크 내 지질 이중층은 막 단백질의 구조적 지지를 제공하여 그 자연 구조를 안정화시키는데, 이는 G 단백질 결합 수용체와 이온 채널과 같이 비활성화에 취약한 단백질에 매우 중요한 특징입니다. 또한, 조립 후 나노디스크 입자의 매우 균일한 특성은 고품질 극저온 전자기(cryo-em) 데이터와 신뢰할 수 있는 표면 플라즈몬 공명/생체층 간섭계 운동 데이터 획득에 더 강력한 지원을 제공합니다.

지난 10년간 나노디스크 기술은 자연 지질 환경에서 막 단백질을 연구하는 강력한 도구가 되었습니다. 예를 들어, Vilela와 동료13은 재구성 조건을 최적화하고 최종 구성 요소의 품질을 검증함으로써 나노디스크 조립을 위한 체계적인 틀을 확립했습니다. 구체적으로, 크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 조립 효율 및 최대 대칭성 등 정량적 지표를 결합하여 샘플의 균일성을 객관적으로 평가하였습니다13. 현재 나노디스크는 다용도 플랫폼이 되었습니다. 단일 입자 크라이오-EM을 이용해 조립된 나노디스크 재구성 단백질을 검출함으로써 막 단백질의 고해상도 구조를 얻을 수 있으며, 그 적용 가능성은 확고히 입증되었습니다. MSP 밴드의 이중 고리 밀도 특징은10, 14, 15의 성공적인 결합을 결정적으로 뒷받침하는 결정적 구조적 증거입니다. 더 나아가, 나노디스크는 지질 이중층 환경에서 막 단백질의 기능적 분석과 용액 핵자기공명 연구에 적용되는 데 귀중한 도구로 활용됩니다(16,17).

이 프로토콜은 인간의 Task2 막 단백질을 나노디스크로 조립하는 방법을 설명합니다. Human Task2는 2기공 도메인 K+ (K2P) 채널군18,19의 pH 게이트 멤버입니다. 다른 K2P 채널과 마찬가지로, Task2는 도메인 스왑 호모다이머로, 각 프로토머 사슬에는 네 개의 막을 관통하는 나선(TM1–TM4), 두 개의 재진입 기공 나선(PH1과 PH2), 두 개의 선택성 필터(SF1과 SF2), 그리고 두 개의 세포외 캡 형성 나선(CH1과 CH2)을 포함합니다. 표적 단백질은 C-말단 166개 아미노산이 없는 Task2의 절단형으로, 이 영역은 대부분 구조가 없을 것으로 예상되었으며, 단백질 발현과 생화학적 안정성을 개선하는 것으로 밝혀졌습니다. 재결합된 Task2의 분자량은 GFP 태그를 적용하면 약 72 kDa입니다. 사전에 세제로 용해되고 정제된 상태였다. 이 약물은 지질과 MSP와 정밀하게 계산된 화학양론적 비율로 결합되었습니다. 바이오비즈를 이용한 세제 제거 후, 샘플은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 추가 정제되어 냉동 전자기(cryo-em)에 적합한 준비물을 얻었습니다. 이후 단일 입자 극저온 EM 데이터를 통해 2차원(2D) 클래스 평균을 생성하여 샘플 무결성을 검증하였습니다.

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프로토콜

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1. 지질 재료의 준비

  1. 지질 준비
    1. 세 가지 인지질을 사용하여 지질 혼합물을 제조합니다: 1,2-디올레올-sn-글리세로-3-포에탄몰아민(DOPE), 2-올레오일-1-팔미토일글리세로-3-포스포콜린(POPC), 1-팔미토일-2-올레오일포스파티딜세린(POPS).
    2. 이 지질들을 미리 준비한 정액을 각각 25 mg/mL 농도로 클로로포름에 사용하세요.
      참고: 클로로포름을 다룰 때는 개인 보호 장비가 필수이며, 모든 절차는 반드시 연기함 내에서 진행되어야 합니다. 클로로포름은 전용 화학 캐비닛에 보관하세요.
    3. 클로로포름의 휘발성 때문에, 마이크로 주사기로 측정할 때 각 사용 전에 지질 용액의 부피가 처음 기록된 부피와 일치하는지 확인하세요. 증발이 발생하면 순수 클로로포름을 원래 부피로 보충하고 충분히 혼합하세요.
      참고: 각 측정 전에 마이크로 주사기를 클로로포름으로 두 번 헹구세요.
    4. 도프:팝시:팝스 = 2:1:1의 질량 비율을 가진 100 μL 지질 혼합물을 준비합니다. 이 비율에 따라 VDOPE 50 μL, VPOPC 25 μL, VPOPS 25 μL를 결합합니다. 계산된 수치에 따라 해당 부피를 측정하세요. 유리 시험관에 넣고 충분히 섞으세요.
    5. 유리 시험관을 물욕에 넣어 클로로포름의 휘발을 줄이고 주변 온도를 안정적으로 유지하세요.
  2. 지질 필름 준비
    1. 클로로포름을 부드러운 질소 가스 흐름 아래에서 증발시켜 모든 액체가 제거되고 시험관 바닥에 투명하고 균질한 젤 같은 막이 형성됩니다.
      참고: 유리관 바닥에 균일하고 건조한 지질막이 보이고, 잔여 액상 방울이 없는지 확인하세요. 과도한 질소 흐름은 기포를 유발하고 클로로포름의 완전한 건조를 방해할 수 있으므로 피하세요.)
    2. 약 2mL의 n-펜테인을 유리 시험관에 떨어뜨리듯 첨가합니다. 그 후 1.2.1에 설명된 질소 건조 방법으로 용매를 증발시켜 건조하고 투명한 지질 막을 얻습니다. n-펜테인은 화학적 비활성 성과 유기 용매와의 적합성 때문에 유리 시험관 내에서 증발됩니다. 유리는 많은 플라스틱 실험실용품 재료와 관련된 플라스틱 침출 또는 열화 위험을 방지하여 필름 형성 과정에서 지질 순도를 유지합니다.
      참고: n-펜테인은 전용 시약장에 보관해야 하며, 사용 시 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기호에서 조심스럽게 다루어야 합니다.
    3. 시험관 뚜껑을 풀고 진공 건조기에 넣으세요. 건조기를 진공 상태로 유지하여 잔류 용매를 제거하세요. 건조기 바닥에 자체 표시 실리카 젤을 놓아 수분을 흡수하세요.
      참고: 잔여 클로로포름과 n-펜테인은 훈기 후드에서 증발시켜 건조시킵니다.
  3. 지질 수화 및 정액 제조
    1. 진공 건조기에서 지질 막을 제거하고, 250 μL 무세제 저염 완충제(LSB)를 첨가하여 수분을 공급합니다(보충표 1). 최종 지질 농도는 10 mg/mL로 나옵니다.
      참고: Task2가 칼륨 이온 채널이기 때문에 칼륨 이온 기반 버퍼를 선택했습니다
    2. 지질을 재현탁한 후, 지질을 네 개의 유리관에 고르게 나누어 초음파 처리하여 투명하고 투명해질 때까지 진행하여 성공적인 리포좀 형성(약 1.5시간)을 나타냅니다. 4초 켜고 6초 끄는 사이클을 사용하여 60% 진폭으로 초음파 검사를 수행하세요.
    3. 정액화된 지질 용액을 모아 1.5mL를 개별 마이크로 원심분리관에 분리합니다. 즉시 각 튜브의 헤드스페이스를 질소 가스로 세척하고 -80 °C에서 보관하여 사용 시까지 보관하세요.

2. MSP의 과다 발현 및 정제

  1. 원핵생물의 MSP 발현
    1. 플라스미드 형질전환: 7×His 태그를 가진 MSP1D1 플라스미드를 사용하여 대장균 BL21(DE3) 유능 세포를 변환합니다. 형질전환 혼합물을 카나마이신(50 μg/mL)이 포함된 루리아-베르타니(LB) 한천 플레이트에 판 부착하고 37°C에서 하룻밤 배양하여 단일 군락을 얻습니다.
    2. 배양 증폭: 단일 클론을 선택하여 카나마이신이 포함된 LB 배지 5mL에 접종하고, 37°C에서 하룻밤 동안 진동시키며 배양합니다. 1:100 비율로 액체 LB 배지에 하룻밤 접종한 후, 37 °C에서 흔들면서 600 nm(OD600)에서 광학 밀도가 2.0–3.0에 도달할 때까지 증육합니다.
    3. 단백질 발현 유도: 이소프로필 β-d-1-티오락토피라노사이드(IPTG)를 최종 농도인 0.5–1 mM에 첨가하여 MSP 발현을 유도합니다. 16°C에서 16–20시간 동안 흔들면서 세포를 계속 배양하세요.
  2. 세포 교란
    1. 펠릿 수집: 박테리아 배양물을 4°C에서 10분간 원심분리합니다. 상청액은 버리고 세포 펠릿은 남겨두세요.
    2. 박테리아 용해: 1L의 배양에서 추출한 펠릿을 100–150 mL의 용해 완충액에 재현탁합니다(보충표 1). 눈에 띄는 덩어리가 보이지 않는 균일한 현탁액이 될 때까지 철저히 균질화하세요. 현탁액에 PMSF를 첨가해 프로테아제를 억제하고 거품을 줄이세요.
    3. 초음파 검사: 냉장 초음파 세포 교란기를 사용해 박테리아를 파괴합니다. 전력을 35%로 설정하고 3초 펄스와 6초 일시정지 사이클을 적용하세요. 과열을 방지하기 위해 누적 초음파 검사 시간이 15분마다 2분씩 휴식을 취할 수 있도록 하세요. 용해액이 투명하고 연한 갈색이 될 때까지 계속하세요.
    4. 설명: 용해액을 30,000g에서 45분간 45분간 원심분리하고, 이후 단계에 사용할 상청액을 수집합니다.
  3. MSP 정제
    1. Ni-NTA 수지 제제: Ni-NTA 수지 3–5 mL를 중력 칼럼(크기: 26.4×134.8 mm)에 포장합니다. 증류수 3컬럼 부피(CV)로 수지를 세척하고, 3 CV의 워시 버퍼 1(보충표 1)과 평형을 맞춥니다.
    2. MSP와 수지 결합: 세포 용해액을 원심분리한 후, 상원액과 평형 Ni-NTA 수지를 혼합합니다. 최종 농도인 5 mM에 이미다졸을 첨가한 후, 4 °C에서 2시간 동안 어둠 속에서 부드럽게 회전시키며 배양합니다.
    3. 불순물 제거를 위한 세척: 세척 완충제 1, 세척 완충 2(보충 표 1), 세척 완충제3(보충 표 1)의 구배로 각 완충액 최소 50mL를 사용해 순차적으로 세척합니다. 흐름 280nm(A280)에서 자외선 흡수를 모니터링하고A280 값이 0.01 이하로 떨어질 때까지 계속 세척하세요.
    4. 용출: 표적 단백질을 용출 버퍼(보충표 1)로 용출하고 용출물 분획을 수집합니다. 용출 과정을 계속하며 분획을 수집하여 윤리액의 A₂₈₀가 0.01 이하로 떨어질 때까지 계속합니다.
    5. 공정 모니터링 및 분석: 상정액, 침전물, 유동, 세척 분획, 용출 분획 등 주요 정제 단계에서 샘플을 수집합니다. SDS-PAGE를 통해 정화 효율을 평가하기 위해 분석하세요(보충 그림 1).
    6. 완충 교환을 위한 투석: 모인 윤출액을 투석관 안에 옮겨 4°C에서 투석 완충제(보충표 1)와 함께 하룻밤 부드럽게 저어줍니다.
    7. 초여과 및 농축: 투석 후 용액을 초음파 장치를 사용해 최종 MSP 농도인 2–5 mg/mL로 농축합니다. 정제 및 농축된 MSP는 이제 막 단백질 나노디스크 조립에 사용할 준비가 되었습니다.

3. 바이오 비즈의 활성화

  1. 무게 측정
    1. 분석 저울을 사용해 약 250mg의 바이오 비즈를 50mL 원심분리관에 무게를 젬습니다.
  2. 메탄올 세척
    1. 튜브에 메탄올 25–30mL를 추가하세요. 어두운 곳에서 혼합물을 충분히 회전시키거나 소용돌이로 돌린 후 20분간 부양하세요. 인큐베이션 후에는 상청액을 조심스럽게 버리세요.
    2. 이 메탄올 세척 단계를 총 세 번 반복하세요.
      참고: 메탄올의 휘발성 때문에 이 절차는 적절한 개인 보호 장비를 갖춘 연기함 내에서 수행되어야 합니다. 사용한 메탄올을 수집하여 생물학적 폐기물로 처리하세요.
  3. 수성 워시
    1. 구슬에 25–30 mL ddH2O를 추가합니다. 튜브를 흔들거나 돌려서 섞고 20분간 배화하세요.
    2. 상원액은 버리세요. 이 수성 세척 과정을 세 번 반복하세요.
  4. LSB와의 평형
    1. 비즈에 세제 없는 LSB 25–30mL를 추가하세요. 튜브를 회전 테이블 위에서 흔들거나 돌려 20분간 섞고 배양하세요.
    2. 상원액은 버리세요. 이 LSB 평형 단계를 세 번 반복하여 비즈를 완전히 조건화합니다.
  5. 분할 및 보관
    1. 활성화된 바이오 비즈를 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브 세 개에 균등하게 나누어 주세요. 비즈가 소량의 LSB로 촉촉하게 유지되도록 하세요.
    2. 튜브를 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호하고, 얼음 위에 보관해 즉시 사용할 수 있습니다.

4. 나노디스크 조립

  1. 지질 및 MSP 제제
    1. 지질 재고 정제: 미리 준비된 지질 재고 한 알리코트를 채취해 해동합니다. 즉시 튜브를 7,000 x g 에서 4 °C에서 5초간 원심분리하여 바닥에 내용물을 수집합니다.
    2. 과열을 방지하기 위해 수조에서 초음파 검사를 하고 5–10분마다 투명도와 온도를 모니터링하세요. 60% 진폭으로 초음파 처리를 하세요. 지질 스톡이 투명하고 투명해질 때까지 초음파 검사를 하세요.
    3. MSP 해동: 준비된 MSP 용액의 1 알리코트를 얼음물 목욕에서 녹입니다.
  2. 화학양론 비율에 따라 완충제를 준비하세요.
    1. 막 단백질 정량화: 정제된 막 단백질(Task2)을 0.025% DDM/0.005% CHS에 용해된 크기배제 크로마토그래피(SEC)로 분리합니다. 500 μL 샘플을 분당 0.5 mL 유속으로 Superose 6 Increase 컬럼(Cytiva)에 주입합니다. 14.8mL에서 용출된 피크를 수집하여 농축합니다(그림 1). 나노드롭을 사용해 단백질 농도를 측정하세요.
    2. 단백질 몰 양 계산: 표적 막 단백질의 몰량(n)을 공식으로 계산합니다: n = C × V, 여기서 C는 몰 농도, V는 부피입니다.
    3. MSP 및 지질 부피 산정: 목표 단백질의 몰 화학양론 비율을 바탕으로 MSP 및 지질 용액의 필요한 부피를 계산합니다: MSP : 지질 = 1 : 5 : 250.
    4. 마스터 믹스 준비: 계산 결과를 바탕으로 해당 부피의 지질과 MSP를 결합하여 300 μL 마스터 믹스를 준비합니다.
      참고: 이 혼합물에 세제가 포함되어 단백질 용액과 일치하는 농도를 유지하여 조기 응집을 방지해야 합니다.
  3. 세제 제거 및 나노디스크 조립
    1. 재구성 혼합물을 사용한 초기 배양: 준비된 혼합 버퍼(보충표 1)를 얼음 위에 10분간 배양합니다. 그 후 혼합물 50 μL을 천천히 농축 단백질 용액에 첨가하고, 피펫팅으로 부드럽게 혼합하여 균질성을 보장합니다.
    2. 단백질-지질 혼합물의 평형화: 혼합물을 얼음 위에 1시간 동안 보관합니다. 튜브를 15분마다 부드럽게 뒤집어 완전히 섞으세요.
    3. 바이오 비즈를 사용한 첫 번째 배양: 4 °C에서 7,000 x g 에서 5초간 혼합물을 잠시 원심분리하여 튜브 바닥에 단백질 용액을 수집합니다. 사전 활성화된 바이오비즈 한 알리코트를 취해 잔류 LSB를 흡인한 뒤, 단백질 용액을 비즈에 첨가한 뒤, 어둠 속에서 1시간 동안 회전시키며 배양하여 표적 단백질의 빛에 의한 분해를 방지합니다.
    4. 바이오비즈를 사용한 두 번째 인큐베이션: 혼합물을 7,000 x g 에서 4 °C에서 5초간 원심분리한 후, 상원액을 두 번째 바이오 비즈(LSB도 흡입한 상태)로 조심스럽게 옮기고, 어두운 곳에서 4–8시간 또는 하룻밤 동안 부드럽게 역전시켜 잘 섞습니다.
    5. 바이오 비즈를 이용한 최종 배양: 하룻밤 배양 후 단백질 용액을 회수하여 잠시 원심분리한 후 상청액을 세 번째이자 마지막 부분인 사전 활성화된 바이오 비즈로 옮깁니다. 어두운 곳에서 4°C에서 회전시키고 1시간 동안 배양하세요.
    6. 짧은 원심분리 후 상원액을 깨끗한 마이크로 원심분리관으로 옮기고, 17,000 x g 압력에서 4 °C에서 10분간 원심분리하여 응집체를 제거합니다.
      참고: 사용한 바이오 비즈는 생물학적 폐기물로 폐기하세요.
    7. 나노디스크 정제: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 나노디스크-Task2 복합체를 정제합니다: 500 μL 샘플을 0.5 mL/min 유량으로 Superose 6 Increase 컬럼에 주입하고, 15 mL에서 용출 피크를 수집합니다(그림 2).
    8. 최종 산물 농도: SEC 용출에서 추출한 피크 분획을 모아 1.2–1.5 mg/mL의 최종 나노디스크-Task2 농도로 농축하여 냉동 전자기(cryo-em) 샘플 준비에 적합합니다.

5. 나노디스크 조립이 성공적인지 확인

  1. SDS-PAGE 분석: SEC 정제 분획에서 샘플을 추출합니다.
    1. 샘플을 12% SDS-PAGE로 분석하여 주요 성분(예: MSP 및 표적 막 단백질)의 존재를 확인하는데, 이는 성공적인 나노디스크 조립을 나타냅니다(그림 3).
  2. 냉동 전자기(Cryo-EM) 샘플 준비 및 분석.
    1. 성공적으로 조립된 샘플을 최종 농도인 1.2–1.5 mg/mL로 농축하여 냉동 EM 샘플 준비를 합니다.
    2. 샘플을 17,000 x g , 4 °C에서 10분간 원심분리하여 시작하세요. 3 μL 방울을 갓 발광한 Quantifoil R1.2/1.3 금 그리드(300 메쉬, 구멍 뚫린 탄소)에 증착합니다.
    3. 4°C에서 100% 습도에서 5초간 부화시킵니다. Vitrobot Mark IV에서 그리드를 4초간 표시하고, 액체 질소 온도에서 유지된 액체 에탄에 잠수-냉동합니다.
    4. 300 kV로 동작하는 Titan Krios G4 크라이오-EM 장치에서 EPU 소프트웨어를 사용해 초해상도 영화 스택을 수집하고, Falcon G4i 직접 전자 검출기가 장착되어 있습니다.
    5. 노출 시간을 2.78초로 설정하는데, 이는 픽셀 크기가 0.73 Å(165k ×)이고 총 누적 선량은 EER 영화 스택당 약 50 e⁻/Å2 에 해당합니다.

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결과

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지질 스톡의 성공적인 준비는 초음파 검사 후 투명하고 투명한 용액이 형성됨으로 나타났습니다. MSP의 경우, 니켈-친화성 크로마토그래피는 약 3 mg/mL의 고순도 제품을 얻었습니다. SEC는 나노디스크 조립을 확인했으며, 특징적인 용출 프로파일을 보였습니다(그림 2). 나노디스크 조립 전에 얻은 Task2 SEC 프로필(그림 1)과 비교할 때, 조립 후 단백질 피크는 더 높은 용출부(나중에 용출)로 이동합니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이, SEC 프로파일은 두 가지 주요 피크를 나타냅니다: 조립된 나노디스크 복합체는 15.1 mL에서 용출되고 자유 MSP는 18.0 mL에서 용출됩니다. 우리는 피크 면적을 통합하여 조립 효율을 정량화했습니다. 조립된 나노디스크 피크 면적은 147.2였고, 자유 MSP 피크 면적은 31.5로, 조립 효율은 82.4%에 해당합니다(...

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토론

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이 방법은 세제를 제거하여 세제로 용해된 막 단백질을 나노디스크로 재구성하여 보다 자연스러운 지질 이중층 환경을 제공하는 데 제안됩니다. 이 조립 과정의 성공은 여러 핵심 요소에 달려 있습니다. 그중 가장 중요한 것은 막 단백질, MSP, 지질 간의 정확한 화학양론적 비율입니다. 부적절한 화학양론 비율은 단백질 응집이나 조립 실패로 이어질 수 있습니다. 예를 들어, 1:2:50 비율로 나노디스크를 조립하려는 첫 시도는 Task2의 완전한 집계로 이어졌습니다. 따라서 성공적인 조립을 위해서는 화학양론 비율을 최적화하는 것이 필요합니다. 지질 재료의 준비와 적절한 MSP 선정도 똑같이 중요합니다. 지질 조성은 자연 막을 모방하는 균질하고 투명한 용액을 형성하도록 최적화되어야 합니다. 또한, 나노디스크 직경을 결정하는 MSP 변이체 선택은 표적 막 단백질의 크기에 맞게 조정되어야합니다. 단백질보다 직경이 큰 나노디스크를 생성하는 M...

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공개 사항

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저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

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저자들은 허난대학교 냉동전자기센터 직원들과 웨이 왕 교수님께 전문적인 지원을 제공해 주신 것에 감사를 표합니다. 자금은 중국 국가자연과학기금(BB)에서 지원했으며(32371261보조금은 B.L., 32301011는 R.Z.에 지원됨),

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
바이오 비즈바이오 라디1523920
콜레스테릴 헤미숙시네이트아나트레이스CH210
클로로포름시노어에이전트훈 후드에서의 사용
대박아반티850725P
메탄올시노어에이전트
n-도데실-베타-D-말토사이드아나트레이스D310
N-펜테인아다마스훈 후드에서의 사용
POPC아반티850457P
팝스아반티840034P
SEC바이오 라디제조사의 올바른 사용 프로토콜을 따르세요
스네이크스킨 투석관열학68011
슈퍼로스  6 증가 10/300 GL시티바29091596
초여과 스핀 컬럼 아미콘 울트라-15밀리포어UFC905008

참고문헌

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  1. Rask-Andersen, M., Almén, M. S., Schiöth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nat. Rev. Drug Discov. 10 (8), 579-590 (2011).
  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  3. Dodd, R., Schofield, D. J., Wilkinson, T., Britton, Z. T. Generating therapeutic monoclonal antibodies to complex multi-spanning membrane targets: overcoming the antigen challenge and enabling discovery strategies. Methods. 180, 111-126 (2020).
  4. Hutchings, C. J., Colussi, P., Clark, T. G. Ion channels as therapeutic antibody targets. MAbs. 11 (2), 265-296 (2019).
  5. Kotov, V., et al. High-throughput stability screening for detergent-solubilized membrane proteins. Sci. Rep. 9 (1), 10379(2019).
  6. Barrera, N. P., Zhou, M., Robinson, C. V. The role of lipids in defining membrane protein interactions: insights from mass spectrometry. Trends Cell Biol. 23 (1), 1-8 (2013).
  7. Bayburt, T., Grinkova, Y., Sligar, S. G. Self-assembly of discoidal phospholipid bilayer nanoparticles with membrane scaffold proteins. Nano Lett. 2 (8), 853-856 (2002).
  8. Carlson, J. W., Jonas, A., Sligar, S. G. Imaging and manipulation of high-density lipoproteins. Biophys. J. 73 (3), 1184-1189 (1997).
  9. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Self-assembly of single integral membrane proteins into soluble nanoscale phospholipid bilayers. Protein Sci. 12 (11), 2476-2481 (2003).
  10. Vinogradova, O. Nanodiscs and solution nuclear magnetic resonance. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103067(2025).
  11. Popot, J. L. Amphipols, nanodiscs, and fluorinated surfactants: three nonconventional approaches to studying membrane proteins in aqueous solutions. Annu. Rev. Biochem. 79, 737-775 (2010).
  12. Li, S. Detergents and alternatives in cryo-EM studies of membrane proteins. Acta Biochim. Biophys. Sin. 54 (8), 1049-1056 (2022).
  13. Vilela, F., Sauvanet, C., Bezault, A., Volkmann, N., Hanein, D. Optimizing transmembrane protein assemblies in nanodiscs for structural studies: a comprehensive manual. Bio Protoc. 14 (21), e5099(2024).
  14. Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. Lipid nanodiscs as a tool for high-resolution structure determination of membrane proteins by single-particle cryo-EM. Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).
  15. Grant, A. J., Schmidt-Krey, I. Nanodisc-reconstitution for single particle cryo-EM structure determination of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 93, 103072(2025).
  16. Yokogawa, M., Fukuda, M., Osawa, M. Nanodiscs for structural biology in a membranous environment. Chem. Pharm. Bull. 67 (4), 321-326 (2019).
  17. Denisov, I. G., Sligar, S. G. Nanodiscs for structural and functional studies of membrane proteins. Nat. Struct. Mol. Biol. 23 (6), 481-486 (2016).
  18. Enyedi, P., Czirják, G. Molecular background of leak K+ currents: two-pore domain potassium channels. Physiol. Rev. 90 (2), 559-605 (2010).
  19. Reyes, R., et al. Cloning and expression of a novel pH-sensitive two pore domain K+ channel from human kidney. J. Biol. Chem. 273 (47), 30863-30869 (1998).
  20. Notti, R. Q., Walz, T. Native-like environments afford novel mechanistic insights into membrane proteins. Trends Biochem. Sci. 47 (7), 561-569 (2022).
  21. Pocanschi, C. L., Kleinschmidt, J. H. The thermodynamic stability of membrane proteins in micelles and lipid bilayers investigated with the ferrichrom receptor FhuA. J. Membr. Biol. 255 (4-5), 485-502 (2022).
  22. Hiotis, G., Notti, R. Q., Bao, H., Walz, T. Nanodiscs remain indispensable for cryo-EM studies of membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 92, 103042(2025).
  23. Nakao, K., et al. Home is where the lipids are: a comparison of MSP and DDDG nanodiscs for membrane protein research. Soft Matter. 21 (33), 6596-6602 (2025).
  24. Dalal, V., et al. Lipid nanodisc scaffold and size alter the structure of a pentameric ligand-gated ion channel. Nat. Commun. 15 (1), 25(2024).
  25. Knowles, T. J., et al. Membrane proteins solubilized intact in lipid containing nanoparticles bounded by styrene maleic acid copolymer. J. Am. Chem. Soc. 131 (22), 7484-7485 (2009).
  26. Tao, X., Zhao, C., MacKinnon, R. Membrane protein isolation and structure determination in cell-derived membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 120 (18), e2302325120(2023).
  27. Zhang, S., et al. One-step construction of circularized nanodiscs using SpyCatcher-SpyTag. Nat. Commun. 12 (1), 5451(2021).
  28. Ren, Q., et al. DeFrND: detergent-free reconstitution into native nanodiscs with designer membrane scaffold peptides. Nat. Commun. 16 (1), 7973(2025).

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