연구 논문

프룩투스 잔티이(Fructus xanthii ) 추출물은 연골의 완전성을 보존하여 골관절염을 완화합니다

DOI:

10.3791/70284

⸱

2026년 6월 12일

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1Department of Orthopedic Surgery, The First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University & Shandong Provincial Qianfoshan Hospital, 2Biomedical Sciences College & Shandong Medicinal Biotechnology Centre, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, 3Neck-Shoulder and Lumbocrural Pain Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences, 4Central Hospital of Shandong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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이 연구 프로토콜은 통합 다중 오믹스 분석과 생체 내 실험을 통해 골관절염에서 Fructus Xanthii 추출물의 연골 보호 효과를 체계적으로 조사하기 위해 설계되었습니다.

초록

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골관절염(OA)은 진행성 퇴행성 관절 질환으로, 현재의 약물 및 외과적 개입이 기저 병리학적 변화를 되돌리기보다는 주로 증상 완화에 집중하고 있어 새로운 치료제의 긴급한 필요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 Fructus Xanthii 추출물이 골골증에 대해 가진 연골 보호 효과를 조사하는 것을 목표로 했습니다. 첫째, 초고성능 액체 크로마토그래피와 고해상도 탠덤 질량분석법(UHPLC-HRMS/MS)을 결합하여 추출물의 화학 성분을 특성화하기 위해 비표적 대사체학 프로파일링을 수행했습니다. 네트워크 약리학과 전사체 마이닝을 결합한 통합 전략을 적용하여 추출물의 생리활성 성분과 추정 표적을 식별하고, OA 관련 조절 장애 유전자와의 교차 분석을 통해 핵심 표적 유전자를 얻었습니다. 유전자 온톨로지(GO)와 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 풍부화 분석을 수행하여 추출물이 조절하는 주요 생물학적 과정과 신호 전달 경로를 주석하였습니다. 생체 내 검증을 위해 제브라피시 연골 손상 모델과 마우스 OA 모델을 사용하여 추출물의 연골 보호 효과를 평가하였다. 치료 후 연골세포의 전사체 변이를 분석하기 위해 RNA 시퀀싱(RNA-seq)이 추가로 채택되었으며, 이는 골관절 관련 경로와 유전자 발현 프로필에 중점을 두었습니다; 이후 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 통해 RNA-seq로 스크리닝된 주요 단백질/수용체의 발현 수준을 검증하여 Fructus Xanthii 추출물이 핵심 OA 표적에 미치는 조절 효과를 더욱 확인하였습니다. 이 통합된 다중 오믹스 및 실험 프로토콜은 Fructus Xanthii 추출물이 OA 개입의 유망한 식물학적 후보로서 잠재력을 체계적으로 탐구할 수 있는 접근법을 제공합니다.

서론

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골 관절염(OA)은 관절 연골의 점진적 퇴화, 연골하 골경화증, 활막 염증, 골 형성을 특징으로 하는 퇴행성 관절 질환입니다. 글로벌 질병 부담(GBD) 연구에 따르면, 1990년부터 2020년까지 204개국과 지역에서 골관절염의 유병률이 꾸준히 증가했으며, 이 추세는 전 세계 인구 고령화와 함께 가속화될 것으로 예상됩니다. 현재 추정에 따르면 전 세계적으로 2억 5천만 명 이상이 영향을 받고 있으며, 이는 개인의 복지, 의료 시스템, 사회경제적 구조에 상당한 부담을 주고 있습니다. 현재 치료법은 주로 증상 완화에 초점을 맞추고 있으며, 비스테로이드성 소염제(NSAIDs)와 관절 내 히알루론산(HA)을 통한 관절 내 점성 보조가 가장 일반적인 치료법입니다. 그러나 이러한 접근법은 임상적 이점이 제한적이며 상당한 부작용과 연관되어 있습니다 5,6. 이는 효과적인 질병 조절 골관절염 약물(DMOADs)의 중요성을 강조합니다.

전통 중의학(TCM)은 오랫동안 골관절증(OA) 관리에 사용되어 왔으며, 이는 '양성 증후군'의 하위 유형인 '골 양성(bone bi)' 개념에 기반합니다7. 이 틀에서 OA의 병인은 주로 간과 신장 정기 결핍, 기와 혈액 부족, 그리고 이후 바람, 추위, 습기 침입에 기인한다8. 따라서 치료 전략은 바람에 의한 습기를 해소하고, 추위를 분산시키며, 부수적 막힘을 뚫는 데 중점을 둡니다. 한의학 치료는 다표적 효과, 긍정적인 부작용 프로필, 임상적으로 유의한 효능으로 주목받고 있습니다10. 부기 통루오 캡슐(BQTL)과 푸지 덥(FZD)과 같은 주목할 만한 제제는 임상 실무에서 명확한 항OA 효과를 보여주었으며, 두화기성탕(DHJST)은 수세기 동안의 경험적 사용으로 NLRP3 인플라마좀 경로를 억제하여 OA 증상을 완화합니다. 마찬가지로, Shenjinhuoxue 혼합물(SHM)은 IL-1β와 TNF-α 같은 염증성 매개체의 하향 조절을 통해 통증과 연골 퇴행을 완화합니다 11,12,13. 단량체 수준에서는 약용 식물에서 유래한 이카린(Cyanoside A, CyA)과 에리아닌(erianin)과 같은 화합물이 연골 증식을 촉진하고 염증성 사이토카인 분비를 억제하며 관절 항상성을 유지하는 것으로 보고되었습니다14,15. 통치는 항염증, 연골 보호, 증상 완화 특성을 갖춘 포괄적인 치료 접근법을 제공합니다. 그러나 그 메커니즘의 복잡성과 표준화와 관련된 문제들은 지속적인 엄격한 연구를 필요로 합니다.

Fructus Xanthii(합성과)의 건조 익은 과일, 흔히 '창얼자'로 알려져 있으며, 항균, 항염증, 항산화, 진통, 항종양, 면역조절 등 다양한 약리학적 작용을 보이는 것으로 문서화되어 있습니다16. Fructus Xanthii에서 분리된 페놀산은 류마티스 관절염(RA)에서 유활 과형성을 효과적으로 감소시킵니다17. 이 중 대표적인 카페오일퀸산 유도체인인 클로로겐산(CGA)은 RANKL 매개 조골세포 형성을 억제하면서 골모세포 증식과 분화를 자극하여 골격 항상성을 유지하는 것으로 밝혀졌습니다. 같은 추출물 내에서 확인된 다른 페놀산들, 예를 들어 네오클로로겐산(5-CQA), 크립토클로로제닉산(CCA), 프로토카테추산도 항균, 항염증, 항종양, 항산화 특성을 보인다 19,20,21. 페놀산 외에도 창얼자에 존재하는 다양한 2차 대사산물이 이러한 생활성에 기여합니다 16,20,22,23,24,25. 그러나 골골증에서 Fructus Xanthii 추출물의 정확한 역할과 기전은 아직 대부분 밝혀지지 않았습니다.

비표적 액체 크로마토그래피-탠덤 질량분석법(LC-MS/MS) 대사체학은 가설이 없고, 고처리량이며, 전 세계적으로 적용할 수 있는 능력을 특징으로 합니다. 수천 개의 대사산물 특징을 동시에 검출할 수 있게 하여 대사 네트워크의 전경을 제공하며, 사전 표적 사전 지정 없이도 새로운 바이오마커와 비정상적인 대사 경로를 체계적으로 발견할 수 있게 합니다26,27. 고해상도 질량분석법과 결합하여 이 접근법은 혈청, 활액, 소변, 연골 조직 등 다양한 생물학적 샘플의 종합 분석에 적합하며, 골관절염(OA) 연구에서 상당한 이점을 입증했습니다. 한편으로는 OA의 병리적 진행과 밀접하게 관련된 차별화된 대사산물(예: 활액 및 활막 조직에서 확인된 다양한 대사산물)을 포괄적으로 선별하고, 이를 에너지 대사, 연골 수리, 골형성, 지질 대사 등 주요 경로와 연결하여 OA 발병 기전 이해를 심화시킬 수 있습니다. 반면, 전사체학과 단백질체학 같은 다중 오믹스 데이터를 통합하면 연골 퇴행, 염증 반응, 관절 구조 손상에서 대사 재프로그래밍의 역할을 밝혀내며, 조기 진단 바이오마커 식별, 질병 진행 평가, 그리고 담즙산, 트립토판, 지방산 대사 조절 등 표적 대사 개입 전략 개발에 중요한 증거를 제공하며, 이는 다음과 같은 OA 정밀 타이핑과 개인 맞춤형 치료에 관한 연구.

제브라피시는 여러 장점 덕분에 훌륭한 모델 생물로 활용됩니다: 인간의 게놈과 매우 보존되어 있으며, 인간 단백질 암호화 유전자의 약 70%와 상동성을 공유합니다28,29. 빠른 발달, 체외수정, 편리한 생체 내 영상 촬영을 가능하게 하는 투명 배아, 높은 산란력, 낮은 유지보수 비용 등 주요 특징을 보입니다 30,31,32,33. 골격 연구에서 제브라피시는 뼈 형성, 광물 생성 과정, 재생 능력을 명확히 시각화할 수 있게 하며, 골다공증이나 연골 손상과 같은 병리적 상태를 시뮬레이션하는 데 활용될 수 있습니다. 그러나 관절 연골 퇴행, 활막 염증, 연골하 골 변형을 특징으로 하는 복잡한 전관절 질환인 골관절염(OA) 연구에서는 제브라피시 모델의 적용이 상대적으로 제한적입니다.

본 글은 UHPLC-HRMS/MS 기반 비표적 대사체학, 네트워크 약리학, 전사체 마이닝, 생체 내 실험 검증을 통합하여 Xanthium sibiricum 추출물이 OA 개입에 적합한 식물 후보로서 잠재력을 탐구하는 프로토콜을 제시합니다. 목표는 OA와 관련된 Xanthium sibiricum 추출물의 생리활성 성분, 잠재적 표적 및 핵심 조절 경로를 다중 오믹스 통합 및 계산 분석을 통해 규명하는 것뿐만 아니라, 생체 내 모델을 통해 OA에 대한 연골 보호 효과를 검증하고 연골 세포 전사체에 대한 조절 메커니즘을 더욱 명확히 하는 것입니다.

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프로토콜

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임상 샘플과 쥐를 대상으로 한 모든 실험은 산둥성 의학생명공학연구센터 윤리심사위원회가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 인간 관절 연골 세포의 분리 및 배양

산둥 제1의과대학 제1부속병원에서 관절경 수술 또는 전관절 접합술을 받은 환자들로부터 인간 관절 연골 표본을 채취하였습니다. 연골 절제는 수술 후 30분 이내에 얼음 위에 올려 실험실로 옮겨졌습니다. 조직은 얼음처럼 차가운 둘베코 인산염 완충 생리식염수(DPBS; 3–5회 세척)로 철저히 세척한 후, 멸균 수술용 가위로 약 1 mm3 조각으로 곱게 다져졌다. 순차적인 효소 소화가 수행되었으며, 37°C에서 0.25% 트립신-EDTA를 사용한 30분간 소화 전부터 시작되었습니다. 소화 과정은 연골 조각이 얇아지고 크기가 줄어들며 투명해질 때까지 모니터링된 후, 연골 조각은 실온에서 원심분리(200 × g, 5분)로 수집되었습니다. 이어 8시간, 37°C에서 0.2% 타입 II 콜라겐제를 투여한 하룻밤 소화를 지속적으로 부드러운 교반 하에 진행했습니다. 소화 과정은 거시적으로 보이는 연골 조각이 완전히 용해될 때까지 모니터링되었습니다. 방출된 세포는 실온에서 원심분리(200 × g, 5분)로 수집한 후, 10% 태아 소 혈청, 100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충한 완전한 DMEM에 재현탁하여 75 cm2 배양용 플라스크에 씨앗을 넣었습니다. 세포는 5%CO2가 포함된 가습 환경에서 37°C에서 유지되었습니다. 부착 연골 세포는 0.25% 트립신-EDTA를 사용해 분리하였고, 부착 세포가 배양 플라스크 표면의 80% 합류점에 도달하면 세포를 1:3 비율로 아부배양하였다.

2. 프룩투스 잔티이 추출물 제제

Xanthium strumarium L.(Fructus Xanthii)의 건조 익은 과일을 중국 북부의 자연 개체군에서 채집하여 고위 약사에 의해 인증되었습니다. 표본은 산둥 제1의과대학 식물 표본관에 기탁되었습니다. 20g의 곱게 분말화된 Fructus Xanthii를 추출 골무에 넣고, 95% 에탄올(약 250mL)을 사용해 7에서 8번의 사이펀 사이클이 완료될 때까지 소크슬렛 추출을 철저히 수행했다. 에탄올 추출물을 여과한 후, 로터리 증발기를 사용해 45°C의 저압 상태에서 여과물을 농축하여 건조하게 만들었습니다. 생성된 잔류물은 60mL의 이중 증류수에 재현탁된 후, 분리 깔때기에서 60mL의 에틸 아세테이트와 차례로 분배되었다. 혼합물을 격렬하게 흔들어 4°C에서 24시간 동안 상분리를 거쳤다. 수층은 수집되어 동열된 후 −80 °C에서 보관되어 추가 사용이 이루어졌습니다.

3. 비표적 LC-MS/MS 대사체학의 표준화된 워크플로우

  1. UHPLC-HRMS/MS 기반 비표적 대사체 분석
    비표적 대사체 프로파일링은 초고성능 액체 크로마토그래피-고해상도 탠덤 질량분석법(UHPLC-HRMS/MS) 플랫폼에서 수행되었습니다. 대사산물은 냉각된 메탄올-물 시스템을 이용해 빠르게 소환 및 추출되었습니다. 크로마토그래피 분리는 40°C에서 유지된 C18/T3 크로마토그래피 컬럼(100 × 2.1 mm, 1.8 μm)을 갖춘 UHPLC 시스템에서 달성되었습니다. 0–28분 동안 0.1% 개산을 물(A)과 0.1% 개양산(아세토니트릴)으로 구성된 이진 구배(0–28분)를 0.3 mL/min의 유량으로 적용했습니다. 질량분석법 검출은 극성 전환 가능한 완전 MS2(완전 MS/dd-MS2) 모드로 작동하는 하이브리드 쿼드러폴-오비트랩 기기에서 수행되었으며, 전체 스캔 범위는 m/z 70–1,050, 해상도는 120,000(FWHM, m/z 200)입니다. 고에너지 충돌 해리(HCD) 파편화는 20, 40, 60 eV에서 수행되었으며, 동적 배제는 10초로 설정되었다.
  2. 원시 데이터는 ProteoWizard를 사용해 mzXML 형식으로 변환되었습니다. 피크 피킹, 유지 시간 정렬, 탈동위소 처리는 HRMS 최적화 매개변수(ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6)를 사용하여 XCMS Online에서 수행되었습니다. 샘플 전체에서 50% 이상의 누락값을 가진 특징은 제외하고, 나머지 피크 영역은 총 이온 전류(TIC)로 정규화되었습니다. 대사산물은 자체 참조 라이브러리와 ≤ 5 ppm의 질량 오차 허용성과 ≥ 80점곱 점수 임계값을 사용하여 정확한 질량, MS2 스펙트럼, 보존 시간을 대조하여 주석을 작성했습니다.
    참고: 워크플로우 전반에 걸쳐 엄격한 표준 운영 절차가 준수되었습니다. 샘플은 채취 직후 액체 질소(−80 °C)에 급동되어 드라이아이스 체인으로 운반한 뒤, 무작위 추출, 주입, 배치 절차를 거쳐 처리되었습니다. 도구 드리프트를 모니터링하기 위해 10개 연구 샘플마다 통합 품질 관리(QC) 샘플을 삽입했습니다.

4. 네트워크 약리학 분석

  1. 활성 화합물의 네트워크 약리학 기반 스크리닝과 표적 예측
    Fructus Xanthii의 활성 성분은 TCMID 데이터베이스(https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php)와 HERB 데이터베이스(http://herb.ac.cn/)에서 수집되었습니다. 채취된 화합물들은 권장 ADME 기준인 경구 생체이용률≥30%)과 약물 유사성 ≥0.18에 따라 필터링되었습니다. 적격 화합물의 예측된 인간 표적은 두 데이터베이스에서 얻어졌습니다. 스크리닝 결과를 수집 및 정리하여 Fructus Xanthii와 관련된 15개의 활성 화합물과 151개의 고유 단백질 표적을 확인하였습니다.
  2. 전사체 데이터 통합 및 OA 관련 핵심 표적 식별
    정상 및 골관절염(OA) 샘플 사이의 연골 조직 내 차등 발현 유전자(DEGs)는 GEO2R 웹 도구(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)를 사용하여 GEO 데이터베이스 데이터셋 GSE51588(n = 5 정상, 6 OA)와 GSE169077(n = 10 정상, 40 OA)에서 추출하였다. OA 상향 조절 유전자는 log2 폴드 변화 >0.5와 조정 p-값 <0.05 기준을 사용하여 정의하였다. OA 상향 조절 유전자와 151개의 Fructus Xanthii 관련 단백질 표적 간의 교차는 R 패키지 ggvenn을 사용하여 시각화되었습니다. 교차 표적의 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크는 STRING 데이터베이스를 사용해 구축되었습니다(https://string-db.org/). PPI 네트워크 데이터는 Cytoscape에 가져와졌고, 상위 10개의 허브 유전자는 MCC 알고리즘이 포함된 CytoHubba 플러그인을 사용해 후속 기능 풍부 분석을 위해 선별되었습니다.

5. 제브라피시의 최대 허용 농도(MTC) 결정

수정 후 2일(2 dpf) 시점에 형질전환 제브라피시 유충(Tg col2a1a:EGFP)은 6웰 플레이트에 무작위로 분포되었으며, 웰당 30마리의 유충 밀도를 유지하였다. 각 웰에는 연속적으로 희석된 Fructus Xanthii 추출물이 포함된 3mL의 노출 배지를 보충했습니다. 죽거나 죽은 유충은 매일 제거되었습니다. 유충은 28°C에서 72시간 동안 연속 노출되었고, 이후 최대 허용 농도(MTC)가 유충 사망률이 10%를 넘지 않는 최고 농도로 결정되었습니다.

6. 제브라피시 골상 모델 확립

Tg col2a1a: 수정 2일째(2 dpf) 후 EGFP 제브라피시 유생은 대조군, 모델군, 콘드로이틴 황산(CS) 양성 대조군, 그리고 Fructus Xanthii 추출물 처리군의 네 그룹에 배정되었습니다. 대조군을 제외한 모든 그룹은 골 손상을 유도하기 위해 24시간 동안 황색포도상구균 (OD600 = 0.8, 1 ×10 8 CFU/mL)에 노출되었습니다. 성공적인 모델 구축은 후형형광 현미경 하에서 대조군에 비해 두개안면 부위의 연골 특이적 녹색 형광 강도가 최소 50% 감소함을 확인하여 확인되었습니다.

7. 제브라피시 유충의 연골 특이적 형광 정량 평가

유충들은 28°C에서 등급별 농도의 Fructus Xanthii 추출물 또는 1,000 μg/mL 콘드로이틴 황산나트륨(양성 대조군)에 72시간 동안 지속적으로 노출되었습니다. 이후 각 6웰 복제에서 무작위로 10마리의 유충을 선별했습니다(그룹당 n = 30마리). 선별된 유충은 0.016% 트리카인으로 마취하고 1% 저녹도의 아가로스 패드 위에 옆으로 배치했습니다. 형광 이미지는 형광 카메라가 장착된 입체현미경을 사용해 2× 배율(여기 488 nm, 방출 525/50 nm)으로 획득했습니다. 두개안면 부위의 연골 특이적 EGFP 강도, 특히 세라토히알과 메켈 연골은 영상 분석 소프트웨어를 사용해 정량화하였습니다. 통합 밀도 값에 대해 배경 보정이 수행되었고, 보정된 값은 연골보호 효과의 통계 분석을 위해 대조군에 정규화되었습니다.

8. C57BL/6J 마우스에서의 OA 유도

수컷 C57BL/6J 마우스(6–8주, 20–22g)는 특정 무병원체(SPF) 조건인 22°C ± 2°C에서 12시간의 밝고 어두운 주기를 가졌다. 쥐들은 1주일간 적응을 기다린 후 무작위 숫자표를 사용해 세 그룹(n=8명)으로 무작위로 배정되었습니다: (1) 가짜 조작 대조군, (2) ACLT 유발 골증(ACLT), (3) ACLT와 Fructus Xanthii 추출물 중재(ACLT + Fructus Xanthii 추출물). 모든 수술 절차는 이전에 검증된 프로토콜에 따라 멸균 환경에서 수행되었습니다.

쥐들은 기관에서 승인한 프로토콜에 따라 복막 내 펜토바르비탈나트륨(50 mg/kg)으로 마취를 받았고, 오른쪽 무릎 관절낭을 노출하기 위해 안쪽 슬개막 절개를 하였다. 전방 십자인대는 수술용 현미경으로 절단하여 관절 불안정을 유도한 후, 관절낭과 피부를 6-0 흡수성 봉합사로 층층으로 봉합하였습니다. 가짜 수술을 한 쥐들은 인대 절단 없이 동일한 관절 절개 수술을 받았다. 관절 안정성을 평가하고, 모델 그룹 쥐의 조직학적 절편에서 관절 손상 정도를 평가하거나 드로어 테스트를 수행하여 성공적인 모델 구축을 확인하였습니다.

수술 후 부프레노르핀(0.1 mg/kg, 피하 주사)을 3일 연속으로 투여하였다. 치료제는 하루에 한 번 가베지로 투여되었습니다. ACLT + Fructus Xanthii 추출 그룹은 1,000 μg/mL Fructus Xanthii 추출물 100 μL 중 100 μL을 일반 식염수에 희석하여 투여했으며, 나머지 두 그룹은 100 μL 정상 식염수 대조군을 투여했습니다. 수술 후 8주에 쥐들은CO2 질식사로 안락사시킨 후 경추 탈구를 시행했으며, 무릎 관절은 조직학적 분석을 위해 채취되었습니다.

9. 조직병리학적 염색

  1. 무릎 관절 조직의 조직학적 준비 및 염색
    수술 후 8주차에 수술한 무릎 관절을 일괄 절제하고, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 4°C에서 48시간 고정하였습니다. 고정 접합부는 10% 에틸렌디아미네테트라아세트산(EDTA; pH 7.4)에 14일간 탈석화되고, 등급별 에탄올 시리즈를 통해 탈수된 후 파라핀에 박혀 있습니다. 박힌 관절에서 5 μm 시상체 연속 시상 절편을 작성하였고, 다음과 같은 조직학적 염색 절차가 수행되었습니다.
    1. 헤마톡실린 및 이오신(H&E) 염색
      헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 통해 전반적인 조직 구조, 연골 완전성, 활막 과형성을 평가하였습니다.
    2. 사프라닌-O/패스트 그린 스테인
      연골 조직 내 프로테오글리칸을 검출하기 위해 Safranin-O/Fast Green 염색을 수행하였습니다. 염색된 부분은 디지털 카메라가 장착된 광학 현미경으로 검사되었고, 10× 및 20× 배율로 이미지를 촬영했습니다.
  2. OARSI 기반 연골 퇴행의 준정량 점수 측정
    연골 퇴행의 반정량적 평가를 위해, 염색된 절편들은 골관절염 연구 학회 국제 골관절염 연골 조직병리학 평가 시스템에 따라 사후 재평가 및 점수를 매겼으며, 이 시스템은 관절 연골 퇴행의 등급(0–6, 연골 손실 정도)과 단계(0–4; 손상의 공간적 분포)를 기준으로 연골 손상 심각도를 평가한다.
    모든 평가에 대해 사후 블라인딩 전략이 채택되었습니다. 모든 섹션은 원래 그룹 라벨을 제거하고 익명 일련번호로 재코딩되었습니다. 두 명의 경험 많은 병리학자가 그룹 배정 사실을 알지 못한 채 독립적으로 절면을 채점했습니다. 두 채점 결과 그룹 간에 교차 검증이 수행되었습니다. 점수 차이가 ≥1일 때, 두 병리학자가 불균형한 절편들을 공동으로 재평가하여 합의 점수를 수립하였습니다. 최종 합의 점수는 조직병리학적 결과의 객관성, 견고성, 재현성을 보장하기 위해 후속 통계 분석에 사용되었습니다.

10. RNA 시퀀싱(RNA-seq)

1차 인간 관절 연골 세포(통로 2–3)는 6웰 플레이트에 5× 105 세포 밀도로 시딩되었습니다. 세포들은 24시간 동안 혈청 결핍을 시킨 후 두 그룹(n=3명)으로 배정되었습니다: (1) 대조군: 세포는 매체만 사용했습니다(0.1% DMSO); (2) 프룩투스 잔티이 추출물군: 세포는 DMSO에 용해된 1,000 μg/mL 프룩투스 잔티이 추출물로 처리되었습니다.
세포들은 24시간 동안 처리된 후, 제조사 프로토콜에 따라 TRIzol 시약을 사용해 총 RNA를 추출했습니다. RNA 무결성(RIN ≥7.0)과 농도는 RNA 분석기를 사용해 평가하였습니다. 가닥 특이적 cDNA 라이브러리는 RNA 시퀀싱 라이브러리 준비 키트를 사용해 준비하고, 고처리량 차세대 시퀀싱(NGS) 플랫폼에서 쌍말 150 bp(PE150) 모드로 시퀀싱되었습니다. 원시 FASTQ 파일의 품질 관리는 FastQC를 사용했고, 이후 어댑터와 Trimmomatic을 이용한 품질 트리밍이 이루어졌으며, 이후 후속 분석에 나섰습니다.

11. RNA-seq 데이터 처리

Fructus Xanthii 추출물에 의해 하향 발현된 유전자(대조군 대 p < 0.05와 logFC< −0.5)는 RNA-seq 데이터셋에서 추출되어 상위 10개의 허브 타깃과 교차하였습니다. Fructus Xanthii 추출물과 골관절염과 관련된 핵심 표적은 ggvenn 패키지를 사용하여 시각화하였습니다.

12. 엘리사

2–3 통로의 일차 인간 관절 연골 세포는 6웰 플레이트에 5× 105 세포 밀도로 시딩되었습니다. 세포는 혈청 없는 배지에서 24시간 동안 배양하여 정지 상태를 유도했다. 셀들은 이후 다음 세 그룹으로 나뉘었으며(각 그룹당 n = 3개):
(1) 빈 대조군: 세포는 유체체(0.1% DMSO)만 처리; (2) 양성 대조군: IL-1β로 세포 염증을 유도한 후 매체(0.1% DMSO)로 치료; (3) 프룩투스 잔티이 추출물군: IL-1β로 세포 염증을 유도한 후 0.1% DMSO에 용해된 1000 μg/mL 프룩투스 잔티이 추출물로 처리하였다. 세포 배양 상청액은 24시간 배양 후 수집하여 −80 °C에서 보관하다가 사용했습니다. 배양 상청액 내 MMP1과 PGR 농도는 각각 인간 MMP1과 PGR에 특이적인 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA) 키트를 사용하여 측정하였습니다. 분석은 제조사의 지침에 따라 수행되었습니다.

13. 통계 분석

모든 통계 분석은 통계 분석 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며, 데이터는 표준편차(SD)± 평균으로 제시되었습니다. 데이터 정규성은 샤피로-윌크 검정을 사용해 평가했으며, 동등분포성은 레벤 검정으로 평가하였다. 그룹 간 비교는 일방향 또는 양방향 분산분석(ANOVA)을 사용하여 수행되었으며, 필요에 따라 투키(Tukey) 또는 시닥(Šidák) 사후 검정을 시행하였습니다. 쌍별 비교는 양측 학생 t-검정을 사용해 수행되었습니다. 비모수 데이터는 Mann–Whitney U 검정을 사용하여 분석되었습니다. 양측 P-값 0.05< 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

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결과

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비표적 LC-MS/MS 데이터의 품질 평가 및 대사 지형

QC 샘플은 양 및 음 이온 모드에서 매우 중복되는 TIC 크로마토그램으로 우수한 재현성을 보였으며, 전체 분석 배치 동안 보존 시간 드리프트가 0.05분 미만으로 유지되었습니다. 원시 데이터는 XCMS 기반 전처리를 거쳐 피크 탐지, 통합, 보존 시간 정렬을 포함했습니다. 추정되는 대사산물은 정확한 질량(≤5 ppm), 동위원소 패턴, 고품질 MS/MS 스펙트럼을 내부 스펙트럼 라이브러리와 대조하여 주석을 달았습니다. 엄격한 필터링과 TIC 정규화 후, 양이온 모드와 음이온 모드에 대해 각각 2,179개와 1,291개의 신뢰할 만한 특징을 유지하여 이후 화학계량 분석을 위한 정량적 행렬을 형성했습니다.

프룩투스 잔티이 추출물의 화학 조성

식물화학적...

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토론

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OA는 전 세계적으로 흔한 퇴행성 관절 질환이자 장애의 주요 원인입니다. 발병 기전은 복잡하고 다요인적이며, 관절 조직 전반에 걸쳐 생화학적, 세포적, 분자적 변화가 포함됩니다. 한때 관절 연골의 단순한 '마모와 손상' 현상으로 여겨졌으나, OA는 현재 연골 손상, 활막 염증, 골 형성, 연골하 뼈 재형성을 특징으로 하는 만성 전관절 질환으로 널리 인식되고 있습니다 37,38,39. 점점 더 많은 증거는 골관절염 병태생리에서 염증의 중심적 역할을 강조하며, 놀이막, 연골, 연골하뼈에서 생성되는 염증 매개체가 연골 분해와 밀접하게 연관되어 있음을 강조합니다40,41

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공개 사항

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저자들은 본 논문에서 보도된 연구에 영향을 미칠 수 있는 알려진 경쟁 재정적 이해관계나 개인적 관계가 없다고 선언한다.

감사의 글

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이 연구는 산둥성 자연기금 표면 프로젝트 보조금(번호: ZR2024MH088), 산둥성 전통 중의학 기술 프로젝트(번호 2020M070), 산둥 제1 부속병원 및 산둥성 천불산병원 재배기금(보조금) QYPY2022NSFC0601)".

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4% PFA바이오샤프, 중국BL539ApH 7.4, 멸균
C57BL/6 마우스중국의 중요한 강수 생물 동물 기술 유한 회사N/A남성, 8-10주령, 20-25g
콘드로이틴 설페이트MCE, 미국HY-B2162순도 ≥98%
ClusterProfiler (R 패키지)바이오 컨덕터무료 접근R v4.2.2에 통합
콜라겐 분해 효소, 제2유형, 분말Gibco, 미국17101015≥125 U/mg
사이토스케이프사이토스케이프 컨소시엄무료 접근 (https://cytoscape.org/)v3.9.1 (CytoHubba 포함)
사이토스케이프사이토스케이프 컨소시엄무료 접근버전 3.9.1
DESeq2 (R 패키지)바이오 컨덕터무료 접근R v4.2.2에 통합
DMEM, 고 포도당Gibco, 미국11965092멸균 매체
에탄올중국의 시노파름 화학 시약 유한 회사10009218분석 등급, 95%
에틸 아세테이트중국의 시노파름 화학 시약 유한 회사10009418분석 등급
태아 우태 혈청 (FBS)셀맥스, 중국SA102.02열 비활성화
형광 현미경일본의 니콘Eclipse Ti2-UGFP 필터(488nm 각인) 및 디지털 카메라 장착
GEO 데이터베이스NCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2rGEO2R 분석 도구
그래프패드 프리즘GraphPad Software, LLC, 미국상업용버전 9.5.1
헤마톡실린-에오신(HE) 염색 키트중국의 솔라비오G1120바로 사용 가능한 키트
HERB 데이터베이스중국 과학원http://herb.ac.cn/V2.0
인간 MMP-1 ELISA 키트중국의 야메이 생명공학HJ088인간용, 96웰 플레이트
인간 프로제스테론 수용체(PR) ELISA 키트중국의 상하이 효소 연계 생명공학 유한 회사ml05997인간용, 96웰 플레이트
이미지J국립 보건 연구소(NIH)무료 접근버전 1.53t
광학 현미경일본의 올림푸스BX5310×/20× 목적 및 디지털 카메라
동결 건조기독일의 크리스트알파 1-4 LDplus동결 건조 시스템
수정된 사프란-O 및 빠른 그린 염색 키트중국의 솔라비오G1371뼈/연골 염색용
중성 발샘중국의 솔라비오G8590장착 매체
페니실린-스트렙토마이신Gibco, 미국15070063100×, 멸균
인산 완충액(PBS)중국의 스파크제이드CR0013-500MLpH 7.2-7.4, 멸균
R 소프트웨어통계 컴퓨팅을 위한 R 재단무료 접근 (https://www.r-project.org/)v4.4.1 (ggvenn 포함)
혈청 무 세포 동결 매체중국의 바이오샤프BL203B멸균
포도상구균미국 유형 문화 수집(ATCC)ATCC 25923표준 균주
STRING 데이터베이스STRING 컨소시엄https://string-db.org/단백질 상호작용 분석
TCMID 데이터베이스산시 친링 치야오 협력 혁신 센터https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.phpV3.0
Tg(col2a1a:EGFP) 제브라피쉬제브라피쉬 국제 자원 센터(ZIRC)N/A유충(2 dpf), AB 균주
TRIzol 시약써모 피셔, 미국15596018CN총 RNA 추출용
트립신-EDTA (0.25%), 페놀 레드Gibco, 미국25200056멸균 용액
초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)써모 피셔, 미국Q Exactive FocusHRMS/MS와 연결
XCMS-온라인

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RNAELISA

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