천골 및 말초 신경 자극이 방광 기능에 미치는 영향 평가를 위한 쥐 동물 모델

요약

이 프로토콜은 마취된 쥐에서 천골, 경골, 비골신경을 자극하는 상세한 외과적 기법을 설명합니다. 이 모델들은 방광 기능에 미치는 신경조절 효과 조사를 가능하게 하며, 최적의 자극 매개변수를 결정하는 데 도움을 주며, 천골 및 말초 신경 자극 치료의 작용 기전 연구를 가능하게 합니다.

초록

신경조절은 다양한 장기의 기능 장애를 치료하는 치료법으로, 하부 요로 기능 장애 치료에 효과적임이 입증되었습니다. 임상적 성공에도 불구하고, 신경조절의 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았으며, 표준화되고 재현 가능한 동물 모델의 필요성을 강조하고 있습니다. 천골 및 말초 신경 자극을 이용한 요광 신경조절의 전임상 모델이 20년 이상 확립되어 왔으며; 그러나 기존 문헌은 수술 절차에 관한 방법론적 세부 정보를 제한적으로 제공합니다. 이 글은 천골신경 자극을 위한 잘 확립된 기법에 대한 상세한 설명과 시각적 표현을 제공합니다. 또한 경골 신경 자극에 대한 수정된 접근법을 설명하고, 쥐 모델에서 비골 신경 자극을 이용한 새로운 방광 신경조절 방법을 소개합니다. 수정된 경골신경 자극 접근법은 이전 연구에서 설명한 내측 발목이 아닌 좌골신경의 한 가지인 경골신경을 기원에서 노출하고 자극하는 방식을 포함합니다. 최근 임상 실무에서 방광 신경조절을 위한 비골신경 자극이 도입된 점을 고려하여, 본 글은 하부 요로 기능 조절에 있어 그 메커니즘을 조사하기 위한 독특한 쥐 모델을 제안합니다. 세 가지 신경조절 방법 모두에 대한 단계별 지침이 신경 노출, 전극 배치, 그리고 특성 운동 반응에 기반한 성공적인 전극 배치 검증에 관한 지침을 제시합니다. 비골신경 자극이 방광 기능에 미치는 영향을 대표적인 예로 제시하여 아세트산에 의한 방광 과활성화 모델의 적용 가능성을 입증합니다. 이 글은 방광 감각 신호 전달, 척추 및 척추 상부 조절 경로의 변화, 자극 매개변수 최적화, 다양한 자극 표적의 효능 비교를 포함한 신경조절 메커니즘을 연구하기 위한 표준화되고 기술적으로 접근 가능한 프로토콜을 제시합니다.

서론

신경조절은 저진폭의 전기 자극을 사용하여 말단 기관의 기능을 변화^{시킵니다.} 과활성 방광 증후군(OAB), 비폐쇄성 요정, 신경성 방광, 방광 통증 증후군과 같은 하부 요로 기능 장애의 맥락에서, 신경조절은 행동 치료 및 약물치료에 실패한 환자들에게 3차 치료법으로 사용됩니다^. 과민성 정착성 과민성 과잉(OAB) 환자의 신경조절을 위해 후경골신경 자극과 천골신경 자극(SNS)이 임상 실무에서 널리 사용되고 있습니다. 음부신경과 비골신경을 포함한 추가 말초 신경을 겨냥한 실험적 신경조절 접근법이 연구되고 있습니다.

신경조절은 수십 년간 방광 및 장 질환 치료에 사용되어 왔지만, 그 작용 기전은 완전히 밝혀지지 않았습니다. 다학제 전문가 그룹 검토에서 밝힌 바와 같이, 현재 사용 중인 자극 매개변수는 대부분 제조업체가 시행착오 방식을 통해 선택했습니다⁷. 따라서 동물 모델을 계속 활용하여 근본 경로를 밝히고 자극 매개변수를 최적화하여 치료 효과를 개선하는 것이 중요합니다. 깨어 있거나 마취된 동물(쥐, 양, 개, 고양이 등)을 대상으로 한 여러 전임상 실험이 수행^{되었습니다.} 전 세계적으로 윤리 지침과 연구 정책이 덜 복잡하고 작은 종의 사용을 장려함에 따라, 설치류 모델이 최근 몇 년간 가장 자주 사용되고 있습니다.

방광 기능 장애 쥐 모델에서 SNS는 주로 두 가지 방법론적 접근법을 사용해 왔습니다. 첫 번째는 Zvara 등이 설명한 것으로, 혈관카테터 또는 척추^바늘을 사용해 천골공에 자극 전극을 삽입하는 것입니다. 두 번째 방법은 L6 신경근을 노출시키고 자극 전극을 L6 신경 아래에 위치시키며, 전극과 신경⁹ 사이의 접촉을 고정하기 위해 실리콘 접착제를 사용하는 것입니다. 천골공에 전극을 삽입하는 기술은 임상적 접근법과 유사합니다. L6 근을 노출시키는 방법은 기술적으로 어렵지만, 정밀한 위치 지정과 신경에 대한 더 일관된 접근을 제공합니다.

후경골 신경 자극을 모방하는 쥐 동물 모델이 문헌에서 보고되었습니다. 가장 자주 사용되는 방법은 발목 위 뒷다리 내측 경골신경을 외과적으로 노출시키는 것입니다 10,11,12,13,14,15,16. 또 다른 방법은 경골신경^근처에 바늘 전극을 경피적으로 삽입하는 것입니다. 이 글은 경골신경 자극의 기원, 즉 대둔근과 대퇴이두근 사이에서 좌골신경이 경골신경, 일반 비골신경, 설골신경 세 가지로 분열되는 부분에 대해 상세히 설명하는 것을 목표로 합니다. 또한, 본 연구는 새로운 신경조절 방법을 연구하기 위한 새로운 동물 모델로서 비골신경 자극을 도입했습니다. 이 쥐 모델의 번역적 관련성은 최근 방광 신경조절을 위한 비골신경 자극의 임상적 도입으로 뒷받침된다^18,19.

프로토콜

동물들은 기관 지침에 따라 남덴마크 대학교 동물 돌봄 시설에 수용되었습니다. 모든 동물 실험은 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 지침에 따라 수행되었습니다. 덴마크 동물실험 감독관 윤리위원회는 연구 절차를 승인했습니다(프로토콜 번호 2022-15-0201-01158). 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 전극 준비

참고: 경골, 비골, L6 신경 자극에는^양극성 갈고리 모양 전극이 사용되었습니다. 다음 단계들은 전극 설계와 제작에 대한 간략한 설명을 제공합니다.

1. 125 μm 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 코팅된 은선 두 개를 자르고 서로 꼬아줍니다.
2. 와이어 한쪽 끝에서 PTFE 4–5mm를 떼어내고, 노출된 끝을 고르게 다듬은 뒤, 끝을 23G 바늘 위로 위로 구부려 2mm 간격으로 평행한 두 개의 후크를 만듭니다.
3. 전극을 플레이트에 고정하고 훅을 위를 향하게 하여 플레이트 가장자리 위로 뻗어 놓으세요.
4. 2성분 실리콘 접착제를 5초간 섞으세요. 갈고리에서 1–2mm 떨어진 곳에 한 방울을 떨어뜨리고 약 5분간 말리게 하세요.
5. 전극 반대편에서 PTFE 코팅 1–2cm 길이의 구간을 떼어내어 자극기와 연결됩니다.

2. 동물 조리

참고: 멸균 상태에서, PE-50 카테터는 열로 인해 끝이 벌어진 상태로 암컷 스프래그-도울리 쥐(250–300g)의 방광 돔에 삽입하고 가방 끈 봉합사로 고정했습니다. 튜브의 원위 끝은 동물의 등에서 밖으로 나와 피하 주머니²¹에 감겼다. 수술 후 방광이 회복할 시간을 5일간 유지했습니다.

1. 동물을 우레탄(1.5g/kg, 복강 내 투여)으로 마취하세요(기관에서 승인한 프로토콜에 따라). 우레탄을 실험 시작 약 2시간 전, 15분 간격으로 세 번에 나누어 투여합니다.
2. 동물을 온열 패드 위에 옮기고 엎드린 자세로 눕히세요.
3. 경골 및 비골신경 자극을 위해서는 쥐의 허벅지 주변과 등 하반부를 면도하세요. 꼬리와 5mL 주사기를 쥐의 왼쪽 뒷다리 아래에 놓고 그림1A에 보이는 대로 꼬리와 다리를 고정합니다.
4. SNS의 경우, 쥐의 꼬리부터 흉추까지 등을 밀고, 복부 아래에 50mL 원심분리관을 넣어 요추와 천골 부위를 높입니다.
   참고: 모든 신경자극 실험은 생존 절차가 아닌 절차를 의미합니다. 깨끗한 수술 기법을 사용하세요.

3. 비골신경 및 경골신경 박리 및 전극 이식

1. 메스를 사용해 무릎 관절과 좌골결절 사이 중앙에 3–3.5cm 절개를 하세요(그림 1B).
2. 가위를 피부 밑으로 밀어 넣고 결합 조직을 자르면서 피부를 근육에서 분리하세요.
3. 견인기를 사용해 피부를 벌리고 대둔근과 대퇴이두근을 연결하는 근막을 노출시킵니다(그림 1C).
4. 직선 가위로 근막을 자르고 대퇴근과 대퇴이두근 사이의 공간을 절단하여 좌골신경이 시각화될 때까지 합니다(그림 1D, E).
5. 좌골신경과 그 가지인 경골신경, 비골신경, 설문신경을 잘 노출시키기 위해 대퇴이두근에 견인기를 재배치합니다(그림 2A). 이 맥락에서 "비골신경"은 심부 및 표재 비골 신경으로 분열되기 전의 일반 비골신경을 의미합니다. 경골신경이 가장 큰 가지이며; 설문신경이 가장 작고 비골신경은 중간 직경을 가집니다.
6. 굽은 겸자와 마이크로 가위를 사용해 주변 결합 조직에서 비골신경을 분리합니다. 그 후 마이크로포세프를 사용해 양쪽과 그 아래쪽 조직을 조심스럽게 펴 5mm 길이의 신경 단편을 분리합니다. 경골신경 자극을 위해 경골신경에 같은 절차를 반복합니다(그림 2B).
   참고: 겸자로 신경을 집어 들면서 신경을 압박하지 않도록 하고, 신경을 당기는 힘은 최소화하세요.
7. 메스로 등 하반부에 5mm 길이의 절개를 하고, 절개 부위를 통해 피부 밑에 지혈 고정기를 넣어 피하 채널을 만듭니다. 지혈기 끝이 뒷다리 절개 부위에서 나올 때까지 조심스럽게 전진시킵니다(그림 2C).
8. 지혈기를 사용해 전극의 풀린 끝을 잡고 등 하반부 절개 부위를 통해 천천히 기구를 빼냅니다. 두 개의 겸자를 사용해 전극의 다른 쪽 끝(갈고리 끝)을 피하면에 대해 90° 각도로 구부리고, 전극의 후크가 신경(비골 또는 경골)에 인접하고 수직으로 위치하도록 합니다(그림 2D).
   참고: 전극의 적절한 위치는 신경이 늘어나지 않도록 하는 것이 중요합니다.
9. 곡선형 마이크로 겸자를 사용해 신경을 들어 올리고 전극의 후크를 신경 아래로 밀어 넣으세요. 2성분 실리콘 접착제를 5초간 섞고, 면봉으로 신경을 말린 후 후크와 신경 인접 부위를 충분히 덮을 만큼 접착제를 발라(그림 2E–G).
   참고: 접착제를 바르기 전에 전극을 자극기에 연결하고, 운동 임계값 수준에서 신경을 자극하여 전극의 올바른 위치를 확인하세요. 모터 임계값은 일관된 위상 발 움직임을 유도하는 최소 전압으로 결정되었습니다. 비골신경 자극은 발의 위상 배측 굴곡을 일으키는 반면, 경골 신경 자극은 족저 굴곡을 생성합니다. 자극에 대한 운동 반응이 없을 때는 자극기와 전극 사이의 연결을 점검하세요.
10. 등 절개 부위의 결합 조직에 5-0 나일론 스테이 실을 넣고, 양쪽 끝을 충분히 길게 남겨둡니다. 이 끝들은 전극을 고정하여 안정적인 위치 확보를 위해 사용됩니다.
11. 4-0 비크릴 봉합사로 뒷다리 절개 부위의 피부를 봉합하세요.

4. L6 신경 노출 및 전극 이식

1. 메스를 사용해 요추 부위와 천골 위에 4–5cm 중앙선 절개를 하세요. 절개 부위를 열기 위해 인인기를 놓고, 그 아래 등 근육과 척추 돌기의 끝을 노출시킵니다(그림 3A).
2. 장골능선을 촉진하여 L6의 가시 돌기를 찾는 기준으로 삼으세요. 이는 장골능선 바로 아래에 위치한 첫 번째 가시 돌기로 식별할 수 있습니다(그림 3B).
3. 가위를 사용해 L5부터 S2까지 척추 위에 있는 근막을 제거하세요. 그 후 척추 주변 근육을 양쪽으로 신중하게 분리하여 척추 돌기, 층, 관절 돌기를 노출시킵니다. 남은 결합 조직과 근육을 미세 가위로 제거하여 뼈 구조가 명확히 보일 때까지 제거하세요(그림 4A,B).
   참고: 이로 인해 해부학적 창이 형성되어 랜드마크를 노출시키고 L6 신경 줄기에 접근할 수 있게 됩니다. L6의 후관절을 확인하라; L6 신경줄기는 이 관절의 후쪽을 따라 흐릅니다. 또한 천골과 천장관절을 확인하세요. L6 신경줄기는 이 관절의 꼬리와 내측을 따라 흐릅니다(그림 4B).
4. 롱저를 사용해 S1의 가시돌기를 조심스럽게 제거하고, S1과 S2 척추 사이 부위의 천골 조각을 점차 부러뜨려 L6 신경줄기를 노출시킵니다(그림 4C).
5. L6 신경을 주변 조직에서 구부린 겸자와 미세 가위로 분리하세요. 신경을 양극성 PTFE 코팅 은선 전극에 연결하고, 생체 적합성 실리콘 접착제를 사용해 주변 조직과 분리하는 것입니다. 이는 3.9단계(그림 4D)에 설명된 것입니다.
   참고: L6 신경 자극은 골반저 근육 수축과 꼬리 경련을 유발합니다.
6. 양측 신경 자극을 위해 반대쪽에서도 같은 절차를 반복하세요.
7. 4-0 비크릴 봉합사로 피부를 봉합하세요.

5. 천골공에 자극 전극 삽입

1. 메스를 사용해 천골 위의 중간 절개를 하고, 견인기를 사용해 절개 부위를 열고 기저의 등 근육을 노출시키세요.
   참고: 4.2단계에서 언급한 장골능선을 촉진하여 L6/S1 랜드마크를 찾으세요.
2. 둔한 해리를 사용해 척추 주근과 가시 돌기들을 분리합니다. 가시돌기를 근육에 다시 위치시켜 가시돌기를 노출시키고 S1 천골공에 접근하기 쉽게 합니다(그림 5A).
3. S1 척추돌기의 꼬리와 외측에 위치한 S1 공의 위치를 확인한다. 단극 전극이 미리 장착된 18게이지 바늘로 S1 천골공을 탐침합니다(그림 5B).
   참고: 180 μm PTFE 코팅 스테인리스강 와이어를 사용하며, 양 끝에서 5mm 두께의 절연체가 제거되어 있습니다.
4. 바늘 끝을 S1 공에 위치시키고, 척추와 평행하게 유지하며 동물의 등에 대해 약 30° 각도로 맞춥니다. 와이어를 신경 경로를 따라 부드럽게 앞으로 밀면서 바늘을 천천히 빼세요. 양측 자극을 위해 반대쪽 S1 공에도 같은 절차를 반복하세요.
   참고: 전극의 올바른 위치를 확인하려면 전선의 먼 끝을 자극기에 연결하세요. 전기 자극은 꼬리 움직임을 유발합니다.
5. 5-0 비크릴 봉합선(그림 5C)을 사용해 인접한 가시 돌기(L6)에 와이어를 고정합니다.
6. 메스로 목 뒤쪽에 1cm 절개를 하고, 목 뒤쪽 절개부에서 천골 절개 부위까지 지혈고정기를 이용해 피하 터널을 만듭니다.
7. 와이어의 끝을 터널을 통과시키고 목 뒤쪽에서 외부로 처리하세요(그림 5D).
8. 4-0 비크릴 봉합사를 사용해 천골 부위의 근막과 천골 부위의 피부, 그리고 목 뒤쪽 피부도 봉합합니다.

6. 방광 측정 기록

1. 5일 후, 자극 실험을 수행하기 전에 PE-50 튜빙을 외부로 분리하여 압력 변환기와 주입 펌프에 연결합니다.
2. 방광을 3 mL/h 속도로 2시간 동안 지속적으로 주입하여 방광 수치를 안정화하세요.
3. 단일 소변 주기 동안 방광 주입을 사용하여 기초 압력, 역치 압력, 방광 순응성, 소변 압력, 방광 용량 등 기초 압력, 역치 압력, 방광 용량 등 방광 측정 매개변수를 평가^합니다.
4. 각 실험이 끝나면, 윤리 기준을 준수하여 마취 과다복용으로 동물을 안락사시킨다.

결과

신경조절이 하부 요로 기능에 미치는 영향을 평가하는 실험 설계를 입증하기 위해, 0.5% 아세트산 주입에 의해 유발된 방광 과활성화를 쥐 모델에 비골신경 자극을 적용한 연구를 제시합니다. 방광 기능은 자극 전, 중, 후에 단일 소변 주기 방광측정법을 사용하여 기록되었습니다(그림 6 A,B). 실험 구성에는 이상 자극 파형을 사용한 두 가지 다른 비골신경 자극 지속 시간이 포함되었으며, 주파수는 10 Hz, 펄스 지속 시간은 0.2 ms, 자극 강도는 운동 임계값의 3배(1.2–3 V)였습니다.

비골신경의 성공적인 자극은 자극 기간 내내 뒷발의 위상 등쪽 굽힘을 통해 확인되었습니다.

비골신경 자극은 소변 패턴에 뚜렷한 변화를 유도했으며, 자극 중과 후 방광 용량 감소를 포함합니다. 1시간 동안 지속된 자극 시 분뇨압이 증가했으며, 단기(10분) 자극...

토론

이 글은 마취된 쥐에서 천골, 경골, 비골신경 자극을 위한 전극 이식 수술법에 대한 상세한 설명을 제공합니다.

S3 천골신경을 지속적으로 저진폭으로 자극하기 위해 천골공에 납전극을 이식하는 것은 하부 요로(LUT) 기능 장애와 대변 실금 치료에 널리 인정되는 방법입니다. 환자의 경우 전극은 일반적으로 S3 공에 삽입되어 미엘린과 비미엘린 축삭의 혼합을 표적으로 합니다²². 이 위치는 쥐의 척수의 L6–S1 구간에 해당합니다. 쥐의 목표 신경을 정확히 찾는 것은 도전적입니다. 이는 명확한 시각적 가이드와 신경자극을 이용한 상세한 단계별 프로토콜의 필요성을 강조하며, 이를 통해 목표 신경의 자극을 확인하기 위해 운동 반응을 유도합니다.

쥐를 대상으로 경골신경 자극을 사용한 연구에서는 다리 내측 발목 위 신경 절제와 자극 또는 바늘 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
18 G 일회용 주사바늘	KRUUSE	121282
Dumont forceps style 5TM	DUMONT	1708-5TM-PO	곡선형
Dumont forceps style 7XL	DUMONT	0508-7XL-PO	곡선형
Grass SD9 스퀘어 펄스 자극기	Somatco	1077/183
혈관 클램프	Fine Science Tools/Teleflex	13018-14/PO181059	≥ 14 cm, 미세 팁
아이리스 가위	World Precision Instruments	14218	직선 가위
Kwik-Sil 실리콘 엘라스토머	World Precision Instruments	KWIK-SIL	2성분 접착제
마이크로 애드슨 포스셉스	World Precision Instruments	501245
마이크로 가위	S&T	SAC-15 R-8	곡선형 팁 ≤ 10mm 길이
NaCl 0.9% 100 mL	B.Braun	N/A
PE-50 튜빙	Instech	BTPE-50
프로린 5-0 스테이플	Ethicon	EH7257
로농거	George Tiemann & Co	160-424-08	미세 곡선 팁
외과용 스칼펠	Swann-Morton	0505
유레탄	Sigma-Aldrich	U2500
비크릴 4-0 스테이플	Ethicon	V451
비크릴 5-0 스테이플	Ethicon	V303
와이어 실버 테플론 코팅 0.125 mm	World Precision Instruments	AGT0525
와이어 스테인리스 스틸 테플론 코팅 0.18 mm	World Precision Instruments	SST30407-50