벡스-플렉스는 단백질 마커와 리보핵산 전사체를 동시에 시각화하여 온전한 조직의 심층 공간 프로파일링을 가능하게 합니다

요약

여기서는 고해상도 공간 프로파일링 응용을 위한 고해상도 공간 프로파일링 응용을 위해 복원 단백질 염색(IBEX)과 RNAscope in situ 하이브리다이제이션 기술을 결합하여 심층 표현형을 분석하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

여기서는 온전한 조직에서 단일 세포 해상도로 단백질과 리보핵산(RNA) 마커의 동시 공간 프로파일링을 가능하게 하는 프로토콜을 제시합니다. 고형암을 둘러싼 핵심 문제 중 하나는 치료적 개입에 대한 환자의 반응성을 예측할 수 없다는 점입니다. 이러한 복잡성을 해독하려면 온전한 조직 내 세포 행동, 상호작용, 표현형을 정량적으로 측정해야 합니다. 구체적으로, 프로테옴과 전사체는 중복되지 않지만 중복되지 않는 정보를 제공하여 합리적인 면역치료법 설계에 매우 중요할 수 있습니다. 그러나 현재로서는 종양 미세환경 내 모든 세포의 전사 및 기능 상태를 심층적으로 프로파일링하면서 중요한 공간 위치 정보를 유지하는 직관적이고 비용 효율적인 방법이 없습니다. 이를 위해 IBEX(반복 표백 확장 다중화) 플랫폼과 HiPlex RNAscope를 성공적으로 결합하여 고플렉스 단백질 마커와 고플렉스 리보핵산(RNA) 전사체를 단일 세포 해상도로 동시에 시각화하였습니다. 이 접근법은 핵 형태를 보존하고 주기 전반에 걸쳐 정확한 이미지 정렬을 가능하게 하기 위해 수정된 RNA 표적 회수 단계를 포함합니다. "Bex-Plex"는 고정된 냉동 조직에 수정되지 않은 IBEX 프로토콜을 수행한 후 수정된 RNA 표적 회상을 사용하여 IBEX 사이클과 핵 수준의 정렬을 보장하는 HiPlex RNAscope 프로토콜을 수행할 수 있게 합니다. 이 프로토콜은 고정된 냉동 조직에 최적화되어 있으며, 전사 및 기능적 세포 상태의 통합 공간 분석을 가능하게 합니다. 단일 세포 수준에서의 프로파일링 능력은 조직 자체에 대한 깊은 정보를 제공할 뿐만 아니라, 치료 반응성을 이끄는 미묘한 세포 상호작용에 대한 예측을 강화하여 종양 미세환경 및 관련 시스템에서 공간 생물학을 연구하는 틀을 제공합니다.

서론

2011년 도입 이후, PDL-1과 CTLA-4와 같은 억제성 면역 체크포인트 분자를 차단하여 세포독성 T 세포 억제를 줄이는 암 면역치료제가 고형종양 치료의 골드 스탠다드로 부상했습니다^. 그러나 환자에게 대규모 사용이 있음에도 불구하고, 많은 고형 종양암이 본질적으로 내성을 보이거나 결국 내성을 발생시키기 때문에 이 약물들의 임상 효과는 매우 다양합니다². 많은 경우 이는 같은³형 암 사이에서도 고형종양이 매우 이질적이기 때문입니다. 고형 종양에서 발생하는 세포 관계에 대한 더 심층적인 이해가 개선된 치료 방식을 만드는 데 핵심입니다. 따라서 이 저항성을 유지하고 유지하는 정확한 메커니즘과 상호작용을 규명하는 것이 암 연구의 최전선에 있습니다. 여기서는 온전한 조직 내 단백질과 RNA 발현을 통합적으로 공간적으로 분석하여 이러한 복잡한 세포 상호작용을 더 잘 특성화할 수 있는 방법을 개발하는 것을 목표로 합니다.

종양 미세환경(TME)은 종양 성장과 면역 반응을 형성하는 비암성 세포 및 구조 요소들로 구성되며, 여기에는 암 관련 섬유아세포, 침윤 면역 세포, 혈관 구성 요소, 그리고 세포외 기질⁴가 포함됩니다. 최근에는 TME의 구성과 조직이 종양이 면역 침윤에 허용적인지 내성인지에 강한 영향을 미치며, 이는^{면역치료에} 대한 반응성을 결정하는 주요 요인 중 하나임이 분명해졌습니다. 많은 암에서 T 세포 수가 적고 면역억제 성향의 골수질 집단이 존재하는 '면역 사막' 표현형이 체크포인트 차단 요법에 대한 반응성 저하와 상관관계가 있습니다 ^6,7. 케모카인 신호전달은 이러한 모집 역학의 많은 부분을 지배합니다. 예를 들어, CXCL1과 CCL2는 면역억제성 골수세포를 끌어들이고, CXCR3-CXCL9/CXCl10 축은 세포독성 및 조절성 T 세포를 종양⁸에 모집합니다. 따라서 지위별 신호 전달 환경은 세포 표현형과 기능에 강력한 영향을 미칠 수 있습니다. 예를 들어, 대장암 환자에서 CCL5-CCR5 축은 종양 관련 대식세포(TAM)의 억제 기능을 조절하며, 이 신호를 차단하면 TAM이 항종양 형성 표현형 쪽으로 기울어져 임상 반응 개선과 연관됩니다⁹. 더 나아가, 면역 세포, 암 관련 섬유아세포, 그리고 종양 세포 간의 ICAM 및 PDL-1을 통한 직접적인 상호작용은 면역 고갈을 유도하고 항종양 면역을 둔화시킬 수 있습니다¹⁰. 이 결과들은 TME가 치료 효능에 미치는 영향을 이해하기 위해 공간적으로 분해된 분석의 중요성을 강조합니다.

면역형광(IF) 영상은 조직 내 단백질 발현과 세포 간 상호작용을 시각화하는 기초 접근법으로 남아 있습니다. 이 분야는 기존의 3-4색 IF에서 반복적인 염색과 이미징에 의존하는 고함량 영상 워크플로우로 발전했습니다. 이 방법들에서는 항체 표지, 영상 촬영, 형광체 비활성화 또는 제거를 반복적으로 수행하여 대규모 데이터셋을 생성하여 추가 마커를 염색하고 영상화할 수 있도록 합니다¹¹. Iterative Bleaching Extends Multiplexity(IBEX)는 최근 사용자 친화적이고 비용 효율적인 반복 영상 플랫폼으로 도입되었습니다.¹². 상업용 항체 및 기존 현미경 사용과 호환되어, IBEX는 주로 사용되는 염료의 형광을 조직 에피토프를 손상시키지 않고 소결하기 위해 붕소 리튬(LiBH₄)을 사용하며, 단일 조직¹³에 대해 최대 75개의 매개변수를 획득할 수 있습니다. 이 순환 염색으로 얻은 이미지는 SimpleITK 오픈소스 소프트웨어를 사용해 정렬하여 고차원 공간 분석에 적합한 복합 데이터셋을 생성합니다.

단백질 수준 표현형 분석과 보완적으로 공간 전사체 기법은 세포가 원래 환경 내에서 전사 상태에 대해 귀중한 정보를 제공할 수 있습니다. 특히, 현장 하이브리다이제이션(ISH)은 특정 조직에서 DNA 또는 RNA 서열의 위치를 식별하는 데 널리 사용되는 기법입니다¹¹. RNAscope는 독특한 Z 화학을 가진 프로브를 사용하여 단일 분자 해상도로 RNA 전사체를 특이적으로 증폭하는 잘 확립된 ISH 접근법이며, 다양한 샘플 유형과 호환됩니다¹⁴. 첨단 세포 진단(ACD)을 통해 널리 채택되고 상업적으로 이용 가능한 플랫폼으로서, RNAscope는 다양한 표적에 대한 검증된 프로브를 제공하여 다양한 응용 분야에 맞춘 실험 설계를 단순화합니다.

단백질과 RNA 검출을 동일 조직 내에서 결합함으로써 세포 정체성과 기능에 대한 보다 완전한 시각을 얻을 수 있습니다. 사이토카인과 케모카인과 같은 단명한 분비 단백질은 전통적으로 IHC에 의한 신뢰할 만한 항체 염색이 부족하지만, mRNA 전사체의 정량화를 통해 발현에 관한 정보를 얻을 수 있습니다. 기존의 염색 유발 IHC 또는 TSA-OPAL과 같은 RNA와 단백질 공동 검출 시도는 비선형 신호 증폭과 시간이 많이 소요되는 항원 회출 프로토콜로 인해 제한을 받았습니다¹⁵. 이러한 접근법과 비교할 때, 벡스-플렉스 방법은 공간적 맥락과 핵 형태를 보존하면서도 동시에 고플렉스 단백질과 RNA 검출을 가능하게 하여 정확한 이미지 등록을 가능하게 합니다.

여기서는 IBEX와 RNAscope 플랫폼을 통합하여 세포의 원래 조직 내 전사 및 번역 상태를 동시적이고 정량적으로 특성화하는 프로토콜인 "벡스-플렉스(Bex-Plex)"를 소개합니다. Bex-Plex에서는 고정된 OCT 임베디드 조직이 표준 IBEX 프로토콜을 거친 후 약간 수정된 RNAscope HiPlex 워크플로우를 거치며, 표적 회출은 60°C에서 1시간 배양 시간을 가집니다. 이는 원래 99°C 5분 인큐베이션에서 비롯됩니다. 이로 인해 핵의 구조가 보존되어, IF와 ISH 사이클에서 분리된 이미지를 하나로 등록할 때 피듀셜 마커의 정확한 정렬이 가능합니다. 이 프로토콜은 조직 가용성이 제한적이거나 공간 구조 보존이 중요한 종양 미세환경 분석이나 면역 프로파일링 연구와 같이 단백질과 RNA 발현을 동시에 공간적으로 분석해야 하는 연구에 가장 적합합니다.

널리 구할 수 있는 시약을 사용하며 대부분의 영상 플랫폼과 호환되어, 형광 영상에 익숙하고 기존 현미경에 접근할 수 있는 기술적 훈련을 받은 연구진이라면 누구나 수행할 수 있습니다. 여기서 제시된 프로토콜은 고정된 냉동 샘플에 최적화되어 있습니다. 현재 이 프로토콜은 고정 냉동 조직에서 검증되었으며, FFPE나 인간 임상 표본과 같은 다른 샘플 유형에 적용하기 위해서는 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

이 워크플로우는 조직이 제한적이거나 소중한 경우, 예를 들어 조직 생검이나 표본 크기가 제한된 동물 실험, 그리고 해리 기법으로 추출하기 어려운 세포의 표현형 분석에 매우 유용할 것입니다. 벡스-플렉스는 단일 세포의 전사 및 번역 프로필에 대한 동시적이고 정량적인 정보를 제공하면서도 공간적 맥락을 유지하며, 이는 원래 환경에서 세포 간 관계와 교차 대화에 관한 질문에 답할 독보적인 자료입니다.

프로토콜

이 프로토콜에 명시된 절차는 캘리포니아 대학교 샌디에이고 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 번호 S24049)에서 승인받았습니다. C57BL/6 유전적 배경을 가진 7-12주 생후 수컷과 암컷 마우스를 특정 병원체가 없는 환경에서 사육한 실험에 사용되었습니다.

1. 조직 준비

1. 승인된 1차 및 2차 조치(예:_CO2 안락사 및 자궁경부 탈구)로 실험용 마우스를 안락사시키고, 관심 조직을 보충 배지에 채취합니다.
2. 4% 플라이포름알데히드(PFA) 용액을 1X PBS에 0.5% 또는 1% PFA로 희석하여 조직 고정제를 새로 준비합니다. 림프절과 같은 저부피 조직에는 0.5% PFA, 종양과 같은 부피가 많은 조직에는 1% PFA를 사용하세요.
   주의: 파라포름알데히드는 섭취하거나 삼키면 가연성 및 독성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비(PPE)를 착용하고 피부나 눈과의 접촉을 피하세요.
3. 조직을 24웰 플레이트에 2mL 고정액과 함께 옮기고, 4°C에서 하룻밤 배양합니다.
   참고: 16시간 초과 부화 시간은 과밀착 문제를 일으킬 수 있습니다.
4. 새로운 24웰 플레이트의 웰을 1X PBS로 채우고, 고정 플레이트에서 조직을 옮기세요.
   일시정지: 필요 시 조직을 4°C의 1X PBS에 최대 7일간 보관할 수 있습니다.
5. 해부 내시경과 도구를 사용해 조직에서 과도한 지방이나 이물질을 하나씩 제거하세요. 트리밍 중 조직 탈수를 방지하기 위해 PBS 1X 소량을 조직에 직접 첨가하세요.
6. 분말 자당 육수를 1X PBS에 희석하여 30% w/v 자당 용액을 준비하세요.
7. 조직을 24웰 플레이트에 2mL 30% 자당을 넣고 4°C에서 하룻밤 배양하여 탈수 시킵니다. 조직이 우물 바닥으로 가라앉을 때 적절히 탈수된 상태입니다.
8. 라벨이 붙은 냉동몰드에 OCT를 채우고 조직을 하나씩 몰드에 넣으세요. 조직 방향은 기원에 따라 다르지만, 표준 권장 사항은 가장 큰 표면적이 크라이오몰드 바닥과 평행하게 배치되는 것입니다. 조직이 OCT에 완전히 잠겨 있는지 확인하세요.
9. 드라이아이스에 10분간 올려 냉동시키고 -80°C에서 보관하세요.

2. 조직 절절

참고: 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약과 실험실 재료는 RNase가 없는 제품이어야 합니다. 슬라이드를 다룰 때 오염을 방지하기 위해 주의하세요.

1. RNase 자유 현미경 슬라이드에 15 μL 크롬 알룸 접착제를 코팅하고 오븐에서 60°C에서 1시간 배양합니다. 크롬 알룸 코팅 슬라이드는 사용 전 최대 한 달간 RT(상온)에서 보관할 수 있습니다.
2. OCT 내장된 조직을 -80°C 냉동고에서 꺼내 -20°C 냉동체/냉동체에 넣어 최소 20분 이상 평형을 맞추세요.
3. 조직을 두께 10–15 μm의 크롬 알룸 코팅 슬라이드에 절제합니다.
4. 절단된 슬라이드는 4°C에서 보관하거나, 같은 날 염색할 경우 슬라이드를 RT에 평형으로 두세요. 단절된 슬라이드는 사용 전 최대 5일간 4°C에서 보관할 수 있습니다.

3. 단백질 염색

1. 덩크 탱크에서 RNase 없는 1X PBS로 염색할 슬라이드를 5분간 담가 조직에서 과도한 OCT를 제거합니다.
2. 소수성 장벽 펜을 사용해 슬라이드의 조직 주변에 상자를 그려 2분간 말리세요.
3. RNase 프리 1X PBS에 10 μg·mL⁻¹ 항마우스 FC 수용체 차단액을 블로킹 용액으로 준비합니다. 블로킹 버퍼를 슬라이드의 샘플에 첨가하여 조직을 완전히 덮는 기포(100–150 μL·^section-1)를 만듭니다.
   참고: 때때로 어려운 조직이나 마커의 경우 차단 버퍼에 FBS 또는 BSA(보통 1–2%)를 추가해야 할 때가 있습니다.
4. 슬라이드를 RT에서 습한 염색 상자에 1시간 정도 배양한 후, RNase 없는 1X PBS가 채워진 덩크 탱크에 완전히 담가서 5분간 세척하세요.
5. RNase 없는 1X PBS에 1차 항체 염색액을 준비하며, 조직 절편당 100-200 μL로 계획합니다. 표준 항체 희석 비율은 1:50에서 1:200 사이이지만, 특정 항체 및/또는 조직 유형에 가장 적합한 희석 인자를 찾기 위해 단일 염색 조절을 하는 것이 권장됩니다. 형광 응집체를 방지하기 위해 피펫팅 전에 소용돌이와 펄스를 사용해 항체를 회전시킵니다.
6. 세척기에서 슬라이드를 제거하고, 항체 용액이 희석되지 않도록 흡수성 작업 와이프로 샘플 박스 모서리의 남은 액체를 부드럽게 흡수하세요.
7. 항체 용액을 차단액과 같은 방식으로 적용하여 조직 위에 기포를 만듭니다.
8. 슬라이드를 37°C 오븐에 수평으로 놓고 1시간 동안 부양합니다. 또는 습한 상자에서 RT에서 3–4시간 슬라이딩합니다. 관심 있는 조직에 이미 최적화된 표준 IF 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 부화 중에는 탈수를 방지하기 위해 슬라이드를 습한 환경에서 유지하세요. (예: 염색 트레이 바닥에 젖은 종이 타월을 사용하세요).
9. 슬라이드를 RNase 프리 1X PBS에 2분간 담가서 세척하세요. 이 과정을 두 번 반복하면 총 세 번의 세척이 가능합니다. 염색 패널에 필요하다면 이 기간 동안 RNase 없는 1X PBS 2차 항체 염색액을 준비하세요. 표준 항체 희석 비율은 1:500에서 1:1000 사이이지만, 특정 항체 및/또는 조직 유형에 가장 적합한 희석 인자를 찾기 위해 단일 염색 적정을 수행하는 것이 권장됩니다.
10. 흡수성 작업 와이프로 슬라이드에 남은 PBS를 제거하고, 각 조직 절면에 100–200 μL의 2차 항체 염색액을 첨가합니다. 슬라이드를 오븐 37°C에 수평으로 놓고 30분간 부양하세요. 또는 습한 상자에서 RT 1–2시간 동안 슬라이드를 염색할 수 있습니다.
11. 슬라이드를 1X RNase 프리 PBS에 2분간 담가서 세척하세요. 이 과정을 두 번 반복하면 총 세 번의 세척이 가능합니다.
12. DAPI 핵염료를 RNase-free 1X PBS에 최종 농도가 0.2 μg·mL⁻¹ 로 희석하고, 각 조직 절편에 100–200 μL을 첨가합니다.
13. 습한 상자에서 RT로 10분간 인큐베이팅한 후, RNase 프리 1X PBS에 담근 후 잠시 위아래로 담근 세척을 한 번 합니다.
14. 흡수성 작업 닦기로 슬라이드에 묻은 과도한 액체를 제거하고, 각 섹션에 20–30 μL 수용성 베이스 안티페이드 마운팅 매체를 첨가합니다. 슬라이드에 커버슬립을 조심스럽게 놓고 거품을 최소화한 뒤, 장착 매체를 15–30분 정도 경화시킵니다.
15. 얼룩진 슬라이드를 상상해 보세요. IBEX의 패널 설계 고려사항과 이미지 획득에 대한 더 자세한 설명은 원래 발표된 IBEX 프로토콜^12,13을 참조하십시오.
    일시정지: 장착된 슬라이드는 4°C에서 최대 3일간 어두운 곳에 보관하지만, RNA 분해를 최소화하기 위해 즉시 진행할 것을 권장합니다.

4. 형광체 표백 및 반복 단백질 염색

1. 슬라이드를 RNase 프리 1X PBS에 담가두어 덮개 슬립이 힘 없이 쉽게 미끄러져 나갈 때까지 유지하세요. 커버슬립이 부착된 기간에 따라 최대 16시간이 걸릴 수 있습니다.
2. 슬라이드가 불리는 동안, 1 mg·mL^⁻¹ LiBH₄를 RNase 프리 DI H₂O에 부드럽게 혼합하여 완전히 녹일 때까지 준비하고, 활성화될 때까지 10분간 기다립니다. 용액 내에 기포가 존재할 때 활성화가 일어나며, 활동은 최대 4시간 동안 지속됩니다.
   주의: LiBH₄ 는 수분에 반응하므로 분말 스톡의 과도한 습기 노출을 피하고 폐기물은 적절히 처리해야 합니다.
3. 슬라이드를 RNase 프리 1X PBS에서 2분간 한 번 세척하여 마운팅 배지 잔류물을 제거한 후, 각 조직에 100–150 μL LiBH₄ 용액을 피펫팅합니다. 습한 상자에서 15분간 부화하세요.
   참고: 염색에 사용되는 형광체에 따라 이 배양 시간을 연장해야 할 수 있습니다(IBEX 방법 논문에서 자세히 다뤄짐)^12,13.
4. 슬라이드를 RNase 프리 1X PBS에 담근 후 잠깐 위아래로 담근 세척을 하세요.
5. 3.5-3.15 단계를 따라 추가 단백질 마커로 슬라이드를 염색하세요. 핵염료는 LiBH₄와 함께 표백되지 않기 때문에 재염색할 필요가 없습니다. 필요하면 단백질 염색을 반복하세요.
   정지 지점: 장착된 슬라이드는 마지막 단백질/IBEX 사이클을 표백한 후 RNA로 진행하기 전에 4°C에서 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다.
6. 최종 사이클의 형광체를 표백한 후 즉시 RNAscope HiPlex로 진행하세요. 표준 IBEX 최대 6주기까지 조직이나 에피토프 손실 없이 수행된 바 있으나, RNA 전사체 품질이 장기간 저하될 수 있으므로 이 프로토콜에서 단백질 염색 주기 3회를 초과하는 것은 권장하지 않습니다.

5. RNAscope HiPlex 슬라이드 준비

1. 슬라이드를 RNase 프리 1X PBS에 완전히 담가두어 커버슬립이 힘 없이 쉽게 미끄러져 나갈 때까지 유지하세요. 커버슬립이 부착된 기간에 따라 최대 16시간이 걸릴 수 있습니다. RNase 프리 1X PBS로 2분간 한 번 세척해 부착된 배지 잔여물을 제거하세요.
2. 50% 에탄올 200mL, 70% 에탄올 200mL, 100% 에탄올 400mL를 준비하세요.
3. 하이브리드화 오븐을 켜고 60°C로 설정하세요. 10X 표적 회수 시약을 RNase 없는 DI H₂O에 1X 작업 육수로 희석한 후, 5.8단계까지 오븐에 넣어 예열합니다.
   참고: 표적 회수 시약을 60°C까지 미리 예열하지 않으면 각 사이클의 이미지 등록에 영향을 미칩니다. 표적 회수 시약은 회수 단계 동안 60°C를 유지해야 합니다.
4. 슬라이드를 50% 에탄올에 담가. RT에서 5분간 배양하세요.
5. 50% 에탄올에서 슬라이드를 빼내고 70% 에탄올에 담그세요. RT에서 5분간 배양하세요.
6. 70% 에탄올에서 슬라이드를 제거하고 100% 에탄올에 담가세요. RT에서 5분간 배양한 후 신선한 100% 에탄올로 반복하세요.
7. 100% 에탄올에서 슬라이드를 제거하고 RT에서 5분간 말리세요.
8. 각 조직 절면에 60°C 1X 표적 추출 시약 100–150 μL을 첨가한 후 슬라이드를 하이브리드화 오븐에 넣습니다. 60°C에서 1시간 동안 배양하세요.
9. 슬라이드를 제거하고 RNase가 없는 DI H2O에 15초간 담그어 세척합니다. 이때 오븐의 설정 온도를 40°C로 변경하세요.
10. 슬라이드를 100% 에탄올로 옮기고 5분간 배큐한 후 RT에서 최소 5분간 건조시킵니다.
11. 슬라이드에 프로테아제 III를 조직 절개당 1–2방울 정도 적용하세요. 슬라이드를 하이브리다이제이션 오븐에 넣고 40°C에서 30분간 배양합니다.
12. 슬라이드를 RNase 프리 DI_{H 2}O에 담근 후 잠깐 위아래로 담가서 세척하세요. 신선한 증류수로 총 2번 세척할 수 있도록 반복합니다.

6. RNAscope 시약 준비 및 프로브 하이브리다이제이션

1. RNAscope HiPlex 프로브 스톡과 HiPlex 탐정 희석제를 오븐이나 물욕에서 40°C로 10분간 데워 준비하세요.
2. 잠시 펄스 스핀 다운 모든 50X 프로브 스톡. RNAscope 프로브 희석제로 각 고유 표적 탐침을 1배로 희석하여 작동하는 프로브 혼합물을 준비합니다. 조직당 50–100 μL의 프로브 혼합물을 사용하고, 사용 전에 소용돌이로 잘 섞을 계획입니다. RNAscope HiPlex 프로토콜은 최대 3사이클의 4개 프로브(총 12개 프로브, T1-12로 표기됨)를 수용할 수 있습니다. 프로브 설계에 관한 지침은 원본 출판된 RNAscope 프로토콜¹⁴를 참조하십시오.
3. RNAscope HiPlex Amp 1–3과 HiPlex Fluoro T1-T4 시약을 RT에 놓아 평형을 맞춥니다.
4. 프로테아제 III 처리된 슬라이드를 가져와 각 조직 절면에 50–100 μL 프로브 혼합물을 피펫팅하세요. 하이브리드화 오븐에 수평으로 넣고 40°C에서 2시간 동안 배양합니다.
5. 슬라이드를 1X 워시 버퍼에 완전히 담가서 2분간 세척하세요. 새 버퍼로 총 2번 세척할 때까지 반복합니다.
   일시정지: 슬라이드는 ACD의 RNAscope 프로토콜에 설명된 대로 RT 시 5X SSC 버퍼에 하룻밤 동안 보관할 수 있습니다. 이 정지 지점을 사용할 경우, 다음 날 아침 1X 세척 버퍼에서 2분간 두 번 세척해야 합니다.

7. 프로브 증폭

참고: 슬라이드에 적용하기 전에 모든 시약이 RT에 평형화되었는지 확인하세요.

1. HiPlex Amp1 시약을 1–2방울 슬라이드에 넣고 하이브리다이제이션 오븐에서 40°C에서 30분간 배양합니다. 슬라이드를 1X 워시 버퍼에 완전히 담가서 2분간 세척하세요. 이 과정을 반복해서 총 2번 세척합니다.
2. HiPlex Amp2 시약 1–2방울을 슬라이드에 넣고 40°C에서 하이브리다이제이션 오븐에서 30분간 배양합니다. 슬라이드를 1X 워시 버퍼에 완전히 담가서 2분간 세척하세요. 이 과정을 반복해서 총 2번 세척합니다.
3. HiPlex Amp3 시약을 1–2방울 슬라이드에 넣고 하이브리다이제이션 오븐에서 40°C에서 30분간 배양합니다. 슬라이드를 1X 워시 버퍼에 완전히 담가서 2분간 세척하세요. 이 과정을 반복해서 총 2번 세척합니다.
4. 슬라이드에 HiPlex Fluoro T1-T4 시약 1–2방울을 추가하고 하이브리다이제이션 오븐에서 40°C에서 15분간 배큐합니다. 슬라이드를 1X 워시 버퍼에 완전히 담가서 2분간 세척하세요. 이 과정을 반복해서 총 2번 세척합니다.
5. 각 조직 절편에 HiPlex DAPI 시약 3–4방울을 추가하고 RT에서 1분간 배양합니다.
6. 흡수성 작업 물솜으로 슬라이드에 묻은 액체를 빼내어 DAPI를 제거하세요. 즉시 각 섹션에 100μL 수성 베이스 안티페이드 마운팅 매체(IBEX 스테인 단계에서 사용하는 것과 동일)를 첨가합니다. 슬라이드 위에 커버슬립을 조심스럽게 놓고 거품을 최소화한 뒤, 장착 매체를 15분에서 30분 정도 건조시킵니다.
7. 영상 촬영으로 넘어가세요.
   멈춤 지점: 장착된 슬라이드는 최대 3일간 4°C의 어둠 속에 보관할 수 있으나, RNA 분해를 최소화하기 위해 신속히 보관할 것을 권장합니다.

8. 형광 분해 및 반복 RNA 하이브리다이제이션

1. 슬라이드에서 커버 슬립을 제거하려면 4X SSC 버퍼에 최소 30분간 RT 온도로 담가두세요. 슬라이드를 완전히 담근 후 잠시 위아래로 담가서 한 번 세척하세요.
2. 신선한 절단액 앰플을 열고 4X SSC 버퍼로 희석하여 10% 작동 용액을 만듭니다.
3. 슬라이드를 습한 상자에 넣고 10% 절단액 3–4방울을 넣으세요. RT에서 15분간 배양한 후, 0.5% PBST에 완전히 담근 후 2분간 세척하세요. 신선한 PBST로 총 2번 세척을 반복합니다.
4. RNAscope 패널의 2번째 영상 주기를 진행하기 위해 HiPlex Fluoro T5-T8 시약을 RT에 평형화합니다.
5. 하이브리다이제이션 오븐을 켜고 온도를 40°C로 설정하세요.
6. HiPlex Fluoro T5-T8 시약을 슬라이드에 추가하고 하이브리다이제이션 오븐에서 40°C에서 15분간 인큐베이션합니다. 슬라이드를 1X 워시 버퍼에 완전히 담가서 2분간 세척하세요. 이 과정을 반복해서 총 2번 세척합니다.
7. 슬라이드에서 남은 액체를 조심스럽게 빼내세요. 즉시 각 섹션에 100 μL 마운팅 매체를 추가하고 슬라이드에 커버슬립을 조심스럽게 덮어주세요. 마운팅 매체를 15분에서 30분 정도 건조시킨 후 영상 촬영을 진행하세요.
8. 적절하다면 HiPlex Fluoro T9-T12 시약으로 8.1–8.7단계를 반복하여 총 3회의 RNAscope 사이클을 수행하세요. RNAscope HiPlex 프로토콜로 3사이클이 가능하지만, 이 프로토콜로 단백질 염색에 추가되는 시간이 RNA 품질에 영향을 줄 수 있음을 유의하세요. 따라서 3주기는 특정 전사체에 따라 항상 가능하지 않을 수 있습니다.

9. 이미지 처리

1. 각 라운드의 원본 파일을 개별적으로 처리하고, 배경 뺄셈 설정, 부드럽게 하는 필터, 등록 변환 유형 등 일관된 매개변수를 사용하여 이미지 처리를 수행합니다. 채널 이름은 일관된 구분자 문자로 명명되어야 합니다(예: 사이클 1: CD45 AF532, 여기서 ":"는 사이클과 마커/플루어를 구분합니다).
2. SimpleITK 소프트웨어(https://github.com/niaid/sitk-ibex)를 실행하고 SimpleITK> Imaris 확장 > 클릭하여 공통 채널을 사용하는 z-스택의 아핀 등록을 합니다.
3. 각 멀티플렉스 사이클에서 이미지 파일을 하나씩 업로드하고, 모든 명명된 채널에 구분자 문자(예: ":")를 입력하세요.
4. 이미지 등록에 사용할 채널과 모든 다른 이미지가 정렬될 고정 이미지를 선택하세요. 모든 사이클 사이에 공통된 이름의 채널을 사용할 수 있으나, DAPI를 기준 표지기로 사용하는 것이 권장됩니다.
5. "등록"을 클릭한 후 "리샘플링 및 통합 이미지 저장"을 선택하세요.
6. 선택한 소프트웨어로 후속 분석을 진행하세요. 이미지 처리 및 등록에 관한 자세한 정보는 원본 IBEX 프로토콜^12,13을 참고하세요.

결과

그림 1 : Bex-Plex 워크플로우 개요.
크롬 알룸 코팅 슬라이드에 절절된 고정 조직은 표준 IBEX 최대 3회 사이클을 거친 후 최대 3회 RNAScope HiPlex를 거치며, 이 과정에서 초기 표적 추출 단계는 60°C에서 1시간 동안 수행됩니다. 개별 사이클의 이미지는 등록 및 기준 마커(예: DAPI)를 사용하여 정렬하여 후속 분석을 위한 다중화 데이터셋을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

우리는 위에서 설명한 프로토콜을 ...

토론

Bex-Plex 워크플로우는 반복 단백질 염색 플랫폼인 IBEX와 RNAscope in situ 하이브리다이제이션을 통합하여 단백질과 RNA 전사체를 단일 세포 해상도로 동시에 검출할 수 있게 합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 온전한 조직 내에서 단백질과 RNA 발현을 통합적으로 공간적으로 분석할 수 있는 재현 가능한 방법을 제공하는 것입니다. 동일한 조직에서 단백질과 RNA 발현을 모두 측정하는 능력은 이전에 기술적 도전 과제를 안겨왔습니다: 높은 비용, 복잡한 항원 회수 단계, 제한된 다중화 용량, 해상도 제한(단일 세포 제외), 비선형 신호 증폭, 그리고 하위 처리 ^17,18,19를 위한 광범위한 생물정보학 파이프라인 등이 있습니다. 다중화 면역형광, OPAL/TSA 염색, 공간 전사체 플랫폼과 같은 기존 접근법과 비교할 때, 벡스-플렉스는 재현 가능하고 정량적이며 고전설 수준의 동시에 검출을 가능하게 하며, 공간적 맥락과 핵...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023