자가 조립 인간 심장 세포에서의 저산소증-재산소화 손상 모델

요약

자가 조립식 인간 심장 오가노이드(hCOs)는 인간 심장 발달과 질병을 모델링하기 위한 신흥 시스템입니다. 여기서는 저산소 재산소화를 통한 hCO의 생성 및 손상 방법론과 손상 후 예상되는 조직학적 및 기능적 결과에 대한 세부 정보를 제공합니다.

초록

빠른 혈관 재생이 없으면 허혈성 심장병은 심근세포의 돌이킬 수 없는 손실, 흉터 형성, 심장 기능 저하를 초래합니다. 저산소-산소 재산소화 손상을 모델링하고 인간 조직에서 잠재적 치료 개입을 평가하는 능력은 충족되지 않은 수요입니다. 인간 심장 오가노이드(hCOs)는 신흥 모델 시스템이지만, hCO의 작은 크기, 현탁 배양 요구, 분화 효율의 변동성 때문에 연구를 시작하는 것이 도전적일 수 있습니다. 이 프로토콜은 인간 iPSC 유래 자가 조립 hCO를 생성하고 유지하는 사용자 친화적인 가이드를 제공합니다; hCO를 처리 및 조직학적으로 분석하는 방법; 그리고 인간 허혈/재관류에서 관찰되는 섬유화와 세포자멸사를 모방하는 저산소증-재산소화 방식으로 hCO를 손상시키는 접근법도 제시했습니다. 이 프로토콜은 허혈-재관류 손상의 동물 모델을 보완하는 HCOs를 사용하는 방법에 대한 지침을 제공하며, 인간 심근 회복을 촉진할 수 있는 요인을 식별하고 검증하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

허혈성 심장병은 전 세계적으로 이환율과 사망률의 주요 원인으로, 미국에서만 최소 2,050만 명이 영향을 받고 있습니다. ^1,2,3. 충분한 관류가 없으면 장기간 저산소증은 심근세포(CM) 사망과 심근 기능 장애를 초래합니다. 심근허혈은 주로 경피적 개입, 혈전용해 치료, 관상동맥 우회로 이식술을 통한 혈관 재생 치료로 치료됩니다. 그러나 혈관 재생은 양날의 검이며, 활성 산소종 ^4,5의 방출을 통해 추가적인 손상을 초래할 수 있습니다. 재관류 전략은 매우 성공적이었으나, 허혈성 손상 시나 재관류 후 CM 손실을 제한하는 방법은 더 어렵습니다. 허혈 재관류 동물 모델에서 경색 조직 복원 시도가 효과적이지만, 인간 임상시험에서는 대체로 유의미한 효과를 내지 못해 CM 보존 또는 보충^치료제를 평가할 인간 모델의 필요성을 제기하고 ^{있습니다.}

심장 손상을 모델링하는 데 사용되는 인간 플랫폼에는 1차 조직과 인간 유도 다능 줄기세포(hiPSC) 유래 시스템이 포함됩니다^13,14. 1차 조직이 샘플 가용성에 의해 제약받기 때문에, hiPSC 시스템은 유전적으로 다루기 쉽고 확장 가능하다는 뚜렷한 장점을 가진 심장 질환 모델링의 지배적 플랫폼으로 부상했습니다 15,16,17,18,19. 전통적인 2D hiPSC 유래 심근세포(hiPSC-CM) 배양은 결과 CM의 미성숙, 복잡한 조직 구조의 부재, 그리고 인간 심장에서 발견되는 완전한 세포 다양성을 재현하지 못하는 점에 제한을 받습니다^15,20. 이러한 한계를 해결하기 위해 엔지니어링 3D 심장 조직(EHT)이 점점 더 많이 채택되고 있습니다.^{20, 21, 22, 23, 24, 25, 26}. EHT 접근법에는 분화 전 심장 세포를 구체로^{혼합하거나,} 분화된 심장 세포를 비계나 몰드에 시딩하는 방법이 포함됩니다^{21, 22, 27}. EHT는 이형 세포 상호작용을 더 잘 모델링할 수 있고 2D 배양보다 상대적으로 더 성숙하지만, EHT를 생성하고 유지하기 위한 맞춤형 스캐폴드나 생물반응기 요구가 현재 확장성을 제한합니다 21,27,28.

자가 조립식 심장 오가노이드(hCO), 또는 카디오이드는 새롭고 강력한 시험관 내 인간 모델 시스템입니다 20,25,26,29. hCO는 여러 가지 장점이 있습니다. 첫째, 여러 특수 분화 프로토콜 없이도 내피세포, 섬유아세포, 심외막세포 등 여러 세포 유형을 포함할 수^{있습니다.} 둘째, 대부분의 구분은 3D 현탁 배양에서 이루어져 특수 몰드나 조직 매트릭스^{25, 26, 29, 30}의 요구사항이 없습니다. 마지막으로, hCO는 중심 공동이 있는 전형적인 구형 형태를 가지고 있어 형태학적 분석이 가능합니다. 따라서 hCO는 2D 배양 시스템과 유사한 확장성을 가지면서도 EHT의 조직 복잡성을 일부 유지합니다. hCO는 약물 독성 검사, 환자별 질병 모델링, 심장 발달의 여러 측면 모델링에 사용되었습니다 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. 유망하긴 하지만, hCO는 EHT에 비해 몇 가지 한계가 있는데, 그 중 하나는 힘 출력을 직접 측정할 수 없다는 점입니다. 또한, 기술된 hCO 모델에는 고유한 면역 세포 집단이 없지만, hCO에 대식세포를 배치하는 것은 가능합니다. 그럼에도 불구하고 hCO는 신흥적이고 빠르게 진화하는 인간 모델 시스템입니다 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

현재까지 hCO를 이용한 심장 손상 모델링은 제한적이었습니다. 냉동 손상 모델이 기술되었으나, 손상은 매우 다양하며, hCO를 개별적으로 손상시켜야 하는 필요성이 확장성을 제한합니다²⁹. 이 논문은 저산소증 재산소화(H/R) 손상으로 자가 조립하는 hCO를 생성하고 손상시키는 사용자 친화적인 프로토콜을 설명합니다. 다른 hCOs 생성 프로토콜과 비교할 때, 이 프로토콜은 단순화된 분화 배지를 사용하며 Hofbauer 등이 설명한 2D-3D 중배엽 분화 전략을 포함^합니다. H/R 손상 프로토콜은 hCO가 박동을 시작한 후, 보통 분화 8일차(D8)에서 D11 사이에 이루어집니다. H/R 지속 시간은 6시간에서 24시간 사이로 조절하여 원하는 손상 수준, 즉 최소한에서 거의 완전한 CM 손실까지 조절할 수 있습니다. 또한, hCO는 H/R 손상 후 비멘틴⁺ 세포와 함께 콜라겐성 코어를 형성하며, 이는 H/R 지속 기간에 따라 심각도가 증가합니다. 이 고처리량, 확장 가능한 H/R 손상 hCO 모델은 CM 회복 또는 손상 후 재생을 촉진하기 위한 새로운 치료 경로를 인간 모델이 개발하고 시험할 필요성을 해결할 가능성을 제시합니다.

프로토콜

인간 세포주 취급을 위한 모든 절차는 지역 생물안전 프로토콜을 따라야 합니다. 모든 실험은 듀크 대학교 iPSC 핵심 시설에서 건강한 신생아 남성 섬유아세포에서 유래한 iPSC 세포주 DU11을 사용하여 수행되었습니다.

1. hCO의 생성

참고: 이 절에서는 iPSC로부터 hCO를 생성하는 표준 프로토콜을 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜에 명시된 모든 단계는 무균성을 보장하기 위해 층류 후드에서 수행되어야 합니다. 차이 배지 레시피는 표 1 을 참조하십시오.

하루	가축 농도	작업 집중	희석 인자	베이스 미디어
D0	10 mM CHIR99021	10 μM CHIR99021	1:1000	RPMI-1640, 2% B27 인슐린 제외
	100 mg/mL 아스코르브산	50 μg/mL 아스코르브산	1:2000
	액티빈 A 10 mg/mL	60 ng/mL 액티빈 A	1:167
D1	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640, 2% B27 인슐린 제외
	100 mg/mL 아스코르브산	50 μg/mL 아스코르브산	1:2000
D2	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640, 2% B27 인슐린 제외
	100 mg/mL 아스코르브산	50 μg/mL 아스코르브산	1:2000
	10 mM 티아조비빈	2 μM 티아조비빈	1:5000
D3	5 mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640, 2% B27 인슐린 제외
	100 mg/mL 아스코르브산	50 μg/mL 아스코르브산	1:2000
D4	5mM IWP2	5 μM IWP2	1:1000	RPMI-1640, 2% B27 인슐린 제외
D6+	해당 없음	해당 없음		RPMI-1640, 2% B27과 인슐린 함정

표 1: 미분 매체 표. 각 차별인자별 0일부터 6일까지의 재고 농도, 작업 농도, 희석 계수. 모든 작업 용액은 급여 시 신선하게 준비하세요.

그림 1: hCO 차분의 개식도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

1. iPSC 유지 관리
   1. 12웰 플레이트의 각 웰 바닥을 1:100 비율로 바닥막 매트릭스를 완전히 덮고, 차가운 DMEM/F12 배지에 희석합니다. 처리된 플레이트를 37 °C에서 1시간 동안 인큐베이팅하여 중합을 허용합니다. 즉시 사용하지 않는 경우, 플레이트는 필름으로 밀봉하여 4 °C에서 최대 2주간 보관한 후 사용 전 37 °C에서 최소 60분 이상 배양할 수 있습니다.
2. 분화 -3일차(D-3): 후속 분화를 위한 iPSC 플래딩
   1. 1.1.1 단계에 설명된 기저막 매트릭스 코팅판을 준비합니다.
   2. iPSC 배양에서 유지 배지를 흡입하고, 세포를 완전히 덮을 만큼 충분한 세포 분리 용액을 추가합니다(12웰 플레이트의 웰당 ~500 μL 또는 6웰 플레이트의 웰당 1mL). 37°C에서 5분간 배큐하세요.
   3. 각 웰에 같은 양의 iPSC 유지 배지를 추가하고, 플레이트를 부드럽게 두드려 세포 분리를 돕습니다. 플레이트를 자신 쪽으로 기울이고, 웰 바닥을 부드럽게 위아래로 움직여 부착 세포를 최대 3회 이상 분리하지 마세요. 피펫을 사용해 세포 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브로 옮기세요.
   4. 펠릿 셀은 300 x g 에서 3분간 실온에서 스윙 버킷 원심분리기에서 원심분리합니다. 상정액을 흡취하고 세포를 1mL의 iPSC 유지 배지에 부드럽게 재현탁합니다.
   5. 세포 현탁액 10 μL을 새로운 1.5 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 트리판 블루 10 μL 넣고 피펫으로 혼합합니다. iPSC/트리판 블루 혼합물 10 μL을 혈구세포계에 추가하고 살아있는 세포를 세세요.
   6. 세포 부탁액을 ROCK 억제제(ROCKi)와 함께 iPSC 유지 배지에서 최종 농도인 100,000-200,000 cells/mL로 희석합니다. 12웰 플레이트의 각 웰에 1mL/웰을 추가하여 기저막 매트릭스로 코팅합니다.
      참고: 분화 전의 플레이트 밀도는 특정 세포주의 성장 속도에 따라 달라집니다. 각 iPSC 라인마다 도금 밀도를 조정해야 할 수도 있습니다. ROCKi 농도는 브랜드나 제형에 따라 조절이 필요할 수 있습니다.
3. 차별화 D-2: ROCKi를 제거하기 위한 매체 교환
   1. ROCKi 없이 1mL의 신선한 iPSC 유지 배지로 교환하세요. 세포는 작은 집락을 형성하기 시작할 것입니다. 군체는 평평해 보여야 합니다(그림 2A). 세포가 자갈처럼 보이거나, 가늘거나, 길게 보인다면 이는 자발적 분화의 신호이며, 분화 효율이 저하될 수 있습니다.
4. 분화 D-1: 치료 없이 세포를 계속 배양하세요.
5. 분화 D0: 분화 및 중배엽 유도 시작
   1. 현미경을 사용해 분화 시점에 세포 밀도를 70%-90% 일치율로 확인하면(그림 2B), 서브컨플루트(sub-confluc)가 있을 경우, iPSC 유지 배지를 세포에 공급하고 24시간을 기다립니다. 셀들이 너무 밀집되어 있다면, 1.2단계에서 나눈 것처럼 셀을 분할하세요
   2. D0 중배엽 유도 배지(10 μM CHIR99021, 50 μg/mL 아스코르브산, 60 ng/mL 액티빈 A, RPMI-1640 내 12 mL 12 mL 12mL, 2% B27 보충제(인슐린 제외)를 준비합니다.
   3. 기존 배지를 제거하고 D0 중배엽 유도 배지 1mL/웰로 교체하세요. 미디어 교환 시기를 주목하세요.
6. 차별화 D1: 심장 중배엽 명세표
   1. D0 중배엽 유도 배지를 추가한 지 정확히 24시간 후, D1 심장 중배엽 지정 배지(5 μM IWP2, 50 μg/mL 아스코르브산 RB에 포함)로 교환합니다.
7. 분별 D2: hCO 형성
   1. 세포를 덮을 만큼 충분한 세포 해리 시약을 추가하고 37°C에서 5분간 배양합니다(그림 2C). 각 웰에 같은 양의 D2 심장 중배엽 배지를 추가하고, 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 부착 세포를 방출합니다. 세포 현탁액을 15mL 원뿔관으로 옮깁니다.
   2. 펠릿 세포는 300 x g 에서 3분간 실온에서 원심분리합니다. D2 심장 중배엽 규격 배지 1 mL(5 μM IWP2, 50 μg/mL 아스코르브산 RB-)에 재현탁합니다.
   3. 세포 현탁액 10 μL에 트리판 블루 10 μL을 추가하세요. 원하는 방법으로 셀을 세세요. D2 심장 중배엽 지정 배지에 2 μM 티아조비빈을 사용하여 100,000 cells/mL 농도로 희석합니다. 96웰 초저부착판에 10mL의 세포 현탁액을 사용하세요.
   4. 셀 현탁액을 적절한 크기의 시약 저장소로 옮기고, 다중 채널 피펫을 사용해 초저용량 부착 96웰 플레이트의 각 웰에 100 μL을 전달하여 최종 농도는 10,000 셀/웰에 도달합니다.
   5. 현탁 배양에서 hCO 형성을 유도하기 위해 500 x g 원심분리기를 실온에서 5분간 사용한다. 원심분리 후에는 큰 세포 펠릿이 형성됩니다(그림 2D). 이 펠릿이 제한되지 않으면 원심분리를 반복합니다.
      참고: 모든 세포가 hCO에 통합되는 것은 아니며, hCO는 제한된 세포 펠릿으로 나타나며, 개별 세포는 밝은 필드 현미경에서 볼 수 있습니다. hCO를 둘러싼 플레이트 내 일부 단일 세포 이물질은 정상입니다.
8. 차별법 D3: ROCKi를 희석하기 위한 배지 첨가
   1. 플레이트당 10mL의 D3 배지(5 μM IWP2, RB-에 50 μg/mL 아스코르브산 포함)를 준비합니다. 멀티채널 피펫을 사용해 각 웰에 100 μL의 D3 매체를 첨가하되, 매체는 제거하지 않습니다.
      참고: 이 단계에서 hCO는 어둡고 잘 경계된 구형으로 응축되어 있습니다. 개별 셀은 보이지 않습니다(그림 2E).
9. 차별화 D4: D4 매체로의 교환
   1. D3 배지 100 μL을 제거하고 D4 배지 100 μL (5 μM IWP2 in RB-)로 대체합니다. 흡인 위험을 줄이기 위해 플레이트를 자신 쪽으로 약 45° 각도로 기울이고, 멀티채널 피펫을 플레이트 측면 벽에 대해 약 90° 각도로 잡으세요. 멀티채널 피펫을 웰 측벽에 단단히 놓고 천천히 100 μL의 매체를 흡입하며, 피펫 팁에 흡기 hCO가 있는지 간헐적으로 점검합니다.
      참고: hCO는 현탁 배양 중에 있으며, 배지 제거 시 흡입하는 경우가 흔합니다. 흡인 위험을 줄이기 위해 플레이트를 대략 45° 각도로 기울이고, 멀티채널 피펫을 플레이트 측면벽에 대해 약 90° 각도로 잡으세요. 멀티채널 피펫을 웰 측벽에 단단히 놓고 천천히 100 μL의 매체를 흡입하며, 피펫 팁에 흡입된 hCO가 있는지 간헐적으로 점검합니다.
   2. 100μL D4 매체로 교체하세요.
10. 차별화 D6: hCO 유지 매체
    1. D4 배지 100 μL을 제거하고 D6+ 배지 100 μL (RPMI-1640 with 2% B27 보충제(RB+)))으로 대체합니다.
11. 미분 D8
    1. 매 매번 매 매개체를 교환하여 100 μL을 제거하고 100 μL 신선한 D6+ 매체로 교체하세요. hCO는 더 커지고 매끄러운 가장자리를 유지하며, 성공적으로 분화되면 D6-11 부근에서 박동을 시작해야 합니다(그림 2F). hCO는 여전히 어둡고 잘 경계된 구상체로 나타나며, 개별 세포는 보이지 않습니다.

그림 2: hCO 분화 연대표. 오가노이드 분화 연대표. (A) 분화 시작 1일 전의 iPSC 집단(D-1). 뚜렷하고 평평해 보이는 군집들이 눈에 들어보세요. (B) 분화 시작일(D0) 당일 iPSC는 ~90% 합류율에 도달합니다. (C) 96웰 초저부착판에서 오가노이드 형성 직후 D2 분화 단계의 오가노이드. 화살표는 바늘 모양의 IWP2 결정의 예시를 나타냅니다. (D) 분화 D3의 오가노이드. 세포-세포 접합 형성에 의한 상당한 오가노이드 압축에 주목하라; 이 단계에서는 일부 세포 잔해가 섞여 있는 것이 정상입니다. (E) 분화 D10의 오가노이드. (F) 화살표는 길고 가늘고 자갈돌 같은 세포를 가진 iPSC 집락을 나타내며, 자발적 분화가 있을 가능성을 나타냅니다. 패널 A-E의 경우 스케일 바 = 1000 μm, 패널 F의 경우 스케일 바 = 400 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭하세요.

2. 면역염색을 위한 hCO의 수집 및 고정

1. 팁을 잘라낸 1000 μL 피펫을 사용해 hCO를 1.7 mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다. 모든 hCO가 옮겨지면 hCO가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 기다렸다가 과잉 배지를 부드럽게 제거하세요. hCO를 PBS로 1번 세척하고, hCO가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 몇 초간 기다린 후 과도한 PBS를 부드럽게 제거하세요.
2. hCO는 4% PFA가 포함된 상온에서 30분간 고정하세요.
   참고: 일부 항체는 최적의 성능을 위해 아세톤 또는 메탄올 고정이 필요할 수 있습니다. 제조사 지침을 참고하세요.

3. 전면 면역염색

1. 원하는 수의 고정 hCO를 1.7mL 마이크로 원심분리관에 옮깁니다. 고정액을 제거하고 0.1% Tween-20(PBS-T)이 함유된 PBS로 세척합니다.
   1. hCO를 세척할 때는 과도한 고정제를 최대한 제거하세요. 튜브 바닥의 hCO를 건드리지 않도록 주의하세요. PBS-T를 ~1mL 추가한 후 hCO가 튜브 바닥으로 가라앉을 때까지 몇 초간 기다린 후 다음 단계로 넘어갑니다.
2. 1차 항체를 염색액(신생아 송아지 혈청 10%, DMSO에 0.1% PBS-T)에 원하는 농도로 희석합니다. 마이크로 원심분리관당 50-100 μL의 1차 항체 용액을 추가하세요(각 튜브 내 모든 hCO를 덮을 수 있을 만큼의 부피).
3. 셰이커/로커 위에서 4°C에서 24시간 부양하세요. 과잉 1차 항체를 제거한 후 상온에서 PBS-T 안에서 1시간 동안 세 번 세척합니다. 과도한 항체가 제거되었는지 확인하기 위해 PBS-T 4°C에서 하룻밤 동안 세척을 실시하세요.
4. 2차 항체를 염색액에서 원하는 농도로 희석하고, 미세원심분리관당 50-100 μL의 항체 용액을 첨가합니다(각 튜브 내 모든 hCO를 덮을 수 있을 만큼의 부피).
5. 2차 항체와 함께 2차 항체를 4°C에서 24시간 동안 진동 플랫폼에서 배양합니다. 과도한 2차 항체를 제거한 후 상온에서 PBS-T에 1시간 동안 세 번 세척합니다. 과도한 항체가 모두 제거되도록 PBS-T 4°C에서 하룻밤 동안 세척을 실시하세요.
6. 전체 마운트 이미징을 위해서는 팁이 잘린 1000 μL 피펫을 사용해 hCO를 양전하를 띤 유리 슬라이드로 옮깁니다. 과잉 PBS-T를 제거하고 hCO를 덮을 마운팅 매체 몇 방울을 추가하세요. 조심스럽게 덮개 슬립을 놓아 hCO를 평평하게 만드세요.
   참고: hCO의 3D 구조를 보존하기 위해 슬라이드 가장자리에 고무 가스켓이나 양면 테이프를 사용해 커버 슬립의 높이를 높이는 것이 좋습니다. 클리어링 마운팅 매체를 사용하면 hCO를 통한 영상 개선에 도움이 될 수 있으며, 특히 hCO가 평평하지 않은 경우에 더욱 그렇습니다.

4. 단면 및 임베딩

1. 고정 후에는 4°C에서 30% 자당에 하룻밤 동안 HCO를 덮어 냉동 보호를 하세요. 팁이 잘린 1000 μL 피펫을 사용해 원하는 수의 hCO를 12mm x 12mm 플라스틱 몰드에 옮깁니다. 과도한 자당 용액을 조심스럽게 제거하되, hCO가 흡입되지 않도록 주의하세요.
   참고: 이사 전에 피펫 팁에서 30% 자당을 위아래로 피펫팅해 hCO가 팁 옆면에 달라붙는 것을 방지하는 것이 도움이 됩니다.
2. OCT를 소량 첨가해서 hCO를 덮을 만큼만 추가하세요. 가는 핀셋이나 피펫 팁을 사용해 OCT에서 hCO를 부드럽게 재배치하여 hCO가 뭉치지 않고 몰드 가장자리 근처에 hCO가 없도록 합니다. 모든 hCO가 금형 바닥에 최대한 가깝게 배치되어 단일 냉동 절개 과정에서 발견되는 hCO의 수를 극대화하는 것이 목표입니다.
3. 이 OCT 초기 층을 얼리려면 몰드를 스티로폼 쿨러에 넣고 바닥에 드라이아이스를 덮어 냉동하세요. OCT가 굳을 때까지 몇 분간 기다린 후 드라이아이스에서 곰팡이를 작업대로 옮기세요. 몰드가 채워질 때까지 추가 OCT를 추가하세요. OCT 첫 번째 층이 완전히 녹을 때까지 기다렸다가 다시 드라이아이스로 넘어가세요.
4. 냉동 상태로 내장된 hCO는 -80 °C에 보관하여 냉동 절부 준비가 될 때까지 보관하세요.
5. 절단 준비가 되면 hCO 블록을 최대한 잘 정렬하고 블록을 다듬기 시작하세요. 주기적으로 충전된 슬라이드에 섹션을 올려놓고 각 섹션을 육안으로 검사하여 hCO가 있는지 확인하세요. hCO를 시각화하면 6 μm 단면으로 변경합니다.
   참고: 임베딩과 절단 시 hCO의 소멸률은 최소 10%입니다. 그에 맞게 계획을 세우세요.

5. TUNEL 및 면역염색 조직 절편

1. 자궁경부암펜을 사용해 염색이 필요한 조직 부위에 소수성 테두리를 그려보세요. PBS 0.1% 트윈(PBS-T)에 한 번 슬라이드를 넣어 OCT를 녹입니다.
2. 차단 완충제(10% 신생아 송아지 혈청, 1% DMSO, PBS-T)를 상온에서 1시간 동안 추가하세요.
3. 1차 항체 용액을 준비하세요. 제조사에서 권장하는 면역형광 농도로 시작하되, 농도는 경험적으로 조절해야 할 수도 있습니다.
   참고: 또는 제조사 프로토콜에 따라 이 시점에 TUNEL 염색을 수행할 수도 있습니다.
4. 슬라이드에서 차단 버퍼를 제거하세요. hCO 절편을 덮을 만큼 충분한 1차 항체 용액을 추가하세요. 1차 항체를 4°C에서 하룻밤 또는 37°C에서 3시간 인큐베이팅합니다. PBS-T가 담긴 코플린 병에 3번씩 5분씩 슬라이드를 실온에서 세척하세요.
5. 차단 완충액에 2차 항체 염색액을 준비하며, 여기에는 DAPI 또는 다른 범핵 마커가 포함됩니다. hCO 단면을 덮을 만큼 충분한 2차 항체 염색액을 첨가하세요. 빛을 차단한 상태로 1시간 동안 실온에서 배양하세요.
6. PBS-T가 담긴 코플린 병에 실온에서 3번 5분간 세척하세요. 원하는 마운팅 매체가 포함된 커버슬립으로 장착하세요.

6. CardioCount와 관련된 핵 공동 위치 정량화

참고: CardioCount는 현미경 이미지에서 CM 핵을 점수화하는 딥러닝 기반 방법입니다⁴⁰. 원래 CM 사이클링을 평가하기 위해 개발된 CardioCount는 TUNEL⁴⁰을 포함한 여러 핵 염색에 대해 우수한 성능을 보입니다.

1. CardioCount를 사용하려면 GitHub에서 CardioCount 패키지를 다운로드하거나 Google Colab(https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3)으로 가져오세요. CardioCount 버전 1은 Python 3 환경에서 실행됩니다.
2. 이미지를 512 x 512 픽셀 .tif 개별 파일로 내보내 빨강, 파랑, 초록 채널을 합쳐 놓으세요. 여기서 빨간 채널은 CM 핵 마커, 파란색은 일반 핵 마커, 초록은 순환 핵 마커(예: Ki67) 또는 세포자사자 마커(예: TUNEL)입니다. 이 실험을 위해 구글 드라이브에 부모 폴더를 만들고 병합된 tiffs를 하위 폴더로 업로드하세요.
   참고: CardioCount는 핵을 채우는 핵 착색에 대해 훈련되었습니다. 오로라 B나 PH3처럼 더 닳은 사이클링 마커는 CardioCount와 호환되지 않을 수 있습니다.
3. 구글 콜랩에서 CardioCount 노트북을 열어보세요. 그래픽 처리 장치(GPU) 접근 여부를 확인하기 위해 Cell 1.1을 실행하세요. Cell 1.2를 실행해 CoLab Notebook을 Google Drive에 연결하세요.
4. Google Colab에서 CardioCount와 의존성을 불러오기 위해 Cell 1.3을 실행하세요. k파일을 편집해서 다운로드 시 저장된 PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries 폴더의 경로명을 읽으세요.
5. 셀 2.0에서는 편집 base_folder 경로명을 읽어 분석할 이미지의 하위 폴더가 있는 부모 폴더로 읽습니다. Cell 2.0을 실행해서 이 폴더를 CoLab에 연결하세요.
6. 셀 2.1.1에서는 분석용 이미지가 포함된 폴더 이름과 일치하도록 orig_image_folder을 수정하세요. channel_to_remove를 초록색으로 읽게 하고, new_image_folder base_folder 아래에 있는 하위 폴더 이름을 편집하세요. 이 하위 폴더는 초록색 채널이 제거된 모든 이미지(빨강/파랑)가 저장됩니다. 이 과정을 반복해서 빨간 채널을 제거하고, 빨간 채널이 제거된 이미지(초록/파랑)가 포함된 하위 폴더를 new_image_folder 편집해 구분하세요.
7. 셀 2.1.2에서는 빨강/파랑 이미지의 이미지를 512 x 512로 크롭합니다. uncropped_image_folder가 6.6단계에서 생성된 new_image_folder 이름과 일치하는지 확인하세요. 빨강/파랑 이미지에 대한 설명입니다. destination_image_folder 이름을 지정해 잘라진 빨강/파랑 이미지가 저장될 하위 폴더를 지정합니다. 이 과정을 반복해서 초록색/파란색 이미지를 잘라내세요. 마지막으로, 이 과정을 반복하여 base_folder에 보관된 원래 3채널 합쳐진 tiffs를 자릅니다.
8. Cell 2.2를 실행해 확률 맵을 생성하세요. 이름data_specific_folder 셀 2.1.2에서 destination_image_folder에서 생성된 빨강/파랑 및 초록/파랑 이미지의 이름입니다. model_dir 경우, 세그멘테이션 모델이 포함된 폴더에 파일 경로를 입력하세요. 적핵을 분할하려면 모델 erg_rb_opt을 사용하고, 에포크는 200을 입력하세요. probmap_directory_name 이름을 바꿔서 빨간색/파란색 확률 맵이 저장되는 폴더를 지정하세요. 이 과정을 초록색/파란색 이미지에 대해서도 반복하세요. 녹색 핵을 분할하려면 모델 edu_mouse_bg_opt을 사용하고 에포크를 입력하세요.
9. 셀 2.3.1에서는 6.8단계에서 생성된 확률 지도를 바탕으로 객체 지도가 생성됩니다. 이 input_folder는 셀 2.1.2에서 생성된 빨강/파랑 확률 지도 이미지를 포함하는 셀 2.1.2의 destination_image_folder에서 이름을 따서 명명될 것입니다. 임계값이 있는 빨강/파랑 이미지가 저장될 output_folder를 지정하세요. 핵 분할에 대한 신뢰 수준 임계값을 설정하세요(범위 0.0-1.0). 셀 2.3.1을 실행하세요. 이 과정을 초록색/파란색 이미지에 대해서도 반복하세요.
   참고: 핵에 대한 신뢰 수준 임계값은 데이터셋에 따라 다릅니다. 0.9의 임계값으로 시작해, 너무 관대하면 더 높게, 너무 엄격하면 확률 맵을 무작위로 검사해 낮게 조정하세요.
10. 셀 2.3.2에서는 6.10단계에서 생성된 객체 맵의 셀 수를 집계하여 .csv 파일로 내보냅니다. count_folder은 2.3.1 셀의 output_folder에서 명명되며, 이 은 임계값이 측정된 빨강/파랑 이미지가 저장됩니다. 이미지 경계에 닿는 객체를 제외하려면 ignore_border_cells True로 읽도록 하세요. csv_path 이름을 모든 하위 폴더가 저장된 base_folder의 경로명으로 바꾸세요. csv 이름을 수정해서 빨간색/파란색 객체의 수를 반영하세요. 이 과정을 파란색/초록색 이미지에 대해 반복하세요.
11. 셀 2.4에서는 녹색/빨간색 이중 양성 핵을 세게 됩니다. img_folder 이름을 6.8단계에서 생성한 3채널 잘린 하위 폴더 이름으로 변경하세요. childcell_folder 이름을 2.3.1 셀의 output_folder로 변경하세요. 여기서 임계값이 표시된 빨강/파랑 이미지가 저장됩니다. parentcell_folder 이름을 2.3.1 셀의 output_folder으로 변경하세요. 여기서 초록/파란색 임계값이 저장된 이미지입니다. 더블 포지티브 객체 맵이 저장될 폴더를 지정하도록 dest_folder 이름을 변경하세요. csv_path 이름으로 경로명과 파일 이름을 모든 하위 폴더가 저장된 base_folder에 지정하고, csv 이름을 수정해 이중 양성 객체의 수를 반영하세요.
12. 이미지당 생성된 빨강, 초록, 이중 양성 카운트를 원본 이미지와 비교하여 정확한 분할을 검증합니다.
    1. CardioCount가 영상 내 핵 수를 블라인드 리뷰어가 계산하는 것보다 지속적으로 과대평가한다면, 신뢰도가 높은 6.9단계를 반복하고 6.10-6.11단계를 반복합니다. CardioCount가 영상 내 핵 수를 블라인드 리뷰어가 계산하는 것보다 과소평가한다면, 신뢰 임계값을 낮게 하여 6.9단계를 반복하고 6.10-6.11단계를 반복합니다.
13. 적색핵, 녹색핵, 이중 양성 핵의 각 hCO에 대한 모든 카운트를 합산합니다. 각 오가노이드별로 (이중 양성 핵 / 총 적색 CM 핵) x 100으로 사이클링 핵 비율을 계산합니다.

7. 저산소증-산소 재산소 손상

1. 저산소증 배지(119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1.2 mM NaH₂PO₄, 1.3 mM MgSO₄, 0.5 mM MgCl₂, 0.9 mM CaCl₂, 20 mM 젖산나트륨, 5 mM HEPES, pH = 6.4⁾⁵.
2. 세포 배양 플라스크에 96웰 hCO 플레이트당 5mL의 저산소 배지를 전달합니다. 세포 배양 플라스크를 저산소 챔버 안에 넣고, 5%_CO2, 95%_N2 무산소 가스로 3분간 세척합니다. 저산소증을 시작하기 전에 최소 1시간 이상 37°C에서 적어도 1시간 동안 적게 배양하세요.
3. 모든 배지가 수화체에서 제거됩니다. 모든 웰에서 멀티채널 피펫으로 ~150 μL를 제거하는 것부터 시작하세요. 그 후 200 μL 피펫을 사용해 hCO를 방해하지 않고 개별 웰에서 남은 배지를 조심스럽게 제거합니다.
   참고: 모든 유정에서 매질을 제거하는 것은 재현 가능한 손상을 달성하는 데 매우 중요합니다.
4. 각 웰에 50 μL 저산소 매체를 추가하세요. hCO 플레이트를 저산소 챔버에 넣고 무산소 가스(5%_CO2, 95%_N2)로 3분간 세척합니다. 저산소증 챔버를 인큐베이터 37°C에서 6시간 동안 보관하세요.
5. 재산소화를 시작하려면 저산소실에서 hCO를 제거하고, 150 μL 미리 가열한 RB+ 배지를 공급합니다. 하류 분석을 수행하기 전에 37°C에서 최소 3시간 이상 재산소화를 허용하세요.

8. 낙산 탈수소효소 방출 분석법

1. 재관류 시작 후 원하는 시점에 손상 및 손상되지 않은 hCO의 웰에서 20 μL 배지를 수집합니다. 1:10을 180 μL LDH 저장 버퍼(200 mM 트리스-HCl(pH 7.3), 글리세롤 10%, BSA 1%에 희석). 분석이 완료될 때까지 -20°C에서 보관하세요. 수집 전에 여러 번 위아래로 피펫을 움직여 혼합하세요
2. 냉동 매체가 해동되었습니다. 각 미디어 샘플을 분석할 때 검은 벽 바닥이 투명한 96웰 플레이트의 한 웰에 45 μL LDH 저장 버퍼를 추가합니다. 각 웰에 1:10 희석 배지 5μL을 추가하여 최종 희석 비율을 1:100으로 만듭니다. 각 샘플에 대해 50 μL LDH 검출효소 혼합물과 0.25 μL 환원효소 기질을 혼합하여 LDH 검출 시약을 준비합니다.
3. 각 웰에 1:100 희석 배지를 포함한 각 웰에 50 μL LDH 검출 시약을 추가합니다. 실온에서 빛을 차단한 상태로 60분간 배양하세요. 호환 판 리더기에서 생물발광 신호 분석.

9. 칼슘 영상

1. 페놀 레드 프리 RPMI-1640, 0.04% 플루로닉, 5 μM Cal520-AM으로 칼슘 염색 용액을 준비합니다. 샘플을 빛으로부터 보호하세요.
2. 칼슘 영상 촬영을 위해 각 웰에서 100 μL의 매체를 제거하세요. 칼슘 염색 용액 100 μL을 추가하고 빛을 차단한 채 37 °C에서 30분간 배양합니다.
3. 각 웰에서 칼슘 염료가 포함된 배지 100 μL를 제거하고, 대신 100 μL 페놀 레드 프리 RPMI-1640으로 교체합니다. 염료가 씻겨 나갈 때까지 37°C에서 30분에서 1시간 정도 부양하세요.
4. 연속 영상/스트리밍 기능이 있는 현미경을 사용해 96웰 초저면 부착판을 작업 위치에 배치합니다. 10배 대물렌즈로 hCO의 베이스를 확인하고 Cal520 과도현상을 관찰하세요.
5. 상온에서 칼슘 과도현상을 30초 녹화하세요. 공초점 현미경을 사용하면 전체 hCO를 관통할 수 없습니다. 칼슘 과도기 동안 세포 윤곽이 보이는 hCO의 기저부 근처의 초점면을 선택하세요.

10. 칼슘 과도 분석 (그림 3)

1. 칼슘 과도 분석은 다양한 피크 분석 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 아래는 Spiky ImageJ 플러그인⁴¹ (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/)을 사용한 분석 지침입니다.
2. 각 hCO의 가시광 셀 간에 2 x 2 픽셀 관심 영역(ROI) 다섯 개를 ROI 매니저에 추가합니다. 세포 핵이나 세포 경계와 ROI가 겹치지 않도록 주의하세요. hCO의 움직임이 일시적 분석에 영향을 줄 수 있습니다.
3. 분석 > 세트 측정값 항목에서 평균 회색 강도를 선택하세요. ROI 관리자에서 다중 측정( Multi-Measure )을 선택하여 모든 ROI와 녹화 프레임에서 평균 회색 강도를 캡처합니다.
4. 모든 투자 수익률(ROI)의 평균 회색 강도가 포함된 .csv 파일을 저장하세요. 각 이미지의 모든 ROI 위치를 나중에 참고할 수 있도록 저장하세요.
5. 새 스프레드시트에서 Time(s) 열을 추가하세요. 각 프레임에서의 시간을 30초를 총 프레임 수로 나누고, 프레임 번호를 곱하여 계산합니다. 이건 편집된 .csv으로 저장해.
6. 피지에서 편집된 .csv 파일을 열고 Spiky 플러그인을 엽니다. 분석 옵션에서 원하는 분석 매개변수를 선택하세요.
7. X축에는 플롯 시간, Y축에는 ROI #1의 평균 회색 강도가 표시됩니다. 피 크 분석(Analyze Peaks)을 선택하고, 기준선, 피크 시작/종료, 피크 진폭의 정확한 주석을 확인하세요. 잘못된 피크 수가 확인되면 분석 옵션에서 기준선의 최소 피크 진폭을 포함한 매개변수를 변경하고, 피크 식별이 성공할 때까지 피크 임계값부터 시작합니다.
8. 모든 중간 파일을 저장하세요. 분당 박동(bpm)은 각 ROI의 피크 투 피크 간격 평균으로 60을 나누어 계산할 수 있습니다.
9. 위의 분석을 모든 hCO당 ROI에 대해 반복하세요.

그림 3: 칼슘 과도 분석. (A) 빨간 상자는 분석 매개변수를 선택할 수 있는 드롭다운 메뉴를 여는 버튼을 나타냅니다. (B) 빨간 상자는 대표적인 부상 없는 hCO 내 ROI에서 시간 (s) 대 평균 회색 강도를 표시하는 버튼을 나타냅니다. (C) 빨간 상자는 피크 분석을 선택하는 버튼을 나타냅니다. (D) 손상되지 않은 hCO에서 대표적인 칼슘 일시적 및 피크 분석. 빨간 삼각형은 최대치를, 분홍색 사각형은 최대치의 상행과 하행 사각, 초록색 박스는 최대치, 파란 칸은 기준선을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

위 프로토콜을 따르면 분화 7일에서 12일(D7-12) 사이에 박동을 시작하는 잘 형성된 hCO가 생성됩니다. hCO가 25일째를 지나면 전기 박동 없이는 자발적 수축이 더 이상 보이지 않을 수 있습니다. H/R 손상은 hCO가 뛰기 시작한 후 언제든지 시행할 수 있으며, 보통 15일(D15) 또는 그 이후에 손상을 시행합니다.

부상 확인
인간 심근경색과 마찬가지로, H/R 손상은 세포 사멸을 초래합니다. 임상적으로, LDH, 심장 트로포닌, 마이오글로빈, 크레아틴 키나아제와 같은 세포 사멸로 방출되는 단백질을 측정하여 심근 손상의 정도를 평가할 수 있습니다. 마찬가지로, H/R 손상 후 hCO의 배지에서 LDH 방출을 쉽게 측정할 수 있습니다. 그림 4A 는 상업적으로 이용 가능한 마이크로플레이트 기반 생물발광 분석법을 사용하여 ...

토론

여기서는 H/R이 있는 자가 조립 hCO를 생성하고 손상시키는 단계별 프로토콜을 제시합니다. 허혈성 심장 질환은 심근세포 사망, 섬유화 재형성, 전기 기능 장애, 기능 저하 등 병태생리적 재형성이 특징입니다. 이러한 교란은 hCO 모델 시스템에서 관찰되며, 여기에는 TUNEL⁺ CMs 증가, LDH 방출 증가, Vimentin⁺ 조직 면적 증가, 그리고 기능적 동기화 상실로 인한 칼슘 취급 변화 등이 포함됩니다. 중요한 점은, hCO가 상대적으로 미성숙함에도 불구하고 조직 재생의 증거를 보이지 않는다는 것입니다. 따라서 이 H/R 모델은 장기간의 성숙 프로토콜 없이 재생 중재를 시험하는 실용적인 플랫폼이 될 수 있으며, 심장 보호 치료제에 대한 선별도 할 수 있습니다.

hCO를 생성하는 다양한 프로토콜이 존재하며, 이 프로토콜은 2021년 Hofbauer 등이 처음 설명한 2D-3...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아큐타제 용액	시그마-올드리치	A6964-500ML
항심장 트로포닌 T 항체	앱캠	EPR20266
B-27 보충제(50X), 혈청 무첨가	깁코	17504044
인슐린 제외 B-27 보충제	깁코	A1895602
바이오텍 시너지 네오2 플레이트 리더기	바이오텍
캘리포니아-520, AM	AAT 바이오퀘스트	21131
카디오카운트 V1	카라 연구소	PMID: 38984052
세포주 (Homo sapiens, 남성) - DU11 iPSC 계통	듀크 대학교 줄기세포 코어
충전 현미경 슬라이드, 흰색 유리	VWR	89500-496
CHIR 99021	토크리스	4423
클론R	스템셀 테크놀로지	5888
코닝 96-웰 클리어 초저 부착 마이크로플레이트	피셔	7007
일회용 피펫팅 저장소	VWR	89094-678
DMEM/F-12, HEPES	깁코	11330057
EVOS 형광 현미경	EVOS
겔트렉스 저축성장인자 저막 매트릭스, LDEV 무첨가, 줄기세포 인증	깁코	A1413302
인간 활성인 재조합 단백질	페프로텍 주식회사/라이프 테크놀로지	120-14E-50UG
IWP-2	스템셀 테크놀로지	72124
L-아스코르브산 (결정성/인증된 ACS)	피셔 사이언티브	A61-100
마우스 항비멘틴	DSHB	AMF-17b
mTeSR 플러스	스템셀 테크놀로지	100-0276
멀티웰 세포 배양 플레이트 & ndash; 12 우물	VWR	10062-894
플루로닉 F-127	시그마-올드리치	P2443
릴레SR	스템셀 테크놀로지	100-0483
RPMI 1640 미디엄	깁코	11875119
RPMI 1640 미디엄, 페놀 레드 없음	깁코	11835-030
티아조비빈	스템셀 테크놀로지	72254
티슈텍 O.C.T. 복합물	사쿠라 파인텍 미국 주식회사 (VWR)	25608-930
자이스 회전 디스크 공초점 현미경	자이스