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방법 논문

공기 액체 계면에서 분화된 마우스 기관 상피 세포 배양에서 질소 산화물 생성 측정

130 조회수

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DOI:

10.3791/70311

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2026년 7월 3일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 삼이오다이드 기반 화학발광 분석법을 이용해 위단 분비물(ALI)에서 분화된 기도 상피 배양에서 일산화질소(NO) 생성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

초록

기도 상피 배양은 공기-액체 경계면(ALI)에서 분화된 상태로, 섬모세포 내 일산화질소(NO) 신호 전달을 연구하는 생리학적으로 중요한 모델을 제공합니다. 여기서는 ALI 분화 마우스 기관 상피 세포에서 채취한 샘플에서 NO의 안정적인 산화 생성물인 아질산염(NO₂⁻)을 측정하여 NO 생성을 정량화하는 프로토콜을 설명합니다. 최첨단 세척액, 기저 배지 및 세포 용해액은 삼요오다이드 기반 화학발광 분석법과 산화질소 분석기(NOA)를 사용하여 수집 및 분석됩니다. 반응 용기에 주입되면 아질산염은 화학적으로 NO로 환원되며, 이는 오존 기반 화학발광으로 검출됩니다. 신호 강도는 표준 보정 곡선을 사용하여 아질산염 피코몰로 정량화되며, 값은 총 세포 단백질 함량으로 정규화됩니다. 분석 성능은 NO 농도의 약리학적 조절을 통해 검증됩니다. NO 공여제 디에틸렌트리아민 노노에이트(DETA-NONOate)와 NO 합성효소 억제제 N(ω)-니트로-L-아르기닌 메틸 에스터(L-NAME)로 치료 후, 질환 간 아질산 수치에 유의미한 차이가 관찰되었습니다. 가장 견고하고 재현 가능한 신호는 기도 상피에서 방출되는 NO의 양에 대응하는 끝 세척에서 관찰됩니다. 이 방법은 ALI 분화 기도 상피 샘플에서 NO를 신뢰성 있게 검출하여, NO 생성과 비정상 NO 대사와 관련된 질병을 정량화할 수 있는 정확한 시험관 내 플랫폼을 제공합니다.

서론

천식, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD), 낭포성 섬유증(CF), 원발성 섬모 운동장애(PCD) 등 여러 기도 질환의 특징 중 하나는 질소 산화물(NO) 항상성의 변화로, 이는 내쉴 때 NO 수치 변화로 측정 가능하며, 이는 COPD와 천식에서 크게 증가하는 반면 CF와 PCD3에서는 크게 감소합니다. 4. 이 질환들은 점액 섬모 제거의 주요 효과자인 기도 상피 운동성 섬모에 이상을 보인다5. NO와 그 하위 신호 전달 경로가 섬모 운동성의 중요한 조절자이기 때문에, 이러한 맥락에서 NO 생성과 신호 전달이 어떻게 변화하는지 이해하는 것은 점모 기능 장애의 기전을 밝히는 데 필수적입니다. 따라서 기도 상피에서 NO 생성 및 방출을 정밀하게 감지할 수 있는 방법은 이 신호 분자의 조절 및 생리적 역할을 해부하는 데 귀중한 도구를 제공합니다. 이러한 접근법은 NO의 짧은 반감기와 빠른 반응성 때문에 직접 측정이 어려운 실험 환경에서 특히 유용합니다.

NO는 섬모세포의 극성과 운동성 섬모의 조율박동에 영향을 줌으로써 기도 섬모의 생합성과 기능을 조절합니다. 그러나 기도에서 항상성을 유지하지 못하는 메커니즘은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 공기-액체 경계면(ALI)에서 분화된 기도 상피 배양은 이러한 메커니즘을 연구하는 데 유용한 시험관 내 시스템을 제공합니다. 현재 이 모델은 기도 상피에 대한 환경 자극 연구와 기도 질환의 병태생리를 밝히는 데 널리 사용되고 있습니다. 기존 수중 배양13,14와 비교할 때, ALI 분화 상피는 상피 극성, 점액 분화, 현실적인 기체-액체 교환 등 고유 기도의 구조와 기능을 더 충실히 재현하여 특히 첨단 NO 방출, 신호 전달 및 관련 섬모 기능 연구에 적합하다. 따라서 이 시스템은 특히 상피 분화나 약리학적 조작 조건에서 기도 내강으로 방출되는 NO-유래 대사산물을 정량화하는 실험에 매우 적합합니다.

NO 농도의 정확한 측정은 매우 중요하며, 과도하거나 부족한 NO 수치는 섬모 기능을 저해할 수 있습니다. 현재 NO 검출을 위한 형광 프로브 기반 방법(예: 디아미노플루오레세인, DAFs)은 반정량적이며, pH 민감도, 산소 의존성, 특이성 부족으로 인해 세포 산화제와 항산화제와 반응할 수 있어 준정량적 측정이 가능하다15. 또한, 전기화학 센서(예: NO 감응 암페로메트릭 전극)는 NO16의 실시간 검출을 가능하게 하지만, 반감기가 짧지 않고, 전극 표면의 산화환원 활성 종 바이오오염 간섭, 그리고 안정적인 보정 유지에 어려움이 있어 복잡한 생물학적 시스템에서는 구현이 어려울 수 있습니다17. 직접 기상 NO 검출과 다양한 질소산화물 종을 표적으로 하는 환원 분석법 등 대체 화학발광 기반 접근법도 기술되었으나, 기도 상피 배양에 대한 적용은 아직 탐구되지 않았습니다. 이러한 한계는 소량 생물 샘플에서 NO 유래 종의 저농도를 신뢰성 있게 검출할 수 있는 민감하고 정량적인 방법의 필요성을 강조합니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 ALI 분화 기도 상피에서 채취한 첨단 분비물에서 NO를 산화질소분석기(NOA)를 사용하여 정량화하는 프로토콜을 수립하였습니다. NOA는 전통적으로 화학 샘플 내 NO 대사산물 측정에 사용된 고감도 화학발광 기반 검출기로, 최근에는 혈액, 조직 균질체, 세포 배양 상원액 7,18,19 등 생물 시료 분석에도 적용되었습니다. NO는 정상 산소 농도 조건에서 조직 내에서 매우 짧은 반감기를 가지며 매우 반응성이 높은 신호 분자입니다. 따라서 NO 산화의 최종 산물인 아질산염은 생물학적 시스템 내 총 NO 생성의 지표가 됩니다 20,21,22. 이 민감하고 재현 가능한 화학발광 방법은 피코몰라 수준23,24에서 아질산염/NO를 검출할 수 있게 하여, MTEC ALI 배양에서 유래한 저부피 생물 샘플의 작은 변화를 측정하는 데 이상적입니다. 그러나 이 접근법은 아질산 축적이 최근 NO 생성을 반영하고 샘플 취급, 배경 아질산염 오염, 상피 분화 상태 등의 요인에 영향을 받을 수 있는 조건에 가장 적합합니다. 따라서 결과의 정확한 해석을 위해서는 적절한 대조군과 신중한 실험 설계가 필요합니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 메릴랜드 대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(프로토콜 # AUP–00004632)에서 검토 및 승인되었습니다.

참고: 프로토콜은 마우스 기관 상피세포(MTEC) 분리에 약 2일, 확장에 7–10일, 트랜스웰 삽입물 내 증식에 5–6일, 분화(충분한 다연모세포 획득에 필요한 시간)에 21일, 약물 치료 24시간, 샘플 채취, NOA 교정을 위해 추가로 1일을 요구합니다. 인젝트와 데이터 수집.

1. 배지 및 용액 준비

참고: 미디어 성분에 대한 자세한 내용은 표 1 을 참조하십시오.

  1. 햄의 F-12 미디어
    1. 멸균된 층류 후드 안에서 용액을 준비하세요. 멸균 병에 100× 페니실린/스트렙토마이신 항생제 5mL와 암포테레신 B(균류) 0.5mL를 햄스 F12 배지균에 넣습니다.
    2. 병을 5–10번 부드럽게 뒤집어 완전히 섞으세요. 0.22 μm 필터를 사용해 무균 조건에서 용액을 멸균한 후 4 °C에서 보관합니다.
      주의: 페니실린/스트렙토마이신과 암포테리신 B는 자극이나 알레르기 반응을 일으킬 수 있는 항균제입니다. 장갑과 실험복 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하세요.
  2. 프로나제 해액
    1. 멸균관 내 멸균된 햄스 F12 배지 10mL에 프로나제 15mg을 첨가하여 0.15% 프로나제 용액을 얻습니다. 프로나제가 완전히 녹을 때까지 부드럽게 뒤집거나 피펫팅으로 위아래로 섞으세요. 사용 직전에 신선하게 준비하세요.
  3. DNase I 용액
    1. 5mg의 조잡한 췌장 DNase I를 햄스 F12 배지 9mL와 10 mg/mL 소 혈청 알부민(BSA) 용액 1mL를 멸균관 안에 첨가하여 0.5 mg/mL DNase I 용액을 얻습니다.
    2. 피펫팅을 위아래로 부드럽게 섞어 DNase I가 완전히 용해될 때까지 조절하여 기포 형성을 방지하세요. 완전히 녹으면, 용액을 1mL 무균 마이크로 원심분리관에 알리코틀하여 -20 °C에서 보관합니다.
  4. 태아 소 혈청(FBS)을 사용한 햄의 F12 배지입니다
    1. 멸균된 층류 후드 안에서 실온에서 용액을 준비하세요. 멸균된 원뿔형 튜브에서 10mL의 태아 소 혈청(FBS)을 항생제와 함께 햄스 F12 배지와 함께 40mL에 첨가하여 F12 배지에 20% FBS를 얻습니다.
    2. 튜브를 5–10번 뒤집어 용액이 균질해질 때까지 부드럽게 섞으세요. 0.22 μm 필터를 사용해 무균 조건에서 용액을 멸균한 후 4 °C에서 보관합니다.
  5. MTEC 확장 미디어
    1. MTEC 팽창 매체를 멸균 병에 넣어 멸균 층류 후드 내에서 상온에서 준비합니다.
    2. 용기를 부드럽게 돌리거나 뒤집어 모든 성분이 완전히 섞일 때까지 충분히 섞으세요. 0.22 μm 필터를 사용해 무균 조건에서 용액을 소독합니다.
    3. 사용 직전에 ROCK 억제제 Y–27632(5 mM 스톡 용액)를 최종 농도 10 μM에 첨가하고, Notch γ-세크라타제 억제제 DAPT(10 mM 스톡 용액)를 5 μM 최종 농도로 첨가한 후 부드럽게 반전하여 혼합합니다.
  6. MTEC 확산 미디어
    1. 표 1에 나열된 성분들을 결합하여 무균 층류 후드 내에서 MTEC 증식 배지를 준비합니다.
    2. 모든 성분이 완전히 섞일 때까지 부드럽게 역전이나 소용돌이치며 충분히 섞으세요. 0.22 μm 필터를 사용해 무균 조건에서 배지를 살균합니다.
    3. 사용 직전에 ROCK 억제제 Y–27632(5 mM 스톡 용액)를 최종 농도 10 μM에, 레티노산(5 μM 스톡 용액)을 최종 농도 0.05 μM로 첨가합니다. 사용 전에 부드럽게 전전하여 혼합합니다.
  7. MTEC 차별 매체
    1. MTEC 분별 배지를 무균 용기 내에서 무균 층류 후드 내에서 상온에서 준비하여, 표 1 에 나열된 성분들을 결합합니다.
    2. 모든 성분이 완전히 섞일 때까지 부드럽게 역전이나 소용돌이치며 충분히 섞으세요. 0.22 μm 필터를 사용해 무균 조건에서 배지를 살균합니다.
    3. 사용 직전에 레티노산을 최종 농도인 0.05 μM으로 첨가한 후 부드럽게 역전하여 혼합합니다.

2. 마우스 기관 상피세포 분리(MTEC)

  1. 기관 IACUC 지침에 따라 승인된 안락사 챔버에서 이산화탄소(CO2) 흡입하여 8주에서 20주 된 성체 쥐 3마리를 안락사시킵니다. 조직 채취 전에 사망 확인.
  2. 동물을 등쪽(가슴이 위를 향하게)을 무균 표면에 올려놓으세요. 깨끗한 겸자를 사용해 피부를 부드럽게 들어 올린 뒤, 아랫입술에서 복부까지 수술용 가위로 열어 기관을 노출시킵니다.
  3. 침샘을 옆으로 옮기고 결합 조직과 기관근을 제거하여 연골 고리를 노출시키세요. 기관 전체를 해부한 뒤, 멸균된 햄스 F12 배양지가 들어있는 페트리 접시에 넣으세요. 한 접시에 세 개의 기관을 합치세요.
  4. 접시를 층류 후드로 옮기고, 기관을 신선한 햄스 F12 미디엄이 있는 다른 접시에 옮기세요. 기관외 조직을 제거하고 기관을 내강을 따라 길게 절단하세요.
  5. 모든 기관을 멸균된 10 mL 0.15% 프로나제 용액이 들어 있는 50 mL 스크류캡 원뿔 튜브에 옮깁니다. 4°C에서 16–18시간 배양합니다.

3. 세포 분리 및 초기 증식

  1. 다음 날에는 조직이 담긴 튜브를 10–15번 뒤집어 상피 세포를 분리하고 4°C에서 45분간 배양합니다. 프로나제 반응을 멈추려면 20% FBS가 포함된 햄스 배지 10mL를 추가하고, 10–15번 뒤집어 혼합합니다.
  2. FBS가 포함된 햄스 F12 배양지 10 mL를 15 mL 튜브 3개에 추가합니다. 파스퇴르 피펫을 사용해 50 mL 튜브에서 첫 번째, 두 번째, 세 번째 15 mL 튜브로 기관 조직을 차례로 옮기고, 각 튜브에서 10–15번 역전시켜 기관 상피 세포를 분리합니다. 최종 이식 후에는 조직을 버리세요.
  3. 15mL 원뿔형 튜브 세 개에 있는 전체 배지를 50mL 튜브에 담은 배지를 결합합니다. 원심분리기 360 × g에서 4 ° C에서 10분간 돌립니다. 상청액을 조심스럽게 제거하고 0.5 mL DNase I 용액을 0.5 mL 첨가합니다. 얼음 위에 5분간 부화시키세요.
  4. 360 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기. 상정액을 조심스럽게 버리고 세포 펠릿을 7–10 mL MTEC 확장액에 재현탁합니다.

4. MTEC의 확장 및 차별화

  1. 콜라겐 코팅 T75 세포 배양 플라스크를 50 μg/mL 용량의 콜라겐 I(쥐 꼬리) 10mL를 준비하고 37 °C에서 16–18시간 배양합니다. T75 플라스크에서 콜라겐 용액을 흡입한 후 PBS로 세 번 세척하세요 (1×). 플라스크를 완전히 마르게 하세요.
  2. 세포를 포함한 7–10mL의 MTEC 확장 배지를 콜라겐 코팅된 플라스크에 씨앗을 뿌립니다. 플라스크를 37°C,CO2 5%의 인큐베이터에 넣으세요. 팽창 배지를 2일에서 3일마다 교체하고, 셀 수(셀 수)를 70% 합류율까지 모니터링하세요.
  3. 70% 융합 상태에서 1mL Accutase 용액을 추가하고 37°C에서 10–15분간 배양하여 세포 단일층을 분리합니다. 세포를 10mL의 MTEC 증식 배지에 재현탁합니다. 1057 × g 에서 실온에서 5분간 원심분리기.
  4. 상청액을 버리고 세포를 증식 배지에 다시 부탁한 후 세포 수를 세세요.
  5. 씨앗 2× 5개의 세포가 0.5mL 부피에 트랜스웰 삽입물당 12mm(막 직경 12mm, 막 공당 0.4 μm)에 콜라겐으로 미리 코팅됨. 각 삽입물의 기저 챔버에 1.5mL 배지를 추가하고, 트랜스웰을 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
  6. 3일째에는 꼭대기와 기저 방 양쪽의 배지를 교체하여 세포가 보통 5일이나 6일째까지 100% 수합에 도달하도록 합니다. 대조군으로 세포가 없는 삽입물 하나를 포함하세요.
  7. 융합이 완료되면 0.5mL의 MTEC 분화 배지로 세포를 끝부분에서 세척합니다. 기저 챔버에만 0.75 mL의 분화 배지를 추가하여 공기-액체 인터페이스(ALI)를 시작하며, 세포는 꼭대기 챔버에 노출된 상태로 둡니다.
  8. 2–3일마다 분화 배지로 첨단 표면의 세포를 세척하고 기저 배지를 교체합니다. ALI에서 세포가 21일 동안 분화하도록 허용하세요.

5. 섬모 상피세포의 면역 표지 및 영상

  1. ALI 7, 14, 21일에 세포를 4% 파라포름알데히드(PFA)로 고정합니다.
  2. 운동성 섬모 형성에 필수적인 전사 인자인 FoxJ1을 검출하기 위해 항FoxJ1 항체로 세포를 면역표지하고, 출판된 프로토콜27,28,29에 따라 운동성 섬모의 구조적 표지자인 아세틸화 α-튜불린 항체를 검출하기 위해 항아세틸화 α-튜불린 항체를 검출합니다.
    주의: PFA는 유해 화학물질이므로 세포 고정 시 적절한 개인 보호 장비(최소한 니트릴 장갑과 실험복)를 착용하세요.
  3. 40× 또는 60× 대물렌즈를 사용하여 공초점 현미경으로 면역표지된 세포의 이미지를 획득합니다. 각 단계 크기가 0.5 μm인 깊이 10 μm 깊이의 Z-스택을 수집합니다.
  4. 레이저 출력, 검출기 이득 및 노출 설정을 설정하여 신호 포화를 피하고 샘플 간 유사 획득 매개변수를 유지합니다.
  5. FIJI 영상 소프트웨어의 세포 카운터 플러그인을 사용하여 FoxJ1 양성 세포 또는 아세틸화 튜불린 양성 세포를 관심 영역별 전체 세포 대비 백분율(DAPI–양성)으로 정량화합니다.
  6. GraphPad Prism 소프트웨어(버전 10.0)는 Shapiro-Wilk 검정을 사용해 데이터 분포의 정규성을 평가한 후 양측 Student's t-검정을 사용하여 그래프를 생성하고 통계 분석을 수행합니다.

6. 분화 기도 상피의 약물 치료

  1. ALI 21일에 멸균 튜브 내 실온에서 분화 배지(3 개의 삽입물로 세포 3mL)를 준비합니다.
  2. 100 mM 정액(10 mM NaOH으로 준비)에서 7.5 μL 디에틸렌 트리아민–노노에트 또는 DETA/NO를 분별 배지에 첨가하여 최종 농도인 3 mL 내 250 μM을 얻습니다. 부드럽게 반전하여 섞고 바로 사용하세요.
  3. 최종 용액 750 μL을 분화된 세포의 세 기저 챔버 각각에 첨가하고 37 °C에서 24시간 배양합니다.
  4. 100 mM L-NAME 정액(DMSO에서 준비됨)에서 30 μL을 MTEC 분별 배지에 첨가하여 1 mM Nω-Nitro-L-아르기닌 메틸 에스터(L–NAME)를 준비하여 총 부피 3mL를 만듭니다.
  5. 최종 용액 750 μL을 세 개의 기저 챔버 각각에 첨가하고 37 °C에서 24시간 배양합니다.
  6. 3mL의 기저 배지(1% v/v)에 디메틸설폭사이드(DMSO) 30 μL을 첨가합니다.
  7. 최종 용액 750 μL을 세 개의 무처리 인서트 기저 챔버에 추가합니다.

7. 샘플 채취

참고: NOA 분석을 위해서는 세 개의 삽입물에서 배지, 첨단 세척, 세포 용해체 샘플을 통합해야 합니다.

  1. ALI 22일째에 분화 기도 상피세포에서 각 실험군 3개의 삽입물에서 각각 750 μL의 기저 배지를 샘플 채취합니다.
  2. 세포가 없는 삽입물에 기저 배지를 채취하여 외부 아질산염 오염을 고려한 빈 대조군 역할을 합니다.
  3. 세 개의 인서트에서 기저 매체를 모아 즉시 -20 °C에서 보관하다가 NOA에 주입할 때까지 보관합니다.
  4. 상피 끝 점액에 존재하는 아질산염/NO를 수집하기 위해, 각 삽입물 세포 위에 50 μL 미리 가열된 PBS(1×) 완충제(멸균, 얼리클레이트 및 냉동)를 추가하고 37 °C에서 30분간 배큐합니다.
    참고: PBS로 세포를 30분 배양하여 끝 세척을 수집하는 동안, 기저 챔버에 PBS를 추가하여 세포 양쪽의 수분 유지도 가능합니다.
  5. 상피 위에 점액이 포함된 PBS를 채취하세요.
  6. 세 개의 인서트에서 PBS 세척을 모아 각 실험 조건에서 약 150 μL의 첨단 점액/PBS를 얻어 두 번의 NOA 주사에 충분합니다.
  7. 끝 세척 샘플은 -20 °C에 보관하여 추가 사용 후에야 보관하세요.
  8. 또한 NOA 주입 시 빈 대조군으로 사용할 PBS 세척 버퍼를 보관하세요.
  9. 세포의 꼭대기와 기저 면을 3개의 삽입물에 500 μL 예열된 PBS를 두 번 세척합니다.
  10. 500 μL 액액을 끝에 첨가하고 세포가 완전히 막에서 분리될 때까지 15–20분간 배양합니다.
  11. 완전히 분리된 후에는 세포에 혈청이 없는 RPMI-1640 배지를 3:1 배지와 Accutase 비율로 첨가합니다.
  12. 세 개의 인서트에서 분리된 세포를 하나의 튜브에 모으세요.
  13. 셀을 3000 × g 에서 4 °C에서 5분간 돌립니다.
  14. 세포 펠릿을 50 μL 용해액(RIPA 버퍼 + Halt 1× 프로테아제 억제제 혼합물)에 재현탁한 후 얼음 위에 45분간 배양합니다.
  15. 용해액을 14,800 × g 에서 4°C에서 20분간 돌려 상원액을 채취합니다.
  16. 전체 세포 용해액 3 μL을 사용하여 비신코닉산(BCA) 분석을 통해 단백질 농도를 측정합니다.
  17. 남은 용해액을 RIPA 버퍼에 1:1로 희석하여 50 μL NOA 주입 두 번이 충분한 부피를 만듭니다.
  18. 용해액은 -80 °C에서 저장하다가 -20 °C에서 NOA에 주입합니다.
  19. 세포 펠릿을 재현탁하는 데 사용된 RIPA 버퍼를 -20°C에 보관하여 용해물 샘플의 빈 및 오염 조절용으로 사용하세요.

8. NOA 교정 및 시료 주입

  1. 삼중아이오다이드 시약은 400mg 요오드칼륨과 250mg 요오드를 빙하 아세트산 28mL와 초순수 8mL에 녹여 제조합니다.
  2. 트리아이오다이드 시약은 화학 연기 후드에서 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 안경 보호구)를 착용하여 수행하십시오.
    주의: 요오드와 빙하 아세트산은 위험하며 피부와 눈에 자극과 부식을 일으킬 수 있습니다.
  3. 상온에서 보관하고 준비 후 2주 이내에 사용하세요.
  4. 아질산염 없는 물에 아질산나트륨 1mM 스톡 용액을 준비합니다.
  5. 사용될 때까지 -20°C에 보관하세요.
  6. 주입 직전에 PBS에서 신선한 작업 표준 제약(0.125–4.0 μM)을 준비하세요.
    참고: NOA 교정을 위해서는 아질산염 오염을 최소화하기 위해 멸균되고 뚜껑이 단단히 고정된 PBS를 사용하세요.
  7. 질소(N2) 운반가스를 켜고 시스템 내 가스 흐름을 시작하세요.
  8. 유리 퍼지 용기를 조립하고, 1:10 비율로 희석한 20 μL 안티폼과 함께 4mL의 트리아이오다이드 시약을 첨가합니다.
  9. 나사 캡으로 고정된 비중격으로 단단히 덮어 밀폐를 보장합니다.
  10. NaOH 트랩에 수산화나트륨(NaOH) 10mL를 부어줍니다.
  11. NOA 기기(nCLD 88) 디스플레이 화면에서 측정, 가스 및 거리를 선택하세요.
  12. 측정 범위 0에서 50 ppm 사이의 NO에 해당하는 MR2:50.00으로 설정하고, 필터 설정은 Fast 를 선택하세요.
  13. 질소 가스 압력을 조절하여 원자로 압력이 27–29 psi(186–200 kPa) 사이로 안정화될 때까지 유지합니다.
  14. NOA에 연결된 컴퓨터에서 eDAQ 차트 소프트웨어를 열어보세요.
  15. 획득 범위를 10/s, 전압을 10V로 설정하세요.
  16. 채널 설정> 설정으로 이동해 채널 1을 선택하세요.
  17. NOA 소프트웨어에서 디스플레이 스케일을 2:1 로 설정하세요.
  18. NOA 기기와 소프트웨어에서 데이터 수집을 시작하세요.
  19. 기준선이 안정될 때까지 계속 관찰하세요.
  20. 해밀턴 주사기를 사용해 퍼지 혈관에 10 μL PBS를 주입하여 기본 안정성을 확인합니다.
  21. 각 주입마다 화학발광 신호를 기록하세요.
  22. 0.125 μM 아질산염 표준 10 μL을 퍼지 용기에 주입합니다.
  23. 각 아질산염 표준에 대해 두 번 반복하여 중복 측정값을 얻고, 이후 평균화됩니다.
  24. 각 주입 항목은 주석 탭에 주석을 달아주세요(예: 10 μL 0.5 μM 아질산염).
  25. 주사기를 보풀이 없는 휴지에 닦고, 멸균된 무아질산염 물로 3–4번 헹구면 과도한 트리아이오다이드를 제거하세요.
  26. 이 세척 과정을 주사 후 반복하세요.
  27. 주입 사이에 신호가 기준선으로 돌아갈 때까지 기다려 주세요(20–30초).
  28. 흐름 분석 창을 열 어보세요 .
  29. 분석 표에서 각 주입의 최고 높이와 시간 값을 검토하세요.
  30. 각 피크를 강조 표시하고 선택을 조정하여 곡선 아래 면적(AUC)을 계산합니다.
  31. 디스플레이를 S 에서 C 로 전환해 보정 모드를 활성화하세요.
  32. 각 표준의 알려진 아질산염 양을 Amount 열에 입력하세요.
  33. 표준 곡선을 생성하려면 보정 곡선 버튼을 클릭하세요.
  34. 보정 곡선이 수용 기준(R2 ≥ 0.99)을 충족하는지 확인하세요.
  35. 얼음 위에 ALI 배양에서 수집된 생물학적 샘플을 해동합니다.
  36. 50 μL 빈 세포 프리 배지를 퍼지 용기에 주입합니다.
  37. 각 기저 배지 샘플 50 μL을 퍼지 용기에 주입합니다.
  38. 각 주입마다 화학발광 신호를 기록하세요.
  39. 각 샘플마다 50 μL씩 중복 주입을 수행합니다.
    참고: 50 μL 주입은 빈번한 기포 형성을 초래합니다. 이 문제를 줄이기 위해 세척 용기 내 트리아이오다이드 시약을 정기적으로 거품 방지제로 교체하세요.
  40. 주입 전에 각 샘플을 주 석 탭에 주석 달아 주세요.
  41. 50 μL 세포 자유 PBS(첨단 블랭크)를 퍼지 용기에 주입합니다.
  42. 끝 세척 샘플(샘플당 50μL 주입 두 회)을 주입하고 해당 신호 피크를 기록합니다.
  43. RIPA 버퍼를 두 번 주입한 후 용해액 샘플(샘플당 50 μL 주입 두 회)을 주입하여 해당 신호 피크를 기록합니다.
    참고: 항상 화학발광 흔적이 기준선으로 돌아가 안정되도록 하세요. 20–30초를 기다린 후 다음 샘플을 주입하세요.
  44. 샘플 주입이 끝나면 흐름 분석 창을 엽니다.
  45. 각 샘플 피크를 강조하여 곡선 아래 면적(AUC)을 계산합니다.
  46. 표준 용액에서 생성된 보정 곡선을 사용하여 각 샘플의 아질산염 농도를 결정합니다.

9. 데이터 수집, 정규화 및 분석

  1. eDAQ 소프트웨어의 유동 분석 기능에서 최대 높이(V), 곡선 아래 면적(V.s), 곡선 아래 평균 면적 등 데이터를 엑셀 파일로 내보내세요. 내보내진 파일은 전체 NOA 실험에 대한 신호 추적의 높이(V) 대 시간(s)을 표로 표시합니다.
  2. NOA에 주입된 아질산염의 피코몰(pmol)은 아질산염 농도(μM)에 주입량(μL)을 곱하여 측정합니다.
  3. 대조군(Cell-free 배지, PBS 워시 버퍼 또는 RIPA 버퍼)에서 측정한 아질산염의 피코몰(pmol)을 평균화합니다.
  4. 각 50 μL 샘플 주입에서 측정된 pmol에서 해당 제어 값을 빼세요.
  5. 각 샘플의 총 피코몰(pmol)을 샘플 주입 부분에서 측정한 pmol에 정확한 총 샘플 부피를 곱하여 측정합니다. 배지에는 750 μL, 끝 세척에는 150 μL, 용해액에는 약 90–100 μL를 사용하세요.
  6. 또한, 용해물만 사용할 경우, 희석 인자를 고려하기 위해 총 아질산염 pmol에 2를 곱합니다.
  7. 각 샘플에 대해 얻은 아질산염 pmol을 해당 샘플의 용해액에 포함된 총 단백질 양(μg)으로 나누어 정규화합니다. 이 값은 이전에 BCA 분석법으로 얻은 값입니다.
  8. 각 샘플에 대해 중복 주입 시 아질산염 농도(pmol/μg)를 평균합니다.
  9. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용해 각 샘플의 정규화된 아질산염 농도(pmol/μg)를 그래프 작성합니다.
  10. 샤피로-윌크 검정을 사용하여 정규성 분포를 평가합니다.
  11. 양측 학생 t-검정을 사용하여 통계 분석을 수행하세요.

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결과

이 절차의 전반적인 목표는 공기-액체 경계면(ALI)에서 분화된 마우스 기관 상피 세포(MTEC) 배양에서 산화질소(NO) 수준을 정량화하는 것입니다. 1차 세포는 확립된 프로토콜27,28에 따라 분리 및 분화됩니다. ALI에서 21일 동안 세포들은 섬모세포를 포함하는 의사층화 기도 상피로 분화됩니다27,28. 섬모 형성 수준은 Foxj1 또는 아세틸화된 α-튜불린에 대한 면역 표지로 평가하였다. 분화가 진행됨에 따라 분화 세포 핵 내에서 FoxJ1 발현이 점차 증가하는 것이 관찰되었고(그림 1A), 아세틸화된 α-튜불린으로 표지된 다수의 섬모를 가진 세포 수도 증가했다(...

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토론

기도 상피 내 다연모세포는 NO 합성과 신호 전달에 필수적이며, 이는 다시 섬모 박동, 점모 정리, 기도 항상성 조절에 필수적이다 6,7,8. NO는 매우 반응성이 높은 분자이며, NO 수치의 작은 변화도 기도 질환 1,2,3,4와 관련이 있습니다. 따라서 정밀하게 조절된 NO 수치를 유지하는 것은 정상적인 기도 기능을 위해 필수적입니다. 여기서는 공기-액체 경계면(ALI)에서 배양된 섬모 기도 상피세포에서 NO 생성의 대리 지표로 아질산염을 검출하는 방법을 설명합니다. 마우스...

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공개 사항

저자들은 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

연구 설계에 대한 안내를 주신 마크 T. 글래드윈 박사(메릴랜드 대학교 의과대학 학장 겸 교수)께 감사드립니다. 또한 공초점 현미경 자원에 접근할 수 있도록 해준 메릴랜드 대학교 의과대학 공초점 현미경 센터(볼티모어, MD)에도 감사드립니다. 이 연구는 국립보건원(NIH)의 5R01HL168775 보조금으로 파올라 코르티 박사에게 지원받았습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248면역염색을 위해 1:2000으로 희석
50 mL 원심분리 튜브 필터 (0.22 µm)CellTreat229710멸균 용액 준비용
500 mL 필터 유닛ThermoFisher Scientific566-0020멸균 배지 준비용
AccutaseSigmaA6964
Amphoterecin BThermoFisher Scientific15290026
Bovine Pituitary ExtractThermoFisher Scientific13028014
Bovine Serum AlbuminSigmaA7906
Cholera toxinSigmaC8052
Collagen IThermoFisher ScientificA1048301
Confocal MicroscopeNikonW1 스피닝 디스크 Ti2 인버티드 현미경 및 Hamamatsu sCMOS 카메라
Corning Transwell insertsSigmaCLS3460
Diethylenetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
DMEM/F-12 mediaThermoFisher Scientific11330032
DNAse ISigmaDN25
Fetal Bovine SerumSigmaF4135
Halt 1X Protease inhibitor cocktailThermoFisher Scientific1860932
Ham's F1-12 Nutrient mixThermoFisher Scientific11765054
Insulin solutionSigmaI0516
Isoproterenol hydrochlorideSigmaI6504
Keratinocyte Serum-free mediaThermoFisher Scientific17005042
Murine Epidermal growth factorSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicillin-StreptomycinSigmaP4333
Phosphate buffer saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23227
PronaseSigma10165921001
Retinoic acidSigmaR2625
Rho kinase inhibitor (Y-27632 hydrochloride)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
RIPA bufferSigmaR0278
RPMI-1640 mediaThermoFisher Scientific11875093
Sodium nitrite SigmaS2252
TransferrinSigmaT8158
α-Acetylated tubulin antibody (mouse)SigmaT6793면역염색을 위해 1:200으로 희석
α-FoxJ1 antibody (mouse)ThermoFisher Scientific14-9965-80면역염색을 위해 1:200으로 희석
α-mouseCy3 secondary antibodyThermoFisher ScientificA10521면역염색을 위해 1:1000으로 희석
γ-secretase inhibitor IX (DAPT)SigmaD5942
```

참고문헌

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