인간 아스파라진 합성효소를 이용한 냉동 전자기(Cryo-EM) 지도에서 단백질 구조 역학을 시각화하는 워크플로우

Summary

이 프로토콜은 CryoSPARC에서 3D 변이 분석(3DVA)을 수행하는 방법을, Phenix에서 변이성 정제를 수행하여 냉동 전자기(cryo-EM) 데이터의 구조 이질성을 분석하는 방법을 설명합니다. 인간 아스파라진 합성효소를 예로 들어 변동성 지도를 생성하고, 주성분을 시각화하며, 해당 원자 모델을 정제하는 방법을 설명합니다.

Abstract

이 글은 CryoSPARC의 3D 변동성 분석(3DVA)과 Phenix에서의 변이성 정제를 사용하여 단일 입자 크라이오-전자현미경(cryo-em) 데이터의 구조 이질성을 분석하는 포괄적인 워크플로우를 제시합니다. 이 프로토콜은 입자 이미지에서 도출된 주성분을 따라 변동성 맵을 계산하고, 주요 구조 변동 모드를 시각화하며, 개별 변동성 프레임에 대해 해당 원자 모델 앙상블을 정제하는 방법을 설명합니다. 결과물에는 3D 변동성 지도, 이산 구조 상태를 나타내는 정제된 다중 모델 원자 구조, 비교 구조 분석 및 영화 생성에 적합한 시각화 파일이 포함됩니다. 이 워크플로우는 해상도 범위(일반적으로 ~2.0-6.0 Å)의 냉동 전자기(cryo-em) 재구성에 널리 적용되며, 여기서 구조 이질성을 백본 및 측쇄 수준에서 의미 있게 해석할 수 있습니다. 특히 이산 분류만으로는 쉽게 해결할 수 없는 연속 영역 운동, 경첩 굽힘 운동, 그리고 조정된 국소 재배열을 포착하는 데 적합합니다. 변동성 지도와 정제된 모델 앙상블의 결합 사용은 구조적 극단의 직접적인 구조적 비교를 가능하게 하며, 평균평균근 변동(RMSF) 계산과 같은 정량적 분석을 지원하고, 동적 구조적 특징을 생화학적 또는 기능 가설과 연결하는 틀을 제공합니다. 인간 아스파라진 합성효소(ASNS)를 예로 사용하여 워크플로우의 실용적 구현을 시연합니다.

Introduction

고분자 구조에서 구조적 이질성을 특성화하는 것은 단일 입자 냉동전자현미경(cryo-EM) 분석에서 점점 더 중요한 측면입니다. 이 프로토콜의 목표는 CryoSPARC¹ 의 3차원 변동성 분석(3DVA)과 Phenix²의 변동성 정제를 결합하여 냉동 전자기(cryo-EM) 데이터셋에서 구조 변동성의 지배적 모드를 직접 추출, 시각화 및 정제하는 실용적인 워크플로우를 제공하는 것입니다. 이 글은 독자들이 이 계산 접근법이 자신의 데이터에 적합한지 판단하고, 워크플로우에서 생성되는 출력 유형을 이해하는 데 도움을 주기 위해 작성되었습니다.

전통적인 실험 기법(예: 수소-중수소 교환, NMR 분광법, 질량분석법)은 단백질 운동 ^3,4,5에 관한 귀중한 정보를 제공하지만, 분자 크기, 샘플 요구량 또는 실험 복잡성에 의해 제한되는 경우가 많습니다. 냉동 전자기의 발전으로 대형 및 이질계에 대한 고해상도 구조 결정이 가능해져 입자 집단 내 구조 변동성 분석이 가능해졌습니다. CryoSPARC¹에서 구현된 3D 변동성 분석(3DVA)은 크라이오-전자기(cryo-em) 입자 데이터셋을 지배적이고 연속적인 구조 변이 모드를 설명하는 주성분으로 분해합니다. Phenix²의 변동성 정제와 결합하면, 이 접근법은 각 주성분을 따라 이산 위치에 대응하는 원자 모델을 생성하여, 실험 데이터에서 도출된 대체 구조의 시각화 및 비교를 가능하게 합니다.

이 프로토콜은 원자 해상도에서 중간 해상도(일반적으로 ~2-6 Å)에 가까운 냉동 전자기(cryo-EM) 데이터셋을 재구성하는 데 가장 적합합니다. 높은 해상도에서는 백본 재배열과 제한된 측쇄 변동성을 포착할 수^{있으며, 낮은} 해상도에서는 도메인 수준 또는 2차 구조 이동을 식별하는 데 더 적합하다 ^2,7. 이 방법은 힌지 운동, 영역 호흡, 도메인 또는 하위 단위체 간의 조정된 재배열과 같이 데이터셋에 널리 채워진 지배적이고 연속적인 운동 모드를 포착하는 데 적합합니다. 적절한 입자 수와 각도 커버리지는 필수적이며, 측사슬 위치가 모호한 유연하거나 약하게 해석된 영역에서는 해석이 제한될 수 있습니다. 집중 분류⁸ 또는 광범위한 하위 분류 전략과 비교할 때, 3D 변동성 정제 워크플로우는 구조 이질성을 이산적 클래스가 아닌 연속적인 궤적으로 표현합니다. 이로 인해 이 방법은 여러 구조를 샘플링할 것으로 예상되는 효소, 분자 기계, 다도메인 복합물의 탐색적 분석에 특히 유용합니다.

인간 아스파라진 합성효소(ASNS)는 프로토콜 구현을 시연하는 예시로 사용됩니다. ASNS는 분자 내 암모니아 터널로 연결된 두 개의 기능적 도메인으로 구성된 글루타민 의존 아미도트랜스퍼라제입니다 ^9,10. 이전 연구들은 Arg-142와 같은 잔기와 관련된 구조 변화가 이 터널⁶의 변조에 기여한다고 제안했습니다. 이 글에서 ASNS는 3DVA와 변동성 정제가 어떻게 변동성 맵을 생성하고, 정제된 원자 모델 앙상블과 시각화를 생성하는지 보여주는 대표적인 시스템으로만 사용됩니다. 상세한 기전적 해석은 결과 및 논의 섹션에 맡겨집니다. 분자 동역학(MD) 시뮬레이션은 구조 지형 탐구를 위한 보완적 접근법으로 자주 사용되지만(^11,12), 이 프로토콜에는 MD가 필수는 아닙니다. MD 시뮬레이션과의 비교는 선택적 하위 분석으로 수행할 수 있으나, 여기서 설명된 워크플로우(그림 1)는 극저온 전자기(cryo-EM) 데이터에서 구조 이질성을 추출하고 시각화하는 데 전적으로 집중합니다.

그림 1. 워크플로우 개요. 단일 입자 데이터를 기반으로 합의된 극저온 전자기 지도를 재구성하여 주성분을 따라 3차원 변동성 분석(3DVA)을 생성합니다. 변동성 정제(Phenix.varref)는 합의된 원자 모델을 사용하여 시각화 및 비교를 위한 대응하는 원자 모델을 생성합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

Protocol

1. 데이터 준비

1. 합의 EM 맵 생성
   1. 단일 입자 냉동전자현미경(크라이오-EM)을 사용하여 고분자 복합체의 합의된 3D 구조를 결정합니다.
   2. 크라이오그리드에서 비트라이파이 샘플을 촬영하고, 직접 전자 검출기가 장착된 고전압 투과 전자현미경을 이용해 촬영합니다.
   3. 수집된 영상을 처리하여 빔에 의한 움직임을 보정하고, 영상 매개변수를 추정하며, 입자 이미지를 선택합니다.
   4. 입자를 반복적으로 분류하고 정제하여 합의된 전자기 지도를 생성합니다.
   5. 3D 변동성 분석(3DVA)이 구현될 예정이므로 CryoSPARC(v4 이상)¹³을 사용하여 데이터 처리를 수행하세요.
2. 합의 모델 생성
   1. 원자 모델을 만들고 합의 지도에 맞춰 다듬으세요. 표준 기준을 사용하여 정제된 모델 품질을 검증합니다
      참고: ASNS의 경우 구조는 템플릿 기반 입자 선택 전략을 사용하여 결정되었습니다. DON에 변형된 인간 ASNS(PDB 6GQ3⁾⁹의 X선 구조에서 추출한 템플릿을 사용해 CryoSPARC¹³에서 고품질 입자를 효율적으로 선별하였습니다. 이 입자들은 2D 분류, Ab initio 재구성, 그리고 C2 대칭성을 부과한 이종적이고 비균일한 정제를 거쳐 3.5 Å 합의 지도를 얻었습니다. 원자 모델은 결정 구조⁹를 EM 맵에 사용하고, Phenix^14,15에서 실공간 정제, Coot¹⁶에서 수동 조정을 거쳐 최종 합의 ASNS 구조를 생성^{했습니다.}

2. 3D 변동성 분석 수행(3DVA)

1. 최종 정제에는 파티클 스택과 마스크(최종 정제된 맵이 아님)를 사용하세요
   참고: 종종 균일하지 않은 정제 작업의 결과가 3DVA에 사용됩니다.
2. CryoSPARC에서 3D 변동성 작업을 생성하세요. 비균일 정제 작업에서 입력 입자 스택과 마스크를 입력합니다.
3. 해결할 모드 수를 설정하세요: 주성분(PC) 수를 5개로 설정하세요.
   참고: 고분자 구조가 3차원 공간에 존재하기 때문에, 주요 공간적 운동 방식을 설명하려면 일반적으로 최소 세 개의 PC가 필요합니다. 추가적이지만 기능적으로 중요한 구조 변이가 간과되지 않도록 두 개의 PC가 추가로 포함되었습니다.
4. 필터 해상도를 4.0 Å, 하이패스 해상도를 20으로 설정하세요. 다른 모든 매개변수는 기본값으로 두세요. 일을 시작하세요.
   참고: "필터 해상도"는 4.0 Å로 설정되었으며, 고주파 잡음에 과적합되지 않도록 데이터셋의 전체 품질과 일치하도록 설정되었습니다. 최종 합의 지도가 3.5 Å 해상도로 결정되었기 때문에, 약간 낮은 필터 해상도(4.0 Å)를 적용함으로써 변동성 분석은 해상도 한계 근처의 잡음보다는 실제 구조적 움직임에 초점을 맞출 수 있었습니다.
5. 변동성 부피 집합을 출력으로 얻습니다 (그림 2A)

3. 3D 변동성 표시 수행

1. CryoSPARC에서 3D 변동성 디스플레이 작업을 생성하여 3DVA가 식별한 지속적인 구조 변화를 시각화하세요.
2. 3DVA 작업에서 생성된 파티클 스택과 가변성 볼륨을 입력합니다.
3. 출력 모드로 Simple을 선택하세요(아래 참조).
4. 필터 해상도를 4.0으로 설정하고 하이패스 해상도를 20으로 설정하세요. 다른 모든 매개변수는 기본값으로 유지하세요. 일을 시작하세요.
5. 결과로 20개의 변동성 맵을 얻으세요(프레임 0부터 19까지)는 5개의 주성분(PC)을 0부터 4까지 해당합니다(그림 2B)
   참고: 3D 변동성 디스플레이 프로그램의 "단순 모드"는 각 주요 구성 요소에 따른 구조 변화를 직관적으로 시각화합니다. 이 모드는 3DVA가 식별한 극한 상태 간에 선형 궤적을 생성하여 입자 집단 내 움직임을 명확하고 직접적으로 해석할 수 있게 합니다.

4. 영화 데이터 준비 및 페닉스 3D 변수 정제화

1. 3DVA 변동성 지도 다운로드: CryoSPARC에서 PC용 0-4용 변동성 지도가 포함된 압축 파일(총 5개의 zip)을 다운로드하세요.
2. 디렉터리 정리: 상위 폴더(예: 3DVA/)를 생성합니다. 내부에서 각 주요 컴포넌트(comp0, comp1, comp2, comp3, comp4)마다 하나의 하위 폴더를 만드세요.
3. 각 zip을 해당 폴더로 옮기고 내용을 압축 해제하세요.
4. 각 폴더에 20개의 변동성 맵(프레임 0-19)이 포함되어 있는지 확인하고, comp1-comp4에 대해 반복합니다.
   참고: 각 주요 구성 요소별로 별도의 폴더를 유지하여 PC 간 프레임 혼합을 방지하세요.

5. UCSF Chimera (선택 사항) 17에서 빠른 영화 준비

1. 볼륨 시리즈 도구를 열어 Chimera를 실행한 후 볼륨 데이터 → 도구 → 볼륨 시리즈로 이동하세요. 새로운 볼륨 시리즈 창이 열릴 예정입니다.
2. 맵을 불러오세요: 열기를 클릭하고 하나의 주성분(예: comp0)에 해당하는 20개의 맵을 선택하세요.
3. 시각화 매개변수를 조정하세요: 볼륨 뷰어를 열고 적절한 밀도 임계값을 설정한 후 지도에 색상을 할당하세요.
   참고: 이 예시에서는 하늘색 이 사용되었습니다(그림 3).
4. 미리보기 동작: 볼륨 시리즈 창에서 재생 방향을 Oscillate로 설정한 후 재생을 클릭해 프레임 0→ 19→ 0까지 연속 전환을 표시합니다.
5. 추가 구성 요소에 대해 반복: 필요에 따라 다른 주요 구성 요소에 대해 5.2-5.4단계를 반복합니다.
6. 명령줄 입력을 사용해 영화 파일을 생성하기: Chimera 명령줄을 열고 보조 코딩 파일 1을 실행하여 영화를 내보내세요.
   참고: 컴포넌트별 20프레임 mrc 시리즈(예: compX_frame000-019.mrc)는 Phenix 3D 가변 정제를 위한 입력입니다. 컴포넌트 폴더는 (comp0-comp4)로 분리해서 PC에서 프레임이 섞이지 않도록 하세요.

6. 페닉스에서 변동성 정제를 통한 모델 생성

참고: Phenix.varref는 입력 맵과 모델에 대한 전체 경로가 지정되어 있다면 어떤 디렉터리에서도 실행할 수 있습니다. 하지만 조직의 명확성을 위해 각 PC별로 전용 하위 디렉터리에서 정제를 수행하는 것이 권장됩니다.

1. 최종 정제된 합의 모델 파일을 각 PC에 대응하는 하위 디렉터리에 복사합니다.
2. 각 서브디렉터리 내에서 명령줄에서 다음 문법을 사용하여 Phenix.varref를 실행하세요:
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.MRC Resolution=4 nproc=20 models_per_map=50
3. 해상도를 4.0 Å로 설정하여 3DVA 맵의 유효 해상도와 일치시키세요
4. nproc를 사용 가능한 프로세서 수(이 예시에서는 20개, 사용 가능한 계산 자원에 따라 달라질 수 있음)로 설정하세요
5. models_per_map 기본값으로 50모델로 설정하세요.
   참고: 각 지도마다 3DVA 데이터 해상도에 맞춰 제약을 조정한 50개의 모델이 생성됩니다. 각 지도에 가장 적합한 모델은 자동으로 유지됩니다. 결과적인 출력 파일에는 20개의 변동성 맵에 대응하는 20개의 정제된 모델이 포함되어 있습니다. 출력물은 20개의 정제된 모델과 개별 지도 파일을 포함한 PDB 번들로 구성됩니다.
6. 가변성 정제화 중에는 추가적인 지도 선명화를 적용하지 마세요. CryoSPARC에서 생성한 변동성 맵(4.0 Å 필터링)을 phenix.varref의 입력으로 직접 사용하세요.

7. 시각화

1. ChimeraX¹⁸ 에서 PDB 번들을 열어 20개의 정제된 모델 모두를 동시에 불러오세요.
2. 모델 패널을 사용하여 개별 프레임이나 관심 있는 특정 모델을 선택적으로 표시하여 비교 및 분석할 수 있습니다(그림 4). 또는 각 정제된 모델은 ChimeraX 또는 Chimera에서 개별적으로 열 수도 있습니다.

8. 분석을 위한 데이터 준비

참고: 위의 문법을 실행하면 20개의 변수 모델과 각 개별 맵을 포함하는 PDB 번들이 생성됩니다. 대부분의 분석에서는 선택된 주성분(PC)을 따라 두 극단적인 구조 상태를 나타내기 때문에 프레임 0과 프레임 19에 해당하는 두 모델만 필요합니다.

1. ChimeraX에서 PDB 번들을 열고 모델 1.1(프레임 0)과 모델 1.20(프레임 19)을 선택한 후 각 모델을 별도의 PDB 파일로 저장하세요(그림 4).
2. 결과된 PDB 파일을 편집하여 관심 있는 잔류물을 분리합니다. 이 작업은 수동으로 하거나 Phenix.pdb.tools를 사용할 수 있습니다.
3. 두 개의 수정된 PDB 파일을 비교하여 척추 또는 측쇄의 구조 변화를 식별합니다.
4. 두 PDB 모델을 비교하기 위해 Chimera의 MatchMaker 함수를 사용해 수정된 구조를 중첩합니다.
   참고: 신뢰할 수 있는 정렬을 위해서는 MatchMaker가 보통 최소 10-15개의 겹치는 잔류물을 요구합니다. 저희 경우에는 단 6개의 잔기만 분석되었고; 그러나 ASNS의 호모디메릭 특성을 활용해 성공적인 중첩이 이루어졌는데, 사슬 A에는 6개의 잔기만 남아 있었고, 사슬 B는 온전하여 정렬의 기준 역할을 했습니다.

Results

이 섹션은 3D 변동성 분석(3DVA) 및 변동성 정제화 워크플로우에서 생성된 대표적인 출력을 제시하고, 이를 해석하는 데 지침을 제공합니다. 인간 아스파라진 합성효소(ASNS)는 성공적인 결과, 공통 인공물, 비교 분석을 입증하는 예시 데이터셋으로 사용됩니다. 3DVA 기반 변동성 지도 전체 세트와 ASNS 데이터셋에서 생성된 정제된 모델들이 Zenodo 공개 저장소에 보관되었습니다. 자세한 접근 정보는 보충 표 1에 제공되어 있습니다.

3DVA 변동성 지도와 변동성 영화.
3DVA의 주요 출력은 구조 변이¹의 우세 모드를 설명하는 변동성 지도 집합으로, 각 주성분(PC)을 따라 순서화된 지도 시리즈로 시각화됩니다. ASNS 데이터셋의 경우, 야생형(WT) 및 R142I 변이 데이터셋(보조 동영상 1 및 2) 모두에 대해 주성분 0(PC0)...

Discussion

중요한 프로토콜 단계와 결정 지점
이 프로토콜의 효과적인 사용은 워크플로우의 여러 핵심 단계에 달려 있습니다. 최종 극저온 전자기(cryo-em) 정제에 사용되는 입자 스택과 마스크의 품질은 매우 중요한데, 3D 변동성 분석(3DVA)은 후처리된 지도가 아닌 이러한 입력값을 직접 적용하기 때문입니다. 주성분(PC) 수(PC) 수(PS) 선택은 데이터셋 크기와 예상 복잡도를 반영해야 합니다; 너무 적은 구성 요소가 변동성을 과소대표할 수 있고, 너무 많으면 잡음 지배 모드를 초래할 수 있습니다. 3DVA와 변동성 정제에서 사용되는 해상도 매개변수는 데이터의 유효 해상도와 일치해야 합니다. 어떤 프레임을 시각화하거나 비교할지 같은 후속 선택은 관심 있는 구조적 특징에 따라 결정되어야 합니다.

문제 해결과 흔한 함정
변동성 결과 해석을 복잡하게 만드는 여...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
크라이오SPARC v4.4+	구조 생명공학	https://cryosparc.com	냉동 전자기(CRE) 처리용 소프트웨어
페닉스 v1.24+	페닉스 컨소시엄	https://phenix-online.org	가변성 정제를 위한 소프트웨어
UCSF 키메라	생명컴퓨팅, 시각화 및 정보학 자원, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	분자 시각화용 소프트웨어
UCSF 키메라X	생명컴퓨팅, 시각화 및 정보학 자원, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	분자 시각화용 소프트웨어
CPPTRAJ	AMBER 분자 역학 소프트웨어 제품군	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	RMSF 계산을 위한 파이썬 도구
Linux 워크스테이션 (자체 조립된 GPU 기반 시스템)
워크스테이션 케이스	슈퍼마이크로	https://www.supermicro.com	워크스테이션 케이스: Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U 서버 슈퍼 섀시
CPU	인텔	https://www.intel.com	CPU: XEON E5-2690V3 x2
모 위원회	슈퍼마이크로	https://www.supermicro.com	마더 보드: Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 메인보드 X10DAI-O
기억	중요	https://www.crucial.com	메모리: Crucial 64GB 키트 (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC 등록됨. 288핀 서버 메모리 CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
하드 드라이브	웨스턴 디지털	https://www.westerndigital.com	HDD: WD RE 4TB 엔터프라이즈 하드 드라이브
RAID 컨트롤러	LSI 로직	https://www.broadcom.com	RAID 컨트롤러: LSI LOGIC 메가RAID SAS 9271-8i 키트
GPU	NVIDIA와 nbsp;	https://www.nvidia.com	24GB GDDR5 메모리를 탑재한 쿼드로 M6000 그래픽 카드