전정 슈반종 마우스 모델에서 종양 유발 운동실조의 특성 분석

요약

우리는 종양에 의한 운동실조증을 연구하고 전정 슈반노마 마우스 모델에서 신경 기능을 보존하는 치료법을 평가하기 위한 행동 검사 패널을 개발했습니다.

초록

NF2 관련 슈반노마토스(NF2-SWN)는 NF2 종양 억제 유전자의 생식계 돌연변이로 인해 발생하는 상염색체 우성 종양 소인 증후군입니다. 이 질환은 양측 전정 증강구종(VS)이 발생하여 점진적으로 확대되어 청력 손실, 불균형, 운동 실조 증상을 초래하여 환자의 삶의 질에 심각한 영향을 미칩니다. 현재 FDA 승인 약물 치료제는 없습니다. 신경학적 결손 중에서, 운동실조증은 평가를 위한 견고한 전임상 모델이 부족해 특히 쇠약하게 만들지만 연구가 부족한 증상으로 남아 있습니다. 본 연구에서는 VS 관련 난청 및 운동실조증의 정형상향 마우스 모델에서 종양 유발 운동실조증을 체계적으로 평가하기 위한 행동 검사 세트를 개발하였습니다. 이 검사들은 종양 부담으로 인한 균형 및 운동 조정 결손을 정량적으로 측정할 수 있게 합니다. 이 실험 플랫폼은 종양에 의한 소뇌 기능 장애의 기전적 연구를 가능하게 하며, 치료 전략의 전임상 평가에 귀중한 도구를 제공합니다. 행동 평가를 종양 생물학 및 청력 검사와 통합함으로써, 이 접근법은 종양 억제 및 신경 보호 치료 효과를 모두 특성화하는 데 도움을 줍니다. 궁극적으로 이러한 검사들은 운동실조를 특징짓는 다른 신경학적 장애에도 적용할 수 있는 다재다능한 틀을 제공하며, NF2-SWN을 넘어 그 유용성을 확장합니다.

서론

NF2 관련 슈반노마토스(NF2-SWN)는 세포골격 단백질인 멀린¹을 암호화하는 NF2 종양 억제 유전자의 돌연변이로 인해 발생하는 드문 우성 유전 종양 소인 증후군입니다. 멀린 기능 상실은 세포 증식, 유착, 생존을 조절하는 신호 경로를 방해하여, 신경계에 여러 양성 종양이 발생할 수 있는 소인을 만듭니다. NF2-SWN의 특징은 양측 전정 수혈구(VS)의 형성으로, 이는 전정 접귀신경을 따라 발생하는 비악성 슈반 세포 유래 종양입니다. 이 종양들은 점차 커져 인접 신경 구조를 압박하고, 감각신경성 난청, 이명, 안면 신경 기능 장애를 초래합니다².

양측 VS 환자는 전정신경과 내이 전정 장치에 점진적인 손상을 겪으며, 이로 인해 만성 불균형, 운동실조, 보행 불안정성으로 나타나는 심각한 전정 기능 장애가 발생하여 이동성과 삶의 질을 심각하게 저하시킵니다³. 전정 기능 장애의 정도는 종종 종양 부담과 신경 침범과 연관되어 있습니다. 이러한 증상은 종양 조절이나 청력 보존 노력 후에도 종종 지속되며, 기계적 압박을 넘어선 복잡한 신경생물학적 메커니즘이 있음을 시사합니다 ^4,5. 어지럼증 장애 검사, 보행 분석, 전정안구 반사(VOR) 검사, 자세조영술과 같은 임상 도구들이 전정 장애를 정량화하는 데 사용되고 있지만, 종양 유발 운동실조증의 기전은 아직 잘 이해되지^{않았습니다.} 분자 이해가 발전하고 베바시주맙과 같은 표적 치료제가 도입되었음에도 불구하고, NF2-SWN 환자에서 청력과 균형 기능을 모두 신뢰성 있게 보존하는 FDA 승인 치료법은 아직 없습니다. 전정 증상 관리는 대체로 지지적이며, 주요 미충족 임상적 필요를 부각시킵니다.

VS 관련 운동실조증의 임상 관리를 개선하는 데 큰 장애물은 환자에서 관찰되는 전정 및 운동 조정 결손을 충실히 재현하는 전임상 모델의 부재입니다. 대부분의 기존 VS 동물 모델은 특징적인 균형 및 협응 장애를 재현하지 않고 종양 성장이나 청력 손실에 초점을 맞추고 있습니다. 더불어, 운동실조와 전정 기능 장애를 객관적으로 평가하기 위한 표준화된 행동 검사는 아직 잘 확립되지 않았습니다. 이 격차는 기전적 연구를 방해하고 전정 기능 보존을 목표로 한 후보 치료법의 평가를 제한합니다.

여기서는 측정 가능한 운동실조 표현형을 나타내는 VS 마우스 모델 개발과 종양 유발 운동실조증을 정량화하기 위해 특별히 설계된 행동 검사 패널을 보고합니다. 이 모델은 VS 관련 전정 기능 장애의 기전을 조사하고, NF2-SWN 환자의 균형, 협응 및 전반적인 신경 기능 회복을 위한 치료 중재의 효능을 평가하는 데 꼭 필요한 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

동물 실험은 매사추세츠 제너럴 브리검 기관 동물 관리 및 사용 위원회(MGB)가 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 모델

1. Nf2^-/- 세포(가우시아 루시페라 제 보고자 유전자 글럭을 발현하는 슈반 세포)를 면역 기능이 있는 C57/FVB 마우스에 접종합니다. 입체 주사 장치(그림 1A)를 사용해 각 마우스에게 2,500개의 종양 세포 1 μL을 오른쪽 반구^CPA 영역에 주입합니다 ^4,6.
2. 충분한 통계적 검정력을 확보하고 잠재적인 성별 관련 차이를 조사하기 위해 8-12주 된 수컷과 암컷 쥐(1:1 비율)를 모두 사용하세요. 쥐는 12시간의 밝고 어두운 주기 하에 4마리씩 무리를 지어 키우고, 음식과 물을 자유 롭게 제공하세요.
   참고: 샤노노마는 환자의 전정신경에서 발생하기 때문에 소뇌 화면각(CPA) 모델을 사용했습니다. CPA 모델은 VS의 두개내 미세환경을 재구성합니다.
3. 샴 그룹: 동물 수술과 종양 세포 이식이 운동실조증에 미치는 영향을 평가하기 위해, 가짜 수술과 CPA 부위에 생리식염수 주사를 받은 가짜 수술 그룹을 포함시켰습니다.
4. 대조군으로 종양이 없는 쥐 그룹을 포함하세요.
5. 종양 진행을 모니터링하기 위해 가우시아 루시페라제 리포터 유전자를 발현하는 Nf2^-/- 세포(Gluc)를 사용하고, 착상 후 3일마다 혈장 글루크를 측정합니다.
6. 간단히 13 μL의 혈액을 EDTA 튜브에 모아 응고를 방지하세요. 혈액 샘플을 96웰 플레이트에 옮기고,^{앞서 설명}한 6,7,8,9와 같이 Gluc 활도를 측정합니다.

2. 운동실조 검사

1. 동물 간 변동성을 최소화하기 위해 네 가지 행동 검사를 고정된 순서로 수행하세요. 검사는 다음 순서로 진행합니다: (1) 뒷다리 클래싱 테스트, (2) 레지 테스트, (3) 보행 평가, (4) 척추 평가. 테스트 사이에 최소 2-5분의 휴식 간격을 두어 쥐를 다시 집 케이지로 돌려보내세요. 휴식 시간 동안 동물을 관찰하고, 정상적인 탐색 행동이 재개될 때만 다음 검사로 진행하세요. 과도한 스트레스나 피로의 징후가 관찰되면 검사를 중단하세요. 약 45-60분 이내에 10마리의 마우스 코호트에 대해 4회의 운동실조 검사를 완료하세요. 검사 간 휴식 시간을 포함해서요.
2. 뒷다리 클래싱 테스트
   참고: 뒷지-잡기 검사는 쥐의 신경근 협응, 운동 긴장도, 자세 조절을 평가합니다. 운동실조증이 있는 쥐는 뒷다리가 복부 쪽으로 후퇴하거나 움직여 운동 조정과 근육 긴장 조절 장애를 반영합니다⁵.
   1. 꼬리 밑부분을 부드럽게 잡아 불편함을 방지할 수 있도록 단단하면서도 가볍게 잡아주세요. 놀라움 반응을 줄이기 위해 들어 올리기 전에 잠시 우리 뚜껑이나 손으로 동물을 지지하세요.
   2. 마우스를 천천히 들어 올려 몸을 완전히 펴고 장애물이 없는 상태로 공중에 떠 있게 하세요. 쥐는 케이지나 테스트 표면에서 최소 10cm 이상 위에 두세요.
   3. 약 10초간 매달린 자세를 유지하며 돌리거나 흔들지 않고 뒷다리와 꼬리의 위치를 관찰하세요.
   4. 아래에 설명된 뒷다리 자세를 평가하세요.
      1. 양쪽 뒷다리가 복부에서 바깥쪽으로 뻗어 있을 때 정상적인 자세를 식별하세요.
      2. 한쪽 또는 양쪽 팔다리가 복부 쪽으로 후퇴하거나 서로 교차할 때 비정상적인 자세를 식별하라. 이는 운동실조나 신경학적 장애와 관련된 뒷다리 잡기임을 나타낸다.
   5. 미리 정의된 점수 체계를 사용해 행동을 기록하거나, 블라인드 사후 분석을 위해 짧은 영상을 촬영하세요.
      참고: 스트레스를 최소화하기 위해 각 검사 시간을 ≤10초로 제한하세요.
3. 레지 테스트
   참고: 레지 테스트는 쥐의 균형, 협응, 미세 운동 조절을 평가합니다. 이 검사는 좁은 절벽을 따라 걷고 균형을 잃지 않고 안전하게 우리 케이지로 내려갈 수 있는 능력을 측정합니다. 소뇌 기능 장애나 전정 운동실조증이 있는 쥐는 이 작업 중에 일반적으로 미끄러지거나 넘어지거나 자세가 불안정해지는 모습을 보인다⁵.
   1. 케이지를 벤치 높이(~1m)의 안정적이고 평평한 표면 위에 놓으세요.
   2. 테스트 케이지의 한쪽 끝(그림 1C)을 하우징 케이스(그림 1D)에 연결하여, 케이지 사이에 수직 간격이나 장애물이 없도록 하여 쥐가 점프하거나 떨어지지 않고 부드럽고 자연스럽게 홈 케이지(그림 1B)로 내려갈 수 있도록 합니다.
   3. 삼각대에 30°-45° 각도로 선반을 향해 비디오 카메라를 설치하여 측면 움직임과 하강 모두를 포착하세요.
   4. 눈부심을 최소화하고 쥐의 팔다리와 꼬리가 명확하게 보이도록 조명을 조절하세요.
   5. 꼬리 밑부분을 살짝 들어 올리고 다른 손으로 몸통을 받쳐 주세요. 네 발이 모두 표면에 닿도록 쥐를 선반 중앙에 놓으세요. 쥐가 균형 잡히고 경계하는 모습일 때만 꼬리를 놓으세요.
   6. 쥐가 외부의 지시 없이 난간을 자유롭게 걸을 수 있게 하세요. 쥐가 최소 10초 이상 또는 케이지 안으로 내려올 때까지 녹화하세요.
   7. 미끄러지지 않고 난간에 균형을 잡고, 우리나 플랫폼 쪽으로 난간을 따라 걸어가는 능력을 관찰하세요.
   8. 쥐당 세 번의 독립 실험을 수행하며, 실험 간격 ~2분을 두세요. 동물 사이의 선반 표면을 70% 에탄올로 청소해 향기 단서를 제거하세요.
   9. 모든 검사는 조용한 환경에서 일정한 조명과 최소한의 배경 소음이나 진동에서 진행하세요. 피로와 학습 효과가 성과에 영향을 줄 수 있으니, 같은 날 과도하게 시험을 반복하는 것은 피해야 합니다.
4. 보행 평가
   참고: 보행 평가 검사는 자유롭게 움직이는 쥐의 운동 조정, 보폭 패턴, 자세 안정성을 평가합니다. 운동실조증이 있는 쥐는 보폭이 짧아지고, 움직임이 불안정하며, 발바닥 위치가 불규칙한 경우가 많아 협응력과^{균형 조절에} 결함이 있음을 나타냅니다. 5.
   1. 곧고 평평한 활주로에는 흰색 복필지(8.5 × 11인치)를 깔아두세요. 종이 끝에 홈 케이지를 놓아 쥐가 종이 위를 걸어가도록 유도하세요.
   2. 무독성 잉크패드를 사용해 앞발과 뒷발에 두 가지 대비되는 색상(예: 앞발은 파란색, 뒷발은 빨간색)을 가볍게 코팅하세요(그림 1E).
   3. 마우스를 활주로 시작 지점에 두고, 외부의 자극 없이 종이 위를 자유롭게 걸을 수 있게 하세요.
   4. 다음 매개변수를 관찰하고 측정하세요:
      보폭 길이: 같은 발을 여러 번 놓는 거리.
      기본 너비: 왼쪽과 오른쪽 뒷발자국 사이의 횡거리.
   5. 마우스당 두세 번 돌리고, 테스트 사이에 휴식을 취하세요.
      참고: 무독성, 빠르게 마르는 잉크를 사용하고, 발바닥에만 코팅하세요. 번짐을 방지하기 위해 각 시도 후에는 종이를 교체하세요. 잉크를 적게 발라서 발자국이 흐려지지 않도록 하세요. 잉크가 과도하면 보폭 측정의 정확도가 떨어집니다.
5. 척추만증 평가
   참고: 후추증 평가는 자연 운동 중 척추 정렬과 자세 이상을 평가합니다. 신경학적 또는 근육 기능 장애가 있는 쥐는 종종 지속적인 등쪽 굽음 또는 척추가 구부러지는 모습을 보인^다.
   1. 마우스를 표면 위에 놓고 몇 초간 자유롭게 걷거나 탐색하게 하세요. 갑작스러운 움직임이 일시적으로 자세를 바꿀 수 있으니 동물을 놀라게 하지 마세요.
   2. 옆모습에서 짧은 영상을 녹화해 줄기 곡률을 기록하세요.
   3. 걷는 동안 쥐의 자세를 관찰하며, 아래에서 설명한 척추 정렬과 몸통 곡률에 집중하세요.
      1. 쥐가 등을 곧게 펴거나 약간 아치형으로 유지하며 부드러운 몸 움직임을 할 때 정상적인 자세를 식별하세요.
      2. 쥐가 비정상적으로 굽거나 굽은 척추, 뻣뻣한 몸통, 보행 중 유연성 저하가 특징인 후만증(후추증)을 보일 때 비정상적인 자세를 식별합니다.

3. 무운동실조 검사 분석

참고: 관찰자 편향을 최소화하기 위해 실험 그룹 배정에 눈이 가린 관찰자가 모든 행동 점수를 수행하십시오.

1. 레지 테스트 점수 매기기
   1. 쥐가 부드럽게 난간을 따라 걷고, 균형을 유지하며, 미끄러지지 않고 우리 안으로 내려가면 3점을 부여합니다.
   2. 쥐가 망설임이나 가벼운 발바닥 미끄러짐 같은 경미한 장애가 있지만 회복하여 안전하게 내려오면 점수 2를 부여하세요.
   3. 쥐가 빈번한 미끄러짐, 쭈그려 앉은 자세, 균형을 위해 꼬리를 과도하게 사용하는 경우, 또는 하강 지연 등 중간 정도의 장애가 나타나면 점수 1을 부여하세요.
   4. 마우스가 심각한 장애를 보이거나, 균형을 잡지 못하거나, 난간에서 떨어지거나, 움직이기를 거부하면 0점을 부여하세요.
2. 뒷다리 잡기 테스트 점수
   1. 쥐가 뒷다리를 바깥쪽으로 일관되게 펼치고 잡은 흔적이 없다면 3점을 부여하세요.
   2. 쥐가 한쪽 뒷다리가 간헐적으로 후퇴하는 경미한 장애가 나타나면 점수 2를 부여하세요.
   3. 복부 근처에 유지되는 양쪽 뒷다리가 부분적으로 후퇴하는 중간 정도의 장애를 보일 경우 점수 1을 부여합니다.
   4. 관찰 기간 대부분 동안 양 뒷다리가 복부에 꼭 붙어 있을 경우 심각한 장애가 나타나면 0점을 부여하세요.
3. 보행 점수 산정
   1. 마우스가 일정하고 조화로운 걸음걸이로 직선으로 움직일 때 점수 3점을 부여하세요.
   2. 마우스가 약간 불안정하거나 옆으로 편트하며 천천히 걷거나, 한쪽으로 절뚝거리거나, 넓고 원을 그리는 이동 등 경미한 장애가 보일 경우 2점을 부여하세요.
   3. 쥐가 보행 장애가 뚜렷하거나 두 발 또는 세 발만 사용하거나 몸 일부를 끌거나 좁은 원을 그리며 움직이는 등 중간 정도의 장애가 나타나면 1점을 부여하세요.
   4. 마우스가 심각한 장애를 보이거나, 효과적으로 보행이 불가능하거나, 정지해 있거나 통제되지 않은 옆으로 구르는 동작을 보일 경우 0점을 부여하세요.
4. 척추후만증 점수 체계
   1. 마우스가 휴식과 걷기 모두 평평하고 곧게 뒤로 젖혀져 있으면 3점을 부여하세요.
   2. 마우스가 경미한 장애가 보이고, 휴식 시 등이 약간 휘어져 움직임 시 곧게 펴지면 점수 2를 부여하세요.
   3. 쥐가 중간 정도의 장애를 보이고, 휴식 시 등은 적당히 굽고, 걷는 동안에는 곡선을 유지한다면 1점을 부여하세요.
   4. 관찰 기간 내내 심하게 허리를 굽혀 정상적인 움직임이 제한되는 경우, 0점을 부여하세요.

4. 평가자 간 신뢰도 평가

1. 공식 점수 매기기 전에 대표적인 예시 영상을 사용해 점수 기준 해석을 표준화하는 관찰자를 훈련하세요.
2. 관찰자 편향을 최소화하기 위해, 치료 그룹과 실험 시점에 눈이 먼 두 명의 훈련된 관찰자가 모든 행동 검사를 독립적으로 채점합니다.
3. 코헨의 카파 계수를 사용하여 각 행동 분석에 대한 평가자 간 신뢰도를 정량화합니다. 카파 값을 다음과 같이 해석하라: <0.40, 일치가 낮음; 0.40-0.60, 중간 정도 일치; 0.60-0.80, 상당한 합의; 그리고 >0.80, 거의 완벽한 일치입니다.
4. 녹화된 영상을 공동 검토하여 점수 차이를 해결하고 합의 점수를 달성하세요⁵.

결과

CPA 종양 성장은 VS 마우스 모델에서 운동실조증을 유발합니다

종양 유발 운동실조증을 평가하기 위해 두 개의 실험 코호트를 구축하였습니다. 첫째, 동물 수술과 종양 세포 이식이 운동실조증에 미치는 영향을 평가하기 위해 쥐들은 가짜 수술과 CPA 부위에 식염수 주사를 받았습니다. 가짜군 쥐의 운동실조 증상은 수술하지 않은 대조군 쥐와 비교되었습니다. 두 번째 코호트에서는 Nf2^-/- 종양을 CPA 부위에 주입하였고, 운동 실조 증상을 종양이 없는 정상 마우스와 비교하였다.

운동실조증 평가를 위해 우리는 다음을 수행했습니다: i) 레지 테스트, ii) 하지포지 클래스핑 테스트, iii) 보행 평가, iv) 척추만증 평가. 이 네 가지 검사의 점수를 합산하여 전체 무운동 운동화 점수를 산출했습니다. 운동실조 증상이 없는 정상 비종양 쥐는 일관되게 최대 운동실조 점수 1...

토론

여기서 설명한 행동 검사들은 VS 및 관련 전정 장애의 마우스 모델에서 운동실조 및 운동 조정 결손을 평가하는 견고하고 정량적인 틀을 제공합니다. 헌팅턴병, 척수뇌 운동실조증¹⁰과 같은 신경퇴행성 질환 모델에 대한 확립된 프로토콜을 바탕으로 한 이 검사들은 NF2-SWN에서 종양 유발 전정 기능 장애를 특성화하는 데 매우 적합합니다. 여러 행동 측정을 결합함으로써, 이 접근법은 양측 VS 환자에서 자주 영향을 받는 운동 조정, 균형, 자세, 운동 등을 포괄적으로 평가할 수 있게 합니다.

각 검사는 운동 성능의 상호보완적인 측면을 측정합니다. 레지 테스트는 동적 균형과 고유수용감각에 도전하며, 전정신경 손상으로 인해 발생할 수 있는 미묘한 협응력 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

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