방법 논문

고래류 모니터링을 위한 고래 관찰 선박에서 채취한 환경 DNA 샘플

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DOI:

10.3791/70334

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2026년 4월 10일

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 고래 관찰 선박에서 고래류 환경 DNA(eDNA) 샘플을 수집하는 표준화된 작업 흐름을 설명합니다. 연구자와 훈련된 시민 과학자의 실현 가능성을 우선시하며, 환경 조건, 여과 시간, 탁도, 그리고 실내적 물류가 적용의 실질적 한계를 정의합니다.

초록

환경 DNA(eDNA)는 고래류 모니터링을 위한 비침습적 접근법을 제공하지만, 운영 플랫폼에서 널리 적용되려면 표준화되고 실현 가능한 샘플링 워크플로우가 필요합니다. 이 연구는 고래 관찰선에서 고래류 eDNA를 수집하는 프로토콜을 설명하며, 지정된 환경 및 물류 조건 하에서 연구자와 훈련된 시민 과학자들이 구현하도록 설계되었습니다. 이 접근법은 플루크프린트 대상 해수 수집, 자기 보존 필터를 이용한 선내 여과, 그리고 하류 분자 분석을 통합하여 실제 환경에서 운영 가능한 데이터 생성을 지원합니다. 이 프로토콜은 2024년에 북대서양과 지중해의 세 지역(아이슬란드, 포르투갈, 이탈리아)에서 여러 고래류 분류군을 대상으로 한 통합 현장 캠페인에서 시행되었습니다. 방법 성능은 혹등고래(Megaptera novaeangliae)의 미토콘드리아 DNA를 표적으로 하는 새롭게 개발된 종 특이적 정량 PCR 분석법을 사용하여 평가되었으며, 다양한 환경 및 물류 조건에서 일관된 검출률을 입증하였습니다. 현장 구현과 오염 통제에 대한 실질적인 지침을 제공함으로써, 이 프로토콜은 재현 가능한 eDNA 기반 고래류 모니터링을 지원하고, 해양 생물다양성 연구에서 지역 간 비교 가능성을 촉진합니다.

서론

고래류 및 기타 광범위한 종을 포함한 해양 거대 동물의 효과적인 보전 관리는 생물다양성 보호를 위해 필수적입니다. 최상위 포식자이자 생태계 공학자로서 고래류는 영양 조절, 영양 순환, 그리고 해양 분지 전반의 생태학적 회복력에 기여합니다. 그러나 이러한 이동성이 높은 종에 대한 포괄적인 생태학적 지식을 생성하는 것은 여전히 어렵고 종종 자원 집약적인 모니터링 프로그램에 의존합니다. 생검 샘플링, 사진 식별, 수동 음향 모니터링, 위성 원격 측정, 항공 조사와 같은 기존의 접근법은 고래류 생태학에 중요한 통찰을 제공했으나(3,4,5,6,7), 이러한 방법들은 종종 비용이 많이 들고, 물류가 까다롭으며, 공간적으로 제한적이거나 침습적이며, 엄격한 윤리적·규제 감독의 대상이 됩니다 8 . 그 결과, 샘플링 빈도, 지리적 범위, 이해관계자 참여 기회가 특히 광범위하거나 희귀한 종 연구에서는 제한적입니다.

환경 DNA(eDNA, 유기체가 환경에 유전적으로 방출하는 유전 물질로 정의됨) 샘플링은 수질 샘플에서 수생 생물을 탐지하는 강력하고 비침습적인 도구로 부상했습니다 9,10. 종별 정량 PCR(qPCR) 분석법은 미토콘드리아 DNA 조각을 표적으로 하여 고고래류를 포함한 해양 분류군의 고민도와 특이적 검출을 가능하게 합니다. 존재/부재 검출을 넘어, 상대 eDNA 신호 세기와 표적 DNA 서열은 근접성, 상대적 개체수, 집단 수준의 유전 패턴과 관련된 귀중한 정보를 제공합니다 15,16,17,18,19. 또한, 고래 근처에서 채취된 환경 샘플에는 먹이 종, 공생체, 기생충 등 공존 분류군의 DNA가 자주 포함되어 있어 더 넓은 생태학적 연관성을 뒷받침합니다 20,21,22. 이러한 진전은 eDNA 기반 접근법이 전통적인 방법을 보완하고 해양 시스템 전반에 걸친 고래류 연구 범위를 확장할 잠재력을 보여줍니다23,24.

이러한 장점에도 불구하고, 해양 거대동물에 대한 eDNA 기반 모니터링은 대표성 샘플링, 공간 범위, 방법론적 재현성 측면에서 지속적인 도전에 직면해 있습니다. 특히 DNA가 빠르게 희석되고 표적 종이 넓은 분포 범위와 낮은 밀도를 가진 개방 해양 시스템에서 그렇습니다. 이러한 제약을 해결하려면 광범위한 공간적·시간적 규모에 걸쳐 적용 가능한 확장 가능하고 운영 가능한 샘플링 프레임워크가 필요합니다. 시민 과학 이니셔티브는 생태 데이터 수집을 확대하고 해양 보전에 대한 대중 참여를 촉진하는 데 효과적임이 입증되어, 대규모 eDNA 기반 모니터링의 유망한 경로가 되었습니다 27,28,29,30. 고래 관찰 선박은 eDNA 샘플링에 매우 적합한 활용도는 낮지만 매우 적합한 플랫폼을 제공하며, 계절과 지역에 걸쳐 고래류 서식지에 정기적으로 접근할 수 있게 합니다.31, 32, 33. 전 세계 고래 관찰 산업은 광범위한 운영 네트워크를 지원하며(34), 이전 연구들은 상업 선박,페리 등 다른 기회주의적 플랫폼에서 고래류 eDNA를 수집하는 것이 가능함을 입증했으며, 사진 식별 및 행동 관찰과 결합된 표적 샘플링을 통해36,37. eDNA 연구의 급속한 확장은 상당한 방법론적 혁신을 가져왔지만, 해양 시스템 간 생물학적 변이와 기술 발전 속도는 프로토콜 조화와 비교 가능성 확보 노력을 복잡하게 만듭니다. 따라서 표준화되면서도 유연한 현장 방법론은 특히 대규모 다국적 모니터링 이니셔티브에 필수적입니다38.

eDNA 검출은 여과된 물의 양, 여과 전략, 여과 재료, 그리고 기공 크기에 의해 영향을 받습니다. 더 큰 부피를 필터링할수록 일반적으로 eDNA 수량과 고래류를 포함한 척추동물 대상의 탐지 확률이 증가합니다. 그러나 생산적이거나 탁한 물에서는 빠른 여과 막힘으로 여과 효율이 제한될 수 있어 달성 가능한 부피와 운영 타당성45,46 사이의 절충이 필요하다. 고래 꼬리의 획으로 인한 표면 교란인 플루크프린트(flukeprints) 샘플링은 최근 방출된 생물학적 물질이 수면 근처에 집중되어 있어 고래류 eDNA 탐지성을 지속적으로 향상시키는 것으로 입증되었습니다. 밀폐된 자가 보존 필터 시스템의 사용은 취급 단계와 오염 위험을 줄여 시민 과학 응용에 적합합니다38,42. 또한, 생물학적 복제와 일상적인 현장 제어의 포함은 탐지 실패를 최소화하고 데이터 신뢰성을 향상시킵니다49, 50, 51.

프로토콜 개발 및 검증
eWHALE 프로젝트52 는 유럽 전역의 연구자, 고래관찰 운영자, 시민 과학자들이 참여하여 eDNA를 이용해 해양 거대 동물을 모니터링하는 초국가적 이니셔티브입니다. 샘플링 작업은 북대서양과 지중해 전역의 여러 고래류 분류군을 대상으로 하며, 지역 특유의 적응을 포함한 핵심 프로토콜을 사용하여 지역 환경과 물류 조건을 반영하고 있습니다.

여기서는 2024년 아이슬란드 스칼판디 만, 포르투갈 아조레스, 이탈리아 리구리아해에서 308개의 해수 eDNA 샘플(샘플당 2회 복제, 21개 현장 대조군 포함) 분석을 통해 정교하게 수집된 고래류 eDNA 수집을 위한 표준화된 처음부터 끝까지 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 플루크프린트 표적 해수 수집, 자기 보존 eDNA 필터를 이용한 선내 여과, 그리고 하위 분자 분석을 통합합니다.

이 프로토콜은 훈련된 연구자와 시민 과학자들이 실제 고래 관찰 환경에서 구현할 수 있도록 설계되었으며, 잔잔하거나 중간 정도의 해상 조건에서 고래 관찰 활동에 지장을 주지 않고 선내 여과를 수행할 수 있습니다. 이 계획의 실행은 참여 기관들(예: 고래 관찰 운영자, 비영리 단체, 연구 기관)과의 협력을 통해 표본 추출 전략과 연구 목표를 정의해야 합니다. 핵심 매개변수는 재현성과 연구 간 비교 가능성을 보장하기 위해 고정되어야 하지만, 높은 탁도, 용기 움직임, 시간, 공간, 인력 제약이 있는 현장에서는 프로토콜에 맞춘 조정이 필요할 수 있습니다. 이러한 적응에는 필터 종류, 달성 가능한 여과 물 용량, 보조 장비 등이 포함됩니다. 각 샘플링 캠페인 내에서 일관되게 적용되어야 하며 투명하게 보고되어야 합니다. 데이터 품질, 투명성 및 지역적 비교 가능성을 지원하기 위해 프로토콜 단계 및 논의에서 상세한 운영 지침과 물류 고려사항이 제공됩니다.

qPCR 분석법 설계
프로토콜 성능을 평가하기 위해, 스칼판디 만(아이슬란드)53에서 정기적으로 발견되고 계절적으로 아조레스 제도에 분포하는 잘 연구된 철새인 혹등고래(Megaptera novaeangliae)의 eDNA를 현장에서 수집한 샘플을 증폭하였다. DNA 용해, 추출, qPCR 워크플로우는 eWHALE 프로젝트에 참여한 네 개 실험실이 참여한 실험실 간 링 테스트를 통해 최적화되어 기관 간 일관성과 적용 가능성을 향상시켰습니다14.

혹등고래 eDNA의 존재를 신뢰성 있게 검출하기 위해, 미토콘드리아 ND5 영역을 표적으로 하는 종 특이적 MGB(마이너 그루브 바인더) qPCR 분석법이 설계되고 검증되었습니다(표 1). 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 프로브는 DNA 서열 정렬및 분석을 위한 소프트웨어를 사용해 생성되었으며, 종의 특이성과 증폭 효율을 극대화하는 것을 목표로 했습니다(보충 파일 1-보충 그림 S1). 시험관 내에서 표적 및 비표적 분류군(Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens)을 사용하여 시험관 내에서 평가되었습니다. qPCR 표준 곡선 생성에 사용된 DNA 농도는 조직 유래 DNA 표준 42,57,58,59,60에서 정량화되었습니다. 검출 한계(LOD)는 샘플의 95%에서 양성 증폭을 보이는 최저 농도로 정의되었으며,11.61로 결정되었습니다. 혹등고래 eDNA 검출은 현장 샘플에서 양성 반응 비율과 신호 세기(즉, 사이클 임계값, Ct 값)를 3중 qPCR 측정에서 추정하여 증폭 변동성을 고려하고 검출 신뢰도를 향상시키는 57,60,62를 평가했습니다. 종 검출은 양방향 생거 시퀀싱으로 검증된 후 BLAST 분석63으로 확인되었습니다.

qPCR 데이터는 평균 ± 표준편차(SD)로 제시됩니다. 그룹 간 통계적 유의성은 비모수 Mann-Whitney U 검정과 Welch의 2표본 t 검정을 사용하여 평가하였습니다. 차이는 p < 0.05에서 유의한 것으로 간주되었습니다. 모든 분석은 통계 분석 소프트웨어64를 사용하여 수행되었습니다.

프로토콜

윤리 및 규제 준수
모든 고래류 관찰 및 이후의 수질 샘플링은 국가 및 지역 야생동물 규정에 따라 이루어져야 합니다. 유효한 고래 관찰 또는 연구 허가를 받은 허가된 선박에서만 샘플링을 수행하세요. 지역 규정에 따라 목표 종과의 최소 접근 거리를 유지하고, 샘플링 목적만을 위한 모든 조작은 피해야 합니다. 분석에 사용되는 고래 조직 샘플은 각 지역 허가 하에 수집되었으며, 국가 및 기관 규정을 준수하여 eWHALE 프로젝트 파트너들 간에 공유되었습니다.

참고: 샘플링 활동 전에 다음 문서를 검토하고 필요한 장비를 준비하세요: 재료표, eDNA 샘플링 키트(보충 파일 1-보조 그림 S2), 환경 DNA 샘플 채취에 사용되는 재료(그림 1), 샘플링 단계 및 탑재 여과 작업 흐름 개요(그림 2).

1. eDNA 샘플링 준비

  1. 현장 데이터 시트와 라미네이트 현장 프로토콜(보충 파일 2 및 보충 파일 3)을 포함한 현장 문서 자료를 준비하세요.
  2. 예비 장갑, 여분의 필터(샘플 복제당 필터 하나), 방수 마커, 전용 폐기물 용기를 준비하세요(그림 1A).
    참고: 취급 및 오염 위험을 최소화하기 위해 밀폐형 자기보존 eDNA 필터(1.2 μm 기공 크기)를 사용하세요65,66.
  3. 선박 유형과 선상 구성에 적합한 1개 이상의 강성 버킷을 준비하세요(보충 파일 1-보충 그림 S3).
    1. 영구 마커로 10L 양동이에 표시하세요. 10L 용량을 다루기 어렵다면 여러 개의 작은 양동이를 준비하세요.
    2. 만약 바다에 닿을 수 있는 범위가 제한된다면, 밧줄을 버킷에 단단히 묶으세요.
      참고: 용기 움직임이 과도할 경우 유출을 최소화하기 위해 뚜껑이 있는 버킷을 사용하세요(그림 1B).
    3. 소량 양동이를 결합할 수 있는 보조 eDNA 용기와 필요시 오염 없는 양동이 운송을 보장하기 위한 추가 운송 상자를 준비하세요(그림 1C).
  4. 휴대용 연동 펌프 또는 진공 워터 펌프를 준비하세요(그림 1D). 탑승 전에 펌프를 완전히 충전하고, 사용 직전에 전원을 끊으세요.
  5. 출발 전에 샘플링, 여과, 데이터 기록 역할을 할당하세요.
    주의: 모든 장비를 다룰 때는 장갑을 착용하고, 작업 중에는 장갑을 교체하세요.

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그림 1: 환경 DNA 샘플 채취에 사용되는 현장 조사 재료. (A) 자가 보존 eDNA 필터, 폐기통, 희석된 가정용 표백제가 든 짜는 병(1:10), 장갑, 현장 데이터시트, 방수 펜이 포함된 도구 키트; (B) eDNA 샘플링을 위한 버킷 유형의 예시; (C) 대량 양을 운반 및 여과하는 추가 eDNA 용기와 함상 양동이를 운반하는 용기 예시; (D) 수질 여과용 휴대용 펌프 예시. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 2: 고래 관찰 보트에서 환경 DNA 샘플링을 하는 개념도. 그림은 수질 샘플 수집과 선내 여과를 포함한 안내 단계를 설명합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

2. 장비 청소

  1. 청소 전에 일회용 장갑을 착용하세요.
  2. 가정용 표백제(5-6% 차아염소산나트륨)를 정제수(~50mL)와 1:10으로 희석하여 표백제 용액을 준비하세요(한 번에 50mL씩).
  3. 양동이, 뚜껑, 용기, 펌프 튜브 등 모든 표면에 고르게 튀기며 이 용액을 바르세요. 모든 표면에 최소 2-5분 정도 표백제 접촉 시간을 유지하세요.
  4. 수돗물로 3번 꼼꼼히 헹구세요(그림 3).
  5. 자재를 안전한 장소에서 자연 건조시키고, 탑승 전에 안전하고 깨끗한 공간에 보관하세요.

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그림 3: 청소 장비 단계. (A) 희석된 가정용 표백제 용액을 1:10 바르기; (B) DNA 없는 장갑을 사용해 고르게 퍼지기; (C) 수돗물로 세 번 꼼꼼히 헹군; 그리고 (D) 해당되는 경우 추가 재료(예: eDNA 용기)에 대해서도 이 과정을 반복합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

3. 수질 샘플 채취

참고: 각 선박이나 플랫폼에서 모든 안전 규정을 준수하며, 필요 시 구명조끼나 부력 작업복 착용을 포함합니다.

  1. 승객이 도착하기 전에 모든 자재를 기내에 가져가 지정된 깨끗한 공간에 보관하세요.
  2. 선박 선원과 함께 샘플링 시간, 선박 위치 조정.
  3. 고래의 잠수를 예상하기 위해 수면 상승 패턴을 관찰하세요(그림 4). 샘플 채취 전에 새 장갑을 끼세요.
  4. 고래가 잠수한 후 가능한 한 빨리 20L의 바닷물을 10분 이내 타임랩스로 채취하여 두 번의 10L 샘플 복제를 생성하세요.
  5. 수집된 물을 뚜껑이나 추가 멸균 용기를 사용해 선상의 지정된 여과 스테이션으로 운반하여 유출을 방지합니다(필요 시 포함).
  6. 데이터 시트에 종 식별, GPS 좌표, 시간, 샘플 복제 식별자를 기록하세요.
  7. 신고 직후 장갑을 바로 교체하세요.

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그림 4: 혹등고래의 수면 상승 순서. (A) 고래 바람; (B) 등을 아치형으로 젖히고 꼬리를 들어 올리기 후 다이빙; (C) 고래가 잠수한 후 수면에 남은 플루크발인 패턴. 이미지 출처: Ocean Missions (A, B, C, 2024). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

4. eDNA 여과

  1. 필터 백을 열고 필터를 출구로만 만지세요(보충 파일 1-보충 그림 S4).
  2. 흡입구를 스노클에 삽입하고 펌프 튜빙을 출구에 연결합니다(그림 5A,B).
  3. 스노클을 필터 하우징을 잠기지 않고 물 샘플에 잠기세요(그림 5C).
  4. 펌프(펌프 종류는 재료 표 참조)를 빠르고 일정한 유량으로 설정하세요.
  5. 10L 필터를 계속 필터하면서 유량 안정성을 모니터링하세요(기포, 찢어짐, 찢어짐, 밀봉 실패 여부를 확인하세요).
    참고: 여과 종료는 최대 45분으로 해야 합니다.
  6. 필터를 뒤집고 펌프를 30-60초 돌려 잔여물을 제거하세요. 필터 하우징에 눈에 띄는 습기가 남아 있지 않은지 확인하세요.
  7. 펌프를 끄고 튜빙을 분리하세요.
  8. 스노클은 폐기통에 버리고, 필터는 원래 봉투에 넣은 뒤 즉시 라벨을 붙이세요.
  9. 필터는 직사광선과 승객 구역에서 떨어진 채 밀폐된 단단한 용기 또는 냉각 상자(주변 >온도가 20 °C일 경우)에 보관하세요.
  10. 장갑을 교체하고 두 번째 복제를 위해 필터링을 반복하세요.

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그림 5: 온보드 필터링 설정 단계. (A) 필터 입구(흰색 부분)를 스노클(튜브)에 부착; (B) 펌프 튜빙을 필터 출구(노란색 부분)에 연결; 그리고 (C) 스노클의 일부를 수질 샘플에 담가. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

5. 현장 네거티브 컨트롤 및 데이터 보고

  1. 플루크프린트 샘플 다섯 개마다 필드 음성 대조군 하나를 필터링하세요.
  2. 육지로 돌아온 직후 장비 청소 전에 DNA 없는 타겟 물을 사용하세요.
  3. 각 여행 후에는 모든 데이터를 디지털 eDNA 샘플링 스프레드시트로 전송하세요(보충 파일 4).

6. 여과 보관 및 운송

  1. 자가 보존 eDNA 필터는 안전하고 건조한 용기, 그늘진 주변 온도 방 안, 또는 주변 온도가 20°C를 초과할 경우 냉장고에 보관하여 3개월 이상 보관하지 마세요.
  2. 배송 전에 필터백의 습기를 육안으로 점검하세요.
  3. 필터를 라벨링하여 얼음팩이 담긴 단열 용기에 담아 지정된 실험실로 배송하세요.

7. 실험실 분석

참고: 모든 실험실 절차는 전용 자외선 살균실에서 충분한 환기와 별도의 작업대를 갖추고 있으며, DNA 없는 장갑과보호 장비 55, 67, 68을 착용하여 수행하십시오.

  1. DNA 용해
    1. 필터마다 2mL 반응관을 라벨링하세요.
    2. 필터를 200mL Erlenmeyer 플라스크에 넣고 고무 뚜껑을 버리세요(그림 6A).
    3. DNA 없는 겸자를 사용해 막을 삼각형 모양으로 접어 2mL 반응관으로 옮기고, 끝은 아래를 향하게 합니다(그림 6B-D).
    4. 각 반응관에 380 μL TES 버퍼와 20 μL 프로테나제 K( 재료표 참조)를 추가하면 400 μL의 용해 버퍼가 생성됩니다(그림 6E).
    5. 소용돌이를 잠시 보여 56 °C에서 ≥3시간 동안 교반을 가해 배양합니다(그림 6F).
    6. 원심분리기 튜브를 18,626 × g에서 실온에서 10분간 사용했습니다.
      참고: 투명하거나 연한 색의 용해액은 소화가 성공적으로 진행되었음을 나타냅니다.
      참고: 용해액이 -20°C에 저장될 경우 이 단계에서 프로토콜이 일시적으로 중단될 수 있습니다.
  2. DNA 추출
    1. 인큐베이트는 추출 전 56°C에서 10분간 분해합니다.
    2. 세척판과 용출판에 피펫 추출 시약을 사용하며, 음성 대조군과 피펫 오류69 ( 보충 파일 1-보충 표 S1 참조).
    3. TES 버퍼를 사용해 플레이트당 추출 빈 1개를 포함하세요.
    4. 결합판의 각 웰에 300 μL의 용해액을 전달합니다. 각 웰에 버퍼 AL 300 μL와 이소프로필 알코올 300 μL를 첨가합니다. 전체 용해액이 300 μL를 초과하면 여러 개의 결합 플레이트를 사용하고, 첫 번째 결합 플레이트에 핵산 결합을 위해 30 μL 자기 입자를 추가하세요(재료표).
    5. 바인드 플레이트를 로드 커버로 덮으세요.
    6. 자기 구슬 기반 실험실 로봇에서 두 개의 결합판(총 400 μL 용해액; 재료표 및 그림 7 참조) 에 대한 예비 DNA 추출 프로그램을 실행하세요.
    7. 추출 화학물질은 지정된 폐기물 용기에 폐기하세요.
    8. 용출된 DNA를 표지된 1.5mL 반응관에 옮겨 −20°C에서 저장합니다.
      참고: 이 단계에서 프로토콜은 일시적으로 중단될 수 있습니다. 이 시점에서 억제제 제거 단계가 시행될 수 있습니다.
  3. qPCR
    1. 제조업체의 지침(재료표)에 따라 조직 추출물과 형광 기반 고감도 dsDNA 분석법을 사용하여 표적 종 DNA 표준을 준비하고 정량합니다. 10 ng/μL11,55에서 시작하여 1:10 직렬 희석으로 8점 표준 곡선을 생성합니다. qPCR 전에 얼리콥터 표준 시술을 하여 동결-해동 사이클을 최소화하세요.
      참고: 이 단계에서 프로토콜은 일시적으로 중단될 수 있습니다.
    2. 모든 qPCR 반응을 96웰 플레이트를 사용하여 3중으로 준비합니다.
    3. qPCR 플레이트당 1개의 무주형 대조군(분자급 수)과 1개의 추출 블랭크를 포함하세요.
    4. 보조 파일 1-보충 표 S2와 그림 8A에 따라 마스터 믹스를 준비하세요.
    5. DNA 로딩 후드에서 미리 준비된 DNA 표준과 3μL DNA 추출물을 마스터 혼합물이 포함된 각 웰에 추가합니다(그림 8B).
    6. 플레이트를 밀봉 필름으로 밀봉하세요(그림 8C).
    7. 3,500 × g 에서 10초간 원심분리기를 사용하고, 이를 실시간 정량 PCR 열사이클러에 적재합니다(그림 8D, E).
    8. 표 2에 명시된 최적화된 사이클링 조건에서 분석을 수행하고, 제조사 소프트웨어(재료표)를 사용해 데이터를 기록합니다11.

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그림 6: DNA 용해 작업 흐름. (A) 자기 보존 eDNA 필터의 고무 캡을 제거하여 Erlenmeyer 플라스크에 넣습니다; (B) 두 쌍의 겸자를 세 번 불태워 소독; (C) 필터 막을 접기; (D) 2mL 튜브에 삽입; (E) 용해 완충제와 단백질효소 K를 추가하고, (F) 샘플을 56 °C에서 3시간 배양합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하세요.

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그림 7: DNA 추출에 사용되는 재료와 장비. (A) 추출 준비를 위한 결합, 세척 및 용출판, 소모품 및 시약; 그리고 (B) 샘플 처리에 사용되는 자기 구슬 기반 실험실 로봇. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 8: qPCR 워크플로우. (A) 이전에 UV 멸균된 방(마스터 믹스 준비용 작업 후드 아래)에서 마스터 믹스를 준비함; (B) DNA 적재 스테이션에서 제시된 패턴에 따라 DNA 표준 물질, 추출물 및 통제 증류를 적재; (C) 밀봉판; (D) 원심분리기; (E) 실시간 정량 PCR 열사이클러에 로드합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

결과

이 최적화된 프로토콜을 사용하여 2024년에는 총 154개의 플루크프린트 샘플(308개의 eDNA 필터)이 수집되었으며, 이 중 3월부터 11월까지 스칼판디 만(아이슬란드; 현장 대조군 9개 및 혹등고래 복제 76개), 아조레스(포르투갈)에서 151개의 필터, 7월에 획득한 12개의 현장 대조군과 15개의 혹등고래 복제, 5월부터 10월까지 리구리아해(이탈리아; 현장 대조군 4개)에서 61개의 필터를 확보했습니다. 모든 샘플은 자기 보존 eDNA 필터를 사용하여 최대 10L의 바닷물(플루크 프린트 샘플당 두 번의 복제)을 수집하는 과정을 포함했습니다 (표 3). 현장 작업 중 두 가지 유형의 음성 대조군이 수집되었습니다: 장비를 표백제 세척 후 여과한 정제수와 항구 재진입 시 수집한 해수입니다. 표백제 세척 전에 표백제 세척 전에 고래류의 eDNA가 교차 오염될 가능성을 평가하기 위해 의도적으로 여과되었습니다. 각 샘플 채취 지점에서 샘플은 두 번에 걸쳐 인스브루크 대학교 동물학과 응용 동물생태학 연구소로 보내져 실험실 처리를 진행했습니다.

분석 및 제어 성능
44개의 필터 하위 집합(아이슬란드 스칼판디 만 현장 대조군 2개 포함 30개 복제, 포르투갈 아조레스 제도 파이알 및 피코 섬 주변 해역에서 14개 필터 포함 1개 현장 대조군)이 혹등고래 eDNA를 분석했습니다(그림 9). 신호는 3중 qPCR 반응으로 측정되었습니다. 샘플(즉, eDNA 필터)은 qPCR 복제 3개 중 1개가 증폭되면 양성으로 간주되었습니다. 본 연구에서 검출 한계(LOD)는 0.0001 ng/μL(평균 Ct of LOD = 35.8)로 계산되었습니다. 분석된 41개 필터 중 20개(49%)는 증폭을 보였고, 24개(58%)는 증폭이 없었습니다. 검출되지 않는 경우(Ct 값 없음)는 대부분 표적 DNA의 부재 또는 극히 낮은 농도를 반영하는 것으로 보입니다. 아조레스 제도의 13개 필터 중 5개(38%)와 아이슬란드의 28개 필터 중 19개(68%)가 검출되지 않았습니다. 추출 블랭크는 MarVer3 분석법70을 사용해 해양 척추동물 DNA를 스크리닝했으며, DNA 추출 중 교차 오염이 없어 증폭이 검출되지 않았음을 나타냈습니다. 현장 대조군(NC)과 qPCR 대조군(NT)은 증폭을 얻지 못해 현장 작업 및 qPCR 스크리닝 중 오염이 없음을 확인했습니다(표 4).

20개의 양성 필터 중 9개(22%)는 검출 한계(LOD; 0.0001 ng/μL) 이하의 Ct 값을 최소 한 개 이상 보여 신뢰할 수 있는 검출로 분류되었습니다. 여기에는 아조레스 제도에서 온 8개 필터 중 4개(50%)와 아이슬란드에서 12개 중 5개(42%)가 포함되어 있습니다. 추가로 11개의 필터(27%)가 LOD 이상의 Ct 값을 생성했으며, 이 중 4개는 아조레스(50%), 7개는 아이슬란드(58%)에서 나와 그럴듯한 탐지를 나타냅니다(그림 10). 비교 분석 결과, 아조레스 필터의 평균 주기 임계값(Ct)이 약간 낮았음이 드러났습니다(34.7 ± 3.60; n = 8) 아이슬란드 필터(36.9 ± 3.60)와 비교했을 때; n = 10). Mann-Whitney U 검정은 이 차이가 통계적으로 유의미하지 않음을 보여주었다(U = 199.0, p = 0.204). Ct값과 DNA 신호 세기 간의 반비례를 고려할 때, 결과는 아조레스 필터에서 표적 혹등고래 eDNA 농도가 약간 더 높음을 나타냅니다(그림 11).

타당성 제약 조건
한 번의 플루크프린트 샘플 수는 여행 시간과 날씨 조건에 따라 달랐습니다. 아조레스 제도에서 3시간 투어 동안 약 2에서 3개의 샘플(최대 6개의 eDNA 필터 생성), 이탈리아에서 ~8시간 동안 2~4개의 샘플(최대 8개의 필터 획득), 아이슬란드에서 3.2시간 투어 동안 1에서 2개의 샘플(최대 4개의 필터 생성)이 수집되었습니다. 아조레스와 이탈리아에서는 여과 성능이 대체로 높았습니다. 아조레스 제도에서는 10-15분 이내에 10L의 바닷물이 꾸준히 여과되었고, 이탈리아에서는 같은 양의 해수가 약 10분 만에 걸러졌습니다. 아이슬란드에서는 여과 용량이 4.5에서 10L(평균 = 8.5L) 사이였으며, 여과 시간은 잦은 필터 막힘으로 인해 평균 40분 ~40분으로 추정됩니다. 이는 연구 지역 내 미세먼지 때문일 가능성이 큽니다. 구체적으로, 98개 필터 중 46개(47%)에서 10L의 부피가 성공적으로 필터링되었고, 31개의 필터(32%)에서는 7L에서 10L 사이의 부피가 얻어졌으며, 21개의 필터(21%)에서는 4L에서 7L 사이의 부피가 확보되었습니다(보충 파일 1-보충 표 S3).

프로토콜은 5개의 플루크프린트 샘플마다 필드 음성 대조군 1개를 필터링할 것을 권장합니다. 그러나 운영 고래 관찰 조건에서는 제한된 여과 가용성, 시간 제약, 선박 지연 등 물류적 제약으로 인해 이 조건을 완전히 충족시키지 못했습니다. 이로 인해 대조군 대 표본 비율은 아이슬란드(9월 9일)에서 1:10.7, 아조레스(12/151)에서 1:12.6, 이탈리아(1:151년 4월)로 감소했습니다. 이러한 편차에도 불구하고, 현장 또는 실험실에서 증폭된 음성 대조군은 없었습니다.

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그림 9: 샘플 위치 개요. 지도의 검은 점은 아이슬란드의 스칼판디 만과 아조레스 제도에서 혹등고래 플루크 발자국에서 샘플을 채취한 위치를 나타냅니다. eDNA 필터의 이름은 해당 샘플링 영역 근처에 표시되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 10: 아조레스와 아이슬란드의 일부 eDNA 필터에서 검출된 결과.qPCR 평균 Ct 값과 DNA 신호 강도를 아조레스 및 아이슬란드 양성 검사(최소 한 번의 양성 PCR 복제)에 대해 SD와 LOD를 포함합니다. 막대는 LOD에 대한 신호 세기에 따라 색칠됩니다: 짙은 파란색 = 강한 신호(Ct ≤ 35.8)는 신뢰할 만한 탐지를, 연한 파란색 = 약한 신호(Ct > 35.8)는 그럴듯한 탐지를 나타냅니다. SD 오류는 PCR 복제 간 변동성을 나타냅니다. 빨간색 점선은 LOD(Ct = 35.8)를 나타냅니다. 각 막대 위에 평균 Ct가 표시됩니다. 약어: Ct = 사이클 임계값; SD = 표준편차; LOD = 탐지 한계. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

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그림 11: 아조레스와 아이슬란드에서 발견된 혹등고래 DNA 검출의 평균 주기 임계값. 박스 플롯 내의 검은선은 중앙값을 나타내며, 빨간 사각형은 평균 Ct(SD)를, 수염은 아조레스와 아이슬란드의 최소값과 최대값을 나타냅니다. Mann-Whitney U 검정은 이 차이가 통계적으로 유의미하지 않음을 보여주었다(U = 199.0, p = 0.204). 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

표 1: ND5 표적 qPCR 분석의 프라이머 및 프로브 서열. 이 서열에는 순방향 및 역방향 프라이머, MGB 프로브 서열(5′-3′), 최적 어닐링 온도, 검출 한계(LOD)가 포함됩니다. (*) LOD는 표적 종의 DNA 중 가장 낮은 DNA 농도(ng/μL)로, 이 경우 PCR 복제의 ≥95%가 양의 증폭을 가져온 상태입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 2: 혹등고래 eDNA qPCR 분석법의 최적화된 사이클링 조건. 이 최적화된 qPCR 설정은 95°C에서 10분(효소 활성화), 95°C에서 15초(변성), 60°C에서 90초(어닐링/연장)입니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 3: 현장 샘플링 구성 개요. 아조레스, 아이슬란드, 이탈리아 전역의 샘플링 지역, 현장 파트너, 선박 유형, 목표 종, 샘플 기간, 샘플 복제 개요. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

표 4: 환경 샘플 및 대조군에 대한 qPCR 검출 요약. 양성 검출(노란색으로 강조), qPCR 복제 Ct, 검출 결과가 나타납니다; 샘플은 적어도 한 번의 qPCR 복제에서 증폭이 나타나면 양성으로 분류되었습니다. "No Ct"는 증폭이 없음을 의미하고, 음성 대조군은 증폭이 없음을 나타내며, M . novaeangliae 표준 희석 수열은 분석의 성능과 LOD를 정의하는 데 표 하단에 포함된다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 1: 프로토콜 적용에 관한 추가 정보를 제공하는 보조 도표와 표가 포함되어 있으며, 프라이머 설계 eDNA 샘플링 키트, 고래 관찰용 선박 유형, 자가 보존 eDNA 필터 특성, DNA 추출 및 qPCR 반응용 시약 부피, 샘플링 영역별 여과 속도 차이 등을 포함합니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: 고래류 eDNA 샘플링 중 사용된 현장 데이터시트. 순항 메타데이터, 고래류 관찰, 샘플 및 필터 정보를 기록하는 표준화된 양식. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보충 파일 3: 고래 관찰선에서 고래류 eDNA 샘플링을 위한 단계별 현장 프로토콜, 장비 세척, 해수 수집 및 선내 여과, 샘플 보고 및 보관 포함. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 4: 고래류 eDNA 샘플링 스프레드시트 템플릿. 샘플 채취 및 온보드 여과 후 샘플 정보를 기록하는 표준화된 양식. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

운용 타당성 및 현장 구현
여기서 제시된 프로토콜은 검출 민감도와 실제 제약 조건을 균형 있게 조화시키는 표준화된 eDNA 워크플로우를 제공합니다. 대량의 플루크프린트 표적 샘플링, 자기 보존형 밀폐 필터를 이용한 온보드 여과, 표준화된 오염 관리 조치를 통합함으로써, 프로토콜은 지역과 샘플링 캠페인 전반에 걸쳐 적용 가능한 재현 가능한 틀을 제공합니다. 이 접근법은 eDNA가 기존 해양 모니터링 기술의 비용 효율적이고 확장 가능한 보완 수단으로 점점 더 인식되고 있는 것과 일치합니다 9,10,22.

이전의 고래류 eDNA 연구는 주로 대형 연구선에서 트랜섹트 기반 해수 샘플링이나 고래류 목격 지점 근처의 기회주의적 소량 샘플링에 의존해 왔습니다. 트랜섹트 기반 접근법은 넓은 공간적 범위를 가능하게 하지만, 희석되거나 시간적으로 분리된 DNA 신호를 포착하는 경우가 많아 표본 채취가 표면 근처에서 이루어져도 희귀하거나 일시적인 종71의 검출을 제한하며, 일반적으로 전문 용기와 인프라가 필요합니다 25,37,72. 반대로, 수면 위로 떠오르는 고래 근처에서 소량 샘플링은 만남 특이성을 높이지만, 제한된 수량과 일관성 없는 여과 관행으로 인해 거짓 음성에 취약하다(72,73). 플루크 프린트를 명시적으로 표적으로 표적으로 하고 선상에서 대량의 양을 필터링함으로써, 여기서 제시된 작업 흐름은 고래 관찰 작전의 시간과 공간 제약 하에서도 저농도 고래류 eDNA를 포착할 확률을 높입니다. 밀폐형 자기 보존 필터의 사용은 취급 및 오염 위험을 더욱 최소화하여 현장 적용 보존 완충제의 필요성을 없애고, 제한된 선내 조건 하에서의 물류를 단순화합니다42,66.

연구 간 비교 가능성을 보장하기 위해 다음 매개변수는 샘플링 캠페인 내에서 고정되어야 합니다: 눈에 띄는 고래류 플루크프린트에서 직접 해수 채취; 플루크 프린트당 10L 생물학적 복제 두 개; 자기보존형 eDNA 필터의 사용은 표준화된 오염 관리 조치 중 온보드 필터링을 배출하며, 정해진 최소 주파수의 정기장 음수 대조를 포함합니다; 그리고 적절한 대조군과 함께 3회로 수행된 종특이적 qPCR 스크리닝. 수분 수집 장비 및 취급, 여과 기공 크기, 펌프 종류 및 튜빙 구성, 여과 시간 및 막힘 조건 하에서의 여과 가능 부피, 선내 샘플 물류, 선적 전 단기 보관 조건 등 방법론적 틀을 훼손하지 않고 변동할 수 있습니다. eDNA 연구의 많은 처리 단계가 변동적이므로, 모든 샘플링 및 분석 단계를 엄격히 보고할 것을 강력히 권장합니다.

이 프로토콜의 실현 가능성은 잔잔하거나 중간 정도의 해양 상태(≤ Beaufort 3)에서 가장 높으며, 선내 시간과 공간이 플루크 프린트당 두 개의 eDNA 필터를 처리하고 필터당 10L의 여과수 용량을 허용할 때 가장 높습니다. 실제로는 훈련된 과학자들이 보포트 3까지 샘플링할 수 있지만, 시민 과학자들은 선박의 움직임과 난기류로 인해 평온한 조건에서만 작업해야 하며(보포트 1-2), 보포트 3에서는 때때로 고래 관찰 투어가 운영됩니다. DNA 분해를 최소화하기 위해 수분 수집 직후 가능한 한 빨리 여과를 시작해야 합니다 47,74. 선박의 바람 아래쪽과 하부에서 프로펠러로 인한 표면 eDNA 희석을 최소화하는 샘플링 전략은 표적 정확도와 신뢰성 높은 탐지를 더욱지원합니다. 역방향 조작을 피하고 양동이에 연결된 밧줄이 해수 샘플과 접촉하지 않도록 하는 것은 오염 위험을 더욱 줄여주며, 이는 수생 eDNA 모범 사례38에 부합합니다. 선박 구성 및 물류(예: 선박 높이, 움직임, 선내 공간 등)에 따라 일관되게 적용할 경우 두 가지 샘플링 전략이 지원됩니다: (i) 두 개의 별도 양동이를 이용해 두 번의 10L 복제물을 독립적으로 수집 및 여과하는 방법, 또는 (ii) 단일 20L 수샘플을 밀봉된 멸균 용기에 옮겨 안전하게 선내에 운송한 후 두 개의 10L 복제물로 나누어 여과하는 방법. 필터당 10L의 여과량은 고래 관찰 조건에서 탐지 확률과 여과 노력 사이의 실질적인 타협점을 의미합니다.

더 큰 부피는 희귀하거나 저농도 eDNA 포획 가능성을 높이고, 고래류 연구에서 흔한 위음성 결과를 줄이면서도 자기 보존 필터와 큰 기공 크기와 함께 사용할 경우 운영 가능함을 유지합니다 42. 높은 입자 하중, 선박의 움직임, 제한된 갑판 공간 또는 시간 제약은 여과 효율과 달성 가능한 부피를 감소시켜 프로토콜의 적용 가능성을 제한할 수 있습니다. 이러한 경우에는 수량 감소나 대체 여과 기공 크기 변경과 같은 프로토콜에 부합한 적응이 필요할 수 있으며, 데이터 비교 가능성을 유지하기 위해 샘플링 캠페인 내에서 일관되게 적용되어야 합니다. 이동 시간, 고래 조우 시기, 여과 능력이 가능한 표본 수를 결정합니다. 표준 3시간 고래 관찰 투어에서는 보통 1개에서 2개(가끔 3개)의 플루크프린트 샘플을 작업할 수 있으며, 운영이나 시민 과학 경험에 지장을 주지 않습니다. 장기 탐사에서는 매일 고래 관찰 노력에 따라 샘플링 용량이 증가합니다(예: 이탈리아 사례 연구에서는 하루 ~8시간). 실제로는 관광 붐비는 세 곳 모두에서 eDNA 샘플링을 시행할 수 있습니다.

eDNA 증폭 성공 및 오염 제어
특히 영양분이 풍부한 수역에서 채취된 환경 샘플에는 증폭을 억제하고 위음성 결과를 생성하는 PCR 억제제가 포함될 수 있습니다76. 동일 프로젝트42 내 아이슬란드 샘플에서 이전 분석에서는 억제가 발견되지 않았으나, 억제제 제거 단계의 포함은 일관된 증폭 성공을 보장했으며(재료표 참조), 수생 eDNA 워크플로우에 대한 최선의 실천 권고사항과 일치합니다14,55.

영역 전반에 걸쳐 일관된 qPCR 검출 성능은 프로토콜이 다양한 환경 조건에서 고래류 eDNA를 신뢰성 있게 포착함을 보여줍니다. 소규모 Ct의 변이는 온도, 탁도, 생산성의 지역적 차이를 반영하는 것으로 보이며, 이는 eDNA 방출, 분해 및 확산에 영향을 미친다75,76. 이 분석법의 검출 한계(0.0001 ng/μL)는 eWHALE 프로젝트14, 11, 42에서 개발된 다른 검증된 고래류 분석법에서 보고된 감도 범위 내에 있습니다. 검출률은 이전에 발표된 플루크프린트 기반 연구와 일치하며, 종의 행동과 수면 빈도가 탐지 성공에 미치는 영향을 강조했다41, 42, 47. qPCR 정량에는 조직 유래 DNA 표준이 사용되었으며, 이는 해양 eDNA 연구에서 흔히 사용되는 관행 57,72,77,78,79를 반영합니다. 이 접근법 은 절대 정량 11,61,80,81,82,83, 특히 저농도 및 이질적인 환경 샘플에서 분산을 초래할 수 있지만, 실제 샘플 복잡도를 반영합니다55,86. 합성 표준의 사용은 정량적 재현성과 연구 간 비교 가능성을 향상시킬 수 있으며, 향후 적용에 권장됩니다11,87.

잠재적 오염원으로는 교차 샘플 이동, 취급 과정에서 인간 또는 비표적 환경 DNA가 유입되어 위양성 검출로 이어질 수 있습니다88. 특히 시민 과학 운영의 제한된 조건 하에서 현장 및 실험실 처리 전반에 걸쳐 엄격한 오염 통제가 필수적입니다. 정기적인 장갑 교체, DNA 없는 장비 사용, 밀폐형 여과 시스템, 표준화된 교육, 현장 및 실험실 통제의 일상적 포함, 잠재적 오염 사건 문서화, 확립된 프레임워크에 따른 분석법 검증이 데이터 신뢰성과 종 검출 11,31,49,51,55,89. 플라스틱 사용은 현장 기반 분자 샘플링의 불가피한 한계이지만, 가능한 한 소비를 최소화하고 부분적으로 생분해성 여과 재료를 사용했습니다66.

한계, 확장성 및 미래 영향
필터 막힘은 스칼판디 만(아이슬란드)과 같이 탁하거나 생산적인 환경에서는 여전히 주요 제약 요인으로, 부유된 유기물과 플랑크톤 밀도가 여과 효율43.90을 감소시킬 가능성이 큽니다. 여과 시간, 필터 막힘 징후(예: 유량 감소, 필터 내 공기 방울, 펌프 압력 등)를 기록하고, 각 복제당 약 45분으로 여과 시간을 제한하는 것은 후속 해석과 비교를 지원합니다. 멸균된 부유 장치를 사용해 필터를 매달거나 중력 공급 여과 백을 사용하면 여과 중 취급 시간을 줄일 수 있으나, 후자는 자가 보존 eDNA 필터나 대용량(≥1 L)91과 호환되지 않을 수 있습니다. 더 큰 기공 크기(≥ 5 μm)는 여과율을 더욱 향상시킬 수 있으나, 고래류 eDNA45,92의 파일럿 샘플링 시 분류군별 검출 효율을 평가해야 합니다.

전면 샘플링 전 주요 고려사항으로는 지연 처리보다 선내 여과를 우선시하는 것, 일정한 수량 및 필터 구성 유지, 현지 조건에서 여과 최적화를 위한 파일럿 샘플링 수행, 선박 용량 및 여행 시간과 샘플링 노력의 정렬 등이 있습니다. 시민 과학자들이 현장에서 구조화된 기록을 가능하게 하는 디지털 데이터 입력 도구는 향후 적용에 권장됩니다93.

이 시작부터 끝까지 워크플로우의 성공적인 적용은 운영 제약 조건 하에서도 견고함을 입증하는 동시에 시민 과학 맥락에 내재된 공간, 시간, 기상 및 오염 위험과 관련된 한계를 부각시킵니다10,94. 이러한 제약에도 불구하고, 고래 관찰 선박은 표준화된 교육과 감독이 제공될 때 eDNA 고래류 모니터링에 강력하고 활용도가 낮은 플랫폼입니다. 이 워크플로우를 사진 식별, 수동 음향, 생검 샘플링 등 기존 고래류 모니터링 도구와 통합하면 유전 탐지를 행동 및 인구통계 데이터와 연결할 수 있습니다. 이 연구는 종 특이적 qPCR 기반 검출에 초점을 맞추고 있지만, 향후 응용 분야는 DNA 메타바코딩 또는 개체군 유전학 분석을 통합하여 고래류 eDNA 모니터링의 생태학적 및 보전 가치를 더욱 확장할 수 있습니다.

eDNA 기반 접근법이 계속 발전함에 따라, 이 워크플로우는 특히 고래류 핫스팟과 민감한 생태계에서 유전자 모니터링을 기존 해양 관찰 및 보전 프로그램에 통합할 수 있는 확장 가능한 기반을 제공합니다.

공개 사항

벨렌 가르시아 오비데는 아이슬란드 북동부 후사빅에 본부를 둔 해양 보전에 중점을 둔 비영리 단체인 오션 미션스의 창립자이자 전무이사입니다. 오션 미션은 아이슬란드의 고래 관찰선과 북극 탐험선에서 샘플링을 조정합니다. 또한 후사빅에 위치한 고래 관찰 회사인 노스 세일링의 대표로 eWHALE 프로젝트 내에서 활동하고 있습니다. 이러한 소속은 연구 설계, 데이터 수집, 분석 또는 결과의 해석에 영향을 미치지 않았습니다.

감사의 글

현장 조사와 실험실 작업에 참여한 모든 분들께 감사의 말씀을 전합니다.

i) 아이슬란드 스칼판디 만에서 샘플을 채취한 에이든 메이비, 마테오 토사토, 아누크 아돌프, 잔 라포르테, 로미 니로, 이사벨 외스터레; ii) 다니아 테세이, 마이클 코스타, 리타 노르베르토, 말렌 슈반트, 리타 레이탕, 리카르도 벤투라, 마르타인 쇼우텐, 지아다 비스콘티니, 카타리나 리브, 앤서니 르 플로흐, 프란시스코 누네스, 레나토 카르도소, 파우스틴 다리우스, 모니크 쇼텐, 로라 비에트(아조레스 제도); iii) 산드라 샬하트, 야나 로버트슨(오스트리아); 그리고 iv) 사비나 아이롤디, 마리오 가부알디, 마리나 코스타, 모르가나 비기, 니노 피에란토니오, 로베르토 라이네리가 펠라고스 보호구역(이탈리아)에서 데이터 수집을 위해 참여했습니다.

이 연구는 2021-2022년 BiodivProtect 공동 연구 제안서 공모 하에 유럽 생물다양성 파트너십인 Biodiversa+의 지원을 받았으며, 유럽연합 집행위원회(GA No. 101052342)와 공동 자금 지원을 받았습니다: 1) 아이슬란드 연구센터(RANNÍS, 보조금 번호 229030), 2) 대학 및 연구부(MUR), 유럽 파트너십 Biodiversa+ Call 2021 - eWHALE 프로젝트와 관련된 FIRST 및 IGRUE 특별 계정에서 지원, 3) 오스트리아 과학 기금(FWF) [doi: 10.55776/I6389] 및 인스브루크 대학교 출판 기금.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
대체 eDNA 필터: SterivexTM / Waterra머크 밀리포어/워터라 펌프스 리미티드SVHVL10RC/NA0.45 & 마이크로; m의 기공 크기. eDNA 보존 버퍼를 필요로 하며;
AW1, AW2, AE 버퍼키아겐  그리고 nbsp;19081, 19072, 19077추출 중 DNA 정제에 사용되는 완충액
표백제 용액 (1:10)DM - Denk mit, Hygienereiniger커스텀표면 오염 제거. 실험실 과정의 모든 단계
양동이보트 상점, 낚시 장비, 아마존딱딱했다. 고무 또는 단단한 플라스틱(10L 이상)입니다. 샘플링 환경과 선내 물류에 따라 하나 이상이 필요합니다
정화 시약, 익스프레스 PCR 엑소삽-잇75001.1.EA생거 시퀀싱을 위한 PCR 산물 준비
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