Method Article

포르말린 고정 파라핀 함침 마우스 배아 조직에서 초기 치아 형태발생의 공간 전사체학

DOI:

10.3791/70340

⸱

March 13th, 2026

 , 
1Section on Craniofacial Genetic Disorders, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Shriners Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

현재 프로토콜은 마우스 배아의 E13.5 및 E15.5 두개안면 영역에서 포르말린 고정 및 파라핀 내비된 절편을 사용하여 공간 전사체학을 이용해 유전자 발현 프로필의 차별을 분석하는 방법을 설명합니다.

Abstract

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발달 중인 치아는 다양한 고도로 특수화된 세포 집단으로 구성되어 있어 올바른 형태와 기능을 유지하기 위해 함께 작용합니다. 이러한 세포들과 그 주변 미세환경 간의 상호작용을 밝히는 것은 정상적인 치아 발달의 조절 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 과정의 교란은 치아 무형성, 상아성 형성 부전, 무변호형성 부전과 같은 선천성 질환을 초래할 수 있습니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)이 세포 이질성을 밝히는 데 상당한 진전을 가져왔음에도 불구하고, 조직 내 세포의 공간적 맥락을 보존하지 못해 유전자 발현과 조직 구조를 연관 짓는 능력을 제한합니다. 공간 전사체체 기술은 고해상도 유전자 발현 프로파일링과 천연 조직 구조 보존을 통합하여 분자 서명의 현장 위치 지정을 가능하게 하여 이 한계를 해결합니다. 여기서는 하류 공간 전사체학적 응용에 적합한 마우스 배아 두개안면 조직의 수집, 고정 및 파라핀 삽입을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 워크플로우는 포르말린 고정 및 파라핀 내재 조직의 절절 및 취급을 최적화하여 RNA의 완전성과 조직 형태를 보존하여 고해상도 공간 분석을 가능하게 합니다. 이 방법은 시퀀싱 및 영상 기반 공간 전사체학 플랫폼과 호환되어, 쥐 배아에서 초기 치아 형태발생에 대한 공간적 전사체 프로파일링을 재현 가능하게 합니다. 이 접근법은 발달 및 병리 상태에서 두개안면 구조의 공간적 조직과 기능적 역학에 대한 강력한 통찰을 제공하며, 분자 메커니즘과 조직 형태를 연결하는 중요한 틀을 제공합니다.

Introduction

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치아 발달은 초기 배아 성장 중 1,2,3,4 등 형태발생 과정의 매우 조화로운 연속에 의존합니다. 유전학 및 발달 연구를 통해 수많은 주요 유전자와 신호 경로가 확인되었음에도 불구하고, 이러한 요인들이 개별 두개안면 구조를 형성하는 데 어떻게 상호작용하는지에 대한 이해는 아직 제한적입니다. 특히, 특정 유전 변이를 증후군성 및 비증후군성 치아 질환과 연결하는 데 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 구조 특이적 형태발생의 상세한 분자 기전은 아직 완전히 정의되지 않았습니다 1,2,3,4. 이러한 지식 격차는 치아 무형성이나 기타 치아 이상에 대한 표적 치료 전략의 진전을 계속 제한하고 있습니다.

단세포 mRNA 시퀀싱(scRNA-....

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Protocol

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모든 동물 시술은 미국 국립보건원(NIH), 국립아동건강 및 인간발달연구소(NIH) 동물 관리 및 이용 위원회(ACUC)의 동물 연구 프로토콜 #21-031에 따라 승인되었습니다.

1. 실험 동물 준비 및 조직 채취

  1. 건강하고 가임이 가능한 수컷과 암컷 Mus musculus 를 짝지어 시간 제한 교미를 하세요. 임신한 암컷 쥐는 질 플러그의 존재로 식별하며, 배아 일(E) 0.5로 지정됩니다.
  2. 임신한 암컷 쥐는 CO₂ 흡입 후 자궁경부 탈구를 통해 안락사시킵니다. 동물의 누운 자세를 멸균 흡수 수술용 표면에 놓고, 의도한 절개 부위를 따라 복부 부위를 70% 에탄올로 소독합니다.
  3. 멸균 수술용 가위로 복부 중앙 절개를 하고, 미세수술용 가위로 복막벽을 조심스럽게 열어 자궁 뿔을 노출시키세요. 둔탁한 겸자를 사용해 자궁 사슬을 부드럽게 바깥쪽으로 제거하세요. 자궁 조직을 근단을 따라 방출하고 난관과 정중 자궁 뿔 부착부에서 절단하여 배아를 분리합니다.
  4. 즉시 전체 배아를 얼음처럼 차갑고 멸균된 1x PBS를 10cm 페트리 접시에 이식하세요.
  5. 각 배아....

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Results

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이 방법은 갓 해리된 쥐 배아 머리를 처리하여 발달 중인 치아를 포함한 두개안면 조직의 FFPE 샘플을 생성하며, 이를 마이크로톰으로 쉽게 절절하여 RNA 무결성을 유지할 수 있음을 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 E13.5(배아 13.5일), E15.5, E16.5 마우스 배아 머리에 고해상도 이미지 기반(그림 2) 및 시퀀싱 기반 공간 전사체(그림 3) 두개안면 영역에 성공적으로 적용되었습니다. 시퀀싱 기반 공간 전사체 데이터셋에서는 공간 클러스터 간 차등 발현을 분석하고, 특정 클러스터 내에서 풍부하게 된 전사체를 검출하며, 공간적으로 제한된 발현 패턴을 가진 유전자를 분석하여 마커 유전자를 식별합니다. 이러한 결합된 접근법은 유전자를 서로 다른 세포 유형과 공간 영역에 신뢰성 있게 할당할 수 있게 .......

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

본 연구에서는 고해상도 공간 RNA 영상 플랫폼(시퀀싱 및 영상 기반 공간 전사체학)과 최적화된 마우스 배아 머리의 FFPE 블록을 준비하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 핵심 목표는 두두부 전체의 조직 형태와 핵산 무결성을 보존하는 것이며, 특히 발달 중인 두개안면 부위에 중점을 둡니다. 이러한 보존 수준을 보장하는 것은 발달 중인 구개와 치아 구조와 같은 복잡하고 다조직 환경에서 공간적 유전자 발현 패턴을 정확히 해명하는 데 매우 중요합니다.

최근 연구들은 두개안면 발달 과정에서 세포 이질성과 계통 특정성을 해부하는 데 공간적 전사체학의 중요성을 강조합니다. 예를 들어, 단일 세포 RNA 시퀀싱과 공간 전사체학의 통합은 치아 발달의 포괄적인 전사 아틀라스 구축을 가능하게 했습니다14,15. 이 통합.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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실험 설계와 기술 지원에 관한 조언을 주신 Sergey L. Leikin 박사, Elena Makareeva 박사(NICHD/NIH 물리생화학 부서), Jeremie Oliver Piña 박사(NIDCR/NIH 뼈 및 치아 분자생물학 섹션)에 진심으로 감사드립니다. 시퀀싱 기반 공간 전사체 분석을 위한 기술 지원을 제공해 주신 이벤 제임스 박사님, 분자 유전체학 코어, NICHD/NIH 비벡 마하데반 박사님께 감사드립니다. 우리는 이미지 기반 공간 전사체학에 대한 기술 지원을 제공해 주신 구스타프 위게블라드 박사(국립관절염 및 근골격계 및 피부질환 연구소, NIAMS/NIH의 전신 자가면역 분과)에 감사드립니다. 이미지 기반 공간 전사체 연구를 위한 기술 지원을 제공해 주신 Michael Kelly 박사님과 NCI/NIH 단세포 분석 시설(SCAF) Jatinder Singh 박사님께 감사드립니다. 동물 사육과 번식에 도움을 준 NICHD 동물 시설 직원들에게 감사드립니다. 그림 1 은 BioRender.com 을 사용해 작성되었습니다.

현재 원고는 NIH/NIDCR [연구비, 1RO1DE033520]에서 M.B.에 대한 자금으로 지원받고 있습니다. 연....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1배 PBS서모 피셔10010023Use  작업 흐름 중에 워시를 수행하기 위해
50 mL 원뿔 튜브(Ambion) RNAse 자유서모 피셔AM12502샘플을 다양한 용액에 보관하는 데 사용하세요
고급 궤도 셰이커VWR6683-470인큐베이션 중 고정액에서 조직을 흔들 때 사용하세요
알코올 70%, 피셔브랜드, 히스토프렙피셔 사이언티브HC-1000-1GL작업 공간을 청소하고 소독하는 데 사용하세요
자동 진공 조직 처리라이카 바이오시스템ASP300S샘플의 투명화, 탈수, 재수화 및 왁스 침투에 사용됩니다
커버 유리 두께 1.5, 25 mm x 25 mm  코닝2850-25Visium HD 워크플로우에서 슬라이드 장착에 사용
Dako 블루잉 버퍼, 즉시 사용 가능애질런트 테크놀로지스CS70230-2Use for H& E 염색
이오신-Y와 플록신피셔 사이언티브22050198Use for H& E 염색
헤마톡실린, 마이어스, 즉시 사용 가능한 수용액애질런트 테크놀로지스S330930-2Use for H& E 염색
히스토코어 워터 배스 라이카 바이오시스템HIS232640-43 & deg; C는 FFPE 단면의 주름을 제거하기 위해 nbsp;
루페 브라우저  9.0.010X 지노믹스, Inc. Visium HD 데이터 분석에 사용하세요.
저프로파일 일회용 블레이드 DB80LX라이카 바이오시스템14035843496FFPE 블록을 구획하는 데 사용하세요;
중성 완충 포르말린 10%아제르 사이언티픽NBF-4-G조직 고치는 데 사용해
RNaseZap RNase 오염 제거 용액서모 피셔AM9782RNase를 청소하고 제거하는 데 사용
반자동 회전 미세절기라이카 바이오시스템RM2245지침에 보고된 대로 FFPE 블록을 구획으로 사용하세요.
커버가 있는 슬라이드 워머프리미어 XH2004다양한 온도에서 슬라이드를 배양하는 데 사용됩니다
슈퍼프로스트 플러스 슬라이드 피셔 사이언티브12-550-15 Vsium HD용 섹션 부착에 사용
수술용 칼날 11호인테그라 밀텍스4-311FFPE 조직 채점에 대한 사용
서지패스 패러플라스트라이카 바이오시스템39601006조직 침윤 및 조직 박출을 수행하는 데 사용됩니다
TISsue 배양 접시 100X20MM 500/CS피셔 사이언티브8772221x PBS에서 샘플을 채취하고 해부하는 데 사용
울트라퓨어 글리세롤서모 피셔15514011CytAssist 이전에 커버글라스의 Visium HD 슬라이드 장착에 사용
비시움 키트어시스트10X 지노믹스, Inc. PN-1000442Visium HD 워크플로우 실험에 대한 사용
Visium HD 공간 RNA 시퀀싱10X 지노믹스, Inc. 1000676공간 전사체 실험 수행에 사용
Xenium 5K 현장 내 RNA 위치 및 nbsp;10X 지노믹스, Inc. PN-1000724공간 전사체 실험 수행에 사용
제늄 분석기10X 지노믹스, Inc. PN-1000481Xenium 및 Xenium 5K RNA 이미징을 수행하세요;
제니엄 익스플로러 410X 지노믹스, Inc. Xenium 데이터 분석에 사용하며,
제늄 인사이트 RNA 위치10X 지노믹스, Inc. 1000672공간 전사체 실험 수행에 사용

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thesleff, I. From understanding tooth development to bioengineering of teeth. Eur J Oral Sci. 126 (1), 67-71 (2018).
  2. Bei, M. Molecular genetics of tooth development. Curr Opin Genet Dev. 19 (5), 504-510 (2009).
  3. Roth, D. M., et al.

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