포르말린 고정 파라핀 함침 마우스 배아 조직에서 초기 치아 형태발생의 공간 전사체학

Summary

현재 프로토콜은 마우스 배아의 E13.5 및 E15.5 두개안면 영역에서 포르말린 고정 및 파라핀 내비된 절편을 사용하여 공간 전사체학을 이용해 유전자 발현 프로필의 차별을 분석하는 방법을 설명합니다.

Abstract

발달 중인 치아는 다양한 고도로 특수화된 세포 집단으로 구성되어 있어 올바른 형태와 기능을 유지하기 위해 함께 작용합니다. 이러한 세포들과 그 주변 미세환경 간의 상호작용을 밝히는 것은 정상적인 치아 발달의 조절 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다. 이러한 과정의 교란은 치아 무형성, 상아성 형성 부전, 무변호형성 부전과 같은 선천성 질환을 초래할 수 있습니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)이 세포 이질성을 밝히는 데 상당한 진전을 가져왔음에도 불구하고, 조직 내 세포의 공간적 맥락을 보존하지 못해 유전자 발현과 조직 구조를 연관 짓는 능력을 제한합니다. 공간 전사체체 기술은 고해상도 유전자 발현 프로파일링과 천연 조직 구조 보존을 통합하여 분자 서명의 현장 위치 지정을 가능하게 하여 이 한계를 해결합니다. 여기서는 하류 공간 전사체학적 응용에 적합한 마우스 배아 두개안면 조직의 수집, 고정 및 파라핀 삽입을 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 워크플로우는 포르말린 고정 및 파라핀 내재 조직의 절절 및 취급을 최적화하여 RNA의 완전성과 조직 형태를 보존하여 고해상도 공간 분석을 가능하게 합니다. 이 방법은 시퀀싱 및 영상 기반 공간 전사체학 플랫폼과 호환되어, 쥐 배아에서 초기 치아 형태발생에 대한 공간적 전사체 프로파일링을 재현 가능하게 합니다. 이 접근법은 발달 및 병리 상태에서 두개안면 구조의 공간적 조직과 기능적 역학에 대한 강력한 통찰을 제공하며, 분자 메커니즘과 조직 형태를 연결하는 중요한 틀을 제공합니다.

Introduction

치아 발달은 초기 배^{아 성장 중 1,2,3,4} 등 형태발생 과정의 매우 조화로운 연속에 의존합니다. 유전학 및 발달 연구를 통해 수많은 주요 유전자와 신호 경로가 확인되었음에도 불구하고, 이러한 요인들이 개별 두개안면 구조를 형성하는 데 어떻게 상호작용하는지에 대한 이해는 아직 제한적입니다. 특히, 특정 유전 변이를 증후군성 및 비증후군성 치아 질환과 연결하는 데 상당한 진전이 있었음에도 불구하고, 구조 특이적 형태발생의 상세한 분자 기전은 아직 완전히 정의되지 않았습니다 ^1,2,3,4. 이러한 지식 격차는 치아 무형성이나 기타 치아 이상에 대한 표적 치료 전략의 진전을 계속 제한하고 있습니다.

단세포 mRNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 건강한 조직과 병든 조직 모두에서 이전에 인식되지 않았던 세포 유형을 발견하고, 서로 다른 유전자 발현 프로필을 기반으로 여러 세포 아형을 식별할 수 있게 해왔습니다. 하지만 scRNA-seq는 조직을 단일 세포로 분리해야 하기 때문에, 각 세포가 조직 내에서 원래 위치했던 위치에 대한 정보가 사라집니다. 그 결과, 이 데이터셋들은 세포가 조직 구조 ^5,6,7에 대해 어떻게 배열되어 있는지 포착하지 못합니다. 또한, 예측된 세포 간 상호작용은 전사체 간 상호작용의 존재에 의존하지만, 실제 공간 정보는 고려하지 않으며, 이는 생체 내에서 이러한 상호작용이 발생하는지 판단하는 데 중요합니다 ^5,6,7.

공간 전사체학 기술은 조직 구획 ^8,9 내 공간 정보를 유지하면서 유전자 발현의 고처리량 프로파일링을 가능하게 합니다. 공간 전사체학 기술은 영상 기반 10,11,12 또는 시퀀싱 기반 ^12,13 중 하나로 나뉩니다. 영상 기반 공간 전사체학 접근법은 FISH를 활용하여 표적 유전자 발현을 세포 또는 아세포 공간적 정밀도로 탐지하고 측정합니다. 반면, 시퀀싱 기반 기술은 전사체 전체의 유전자 발현을 낮은 공간 해상도로 포착합니다. 시퀀싱 기반 공간 전사체학은 전체 전사체 커버리지(~20,000 유전자)를 통해 거의 단일 세포 해상도에 가까운 해상도를 달성하는 전략을 사용하여 편향 없는 탐색적 분석을 지원합니다. 반면 영상 기반 공간 전사체학은 최대 ~5,000개의 유전자 패널을 표적으로 하여 특정 경로와 세포 상호작용에 대한 정밀한 가설 기반 분석을 가능하게 합니다¹⁴.

공간 전사체학의 기술적 발전으로 보존된 조직 구조 내에서 유전자 발현 분석이 가능해졌습니다. 포르말린 고정 파라핀 내장(FFPE) 및 냉동절부 기반 워크플로우는 공간 전사체학에 상호 보완적인 접근법을 제공합니다 15,16,17. FFPE는 조직 구조를 우수한 보존하여 발달 중인 치아와 구개선반과 같은 구조적으로 복잡한 조직에서 유전자 발현의 정확한 공간 지도화를 가능하게 합니다. 우리 연구와 다른 연구들에서 FFPE 고정과 보관은 매우 정확하고 재현 가능한 공간 전사체 데이터를 제공했습니다¹⁸. 냉동절부 작업 흐름은 RNA의 무결성을 유지하지만 조직 왜곡에 더 취약합니다¹⁸. 따라서 FFPE가 이번 연구에 선정되었습니다. scRNA-seq 성공은 주로 높은 RNA 무결성 유지에 달려 있지만, 공간 전사체학은 유전자 발현 신호를 특정 조직학적 특징에 정확히 위치시키기 위해 고품질 조직 형태학도 필요합니다.

이 프로토콜은 미세 조직 구조 보존이 공간 전사체 분석에 중요한 초기 발달 단계에 걸친 FFPE 마우스 배아 두개안면 조직에 가장 적합합니다. 이 작업 흐름은 과도하게 고정된 샘플, 방향이 좋지 않은 파라핀 블록, 또는 RNA 무결성이 손상된 조직에서는 최적이 아닌 성능을 보일 가능성이 높아, 신호 품질 저하와 공간 해상도 손실로 이어질 수 있습니다. 이 방법의 성공적인 적용은 조직 형태가 온전하고, 절편 왜곡이 최소화되며, 조직학적 특징과 일치하는 강력하고 공간적으로 분해된 전사체 신호로 나타난다.

Protocol

모든 동물 시술은 미국 국립보건원(NIH), 국립아동건강 및 인간발달연구소(NIH) 동물 관리 및 이용 위원회(ACUC)의 동물 연구 프로토콜 #21-031에 따라 승인되었습니다.

1. 실험 동물 준비 및 조직 채취

1. 건강하고 가임이 가능한 수컷과 암컷 Mus musculus 를 짝지어 시간 제한 교미를 하세요. 임신한 암컷 쥐는 질 플러그의 존재로 식별하며, 배아 일(E) 0.5로 지정됩니다.
2. 임신한 암컷 쥐는 CO₂ 흡입 후 자궁경부 탈구를 통해 안락사시킵니다. 동물의 누운 자세를 멸균 흡수 수술용 표면에 놓고, 의도한 절개 부위를 따라 복부 부위를 70% 에탄올로 소독합니다.
3. 멸균 수술용 가위로 복부 중앙 절개를 하고, 미세수술용 가위로 복막벽을 조심스럽게 열어 자궁 뿔을 노출시키세요. 둔탁한 겸자를 사용해 자궁 사슬을 부드럽게 바깥쪽으로 제거하세요. 자궁 조직을 근단을 따라 방출하고 난관과 정중 자궁 뿔 부착부에서 절단하여 배아를 분리합니다.
4. 즉시 전체 배아를 얼음처럼 차갑고 멸균된 1x PBS를 10cm 페트리 접시에 이식하세요.
5. 각 배아를 주변 자궁, 양수, 융모막에서 조심스럽게 분리한 후, 얼음처럼 차갑고 멸균된 1x PBS가 들어있는 신선한 10cm 접시에 옮겨 넣으세요.
6. 멸균 수술용 칼날을 사용해 원하는 발달 단계에서 배아 머리를 해부하고, 추가 가공 전에 얼음처럼 차갑고 1배 PBS로 한 번 헹군습니다.

2. 조직의 고정 및 처리

1. 원하는 발달 단계에서 배아 마우스 머리를 해부하고, 10% 중성 완충 포르말린을 상온에서 셰이커에 고정합니다.
2. 고정 후 포르말린을 제거하고 샘플을 1x PBS로 헹군 후 70% 에탄올로 옮겨 보관합니다. 자동 조직 프로세서를 사용하여 조직 탈수, 제거, 파라핀 침윤을 수행합니다.
3. 배아 머리를 관상면 또는 시상면에 배치하여 파라핀에 박습니다.
4. 왁스가 굳어진 후, 몰드에서 파라핀 블록을 꺼내 라벨이 붙은 밀폐 용기나 지퍼백에 넣고 4°C에서 보관하다가 조각 절단 시점에 보관합니다.
   참고: FFPE 블록은 절절 수술 전 수년간 보관할 수 있으며 조직 무결성에 영향을 주지 않습니다.

3. 공간 전사체학을 위한 FFPE 조직 처리

1. 작업면과 기기를 70% 에탄올로 소독한 후 RNase 제염 용액으로 처리하여 RNA 분해를 최소화합니다.
2. 탈이온수를 포함한 수욕을 준비하고 40°C에서 유지하며, 배아 단계나 조직 특성에 따라 온도를 40°C에서 43°C 사이로 조절합니다.
3. 마이크로토姆을 설치하고, RNase 제염액으로 부드럽게 닦은 후 새 블레이드를 장착하고, 블레이드를 고정한 뒤 클리어런스 각도를 10°로 설정하세요.
   참고: 정확한 조직 절단을 위해서는 새 칼날이 절면 절단에 사용되는지 확인하세요. 미세토름 블레이드 각도 변경은 절편 품질에 큰 영향을 미치며, 조직의 완전성, 두께 균일성, 형태학적 특징 보존에 영향을 미칩니다.
4. 박힌 조직 주변의 과도한 파라핀을 제거하고, FFPE 블록을 미세토름의 냉기 단계에 장착하세요.
5. 사용 전에 깨끗한 핀셋과 브러시를 RNase 제염 용액으로 준비하고 처리하세요.
6. 파라핀 블록 면을 미세절기 날과 정렬시키고, 관심 부위에 접근할 때까지 약 12 μm 간격으로 다듬어 절단합니다(예: 어금니의 근측 부분이 관상 절개에서 보일 때까지). 블록과 블레이드 위치를 필요에 따라 조정하여 대칭적이고 적절한 방향의 전체 머리 관상 섹션을 확보하세요.
7. 조직 절편의 RNA 분리를 수행하려면 10 μm 절편을 1 mL 마이크로 원심분리관에 직접 수집하여 제조사 권고사항인 DV200 품질 평가^19,20에 따라 처리하십시오.
8. 5 μm 두께의 직렬 단면을 절단하고, 일반 슬라이드에서 현미경으로 테스트 단면을 관찰하여 관심 부위에 대한 근접성을 지속적으로 모니터링합니다.
9. 관심 부위에 가까워지면, No. 11 메스 칼날로 조직 부위를 완전히 절단하지 않고 두 개의 전략적으로 간격을 둔 두 영역으로 조심스럽게 자르어 말림이나 절편 부착을 방지합니다. 절단 후에는 가는 솔의 솔을 사용해 붙어 있는 파라핀을 제거합니다.
10. 조직 조각을 41°C의 물욕조에 띄워 부드러운 이완과 평평하게 만들고, 슬라이드에 올려 들어 올리세요.

4. 시퀀싱 기반 공간 전사체학

1. 권장 유리 슬라이드에 조직 절편을 수집하여 관심 있는 모든 부위가 6.5 × 6.5 mm 범위 내에 포함되도록 하세요. 여러 인접 구간이 같은 슬라이드에 놓일 때는 슬라이드 워머에서 40°C로 잠시 가열하여 접착을 촉진하고 이전에 놓인 구간이 분리되는 것을 방지합니다. 모든 절편이 위치된 후, 슬라이드를 덮개가 있는 슬라이드 워머 안에서 60°C에서 2시간 동안 인큐베이팅하여 조직 부착을 강화합니다.
   참고: 6.5 × 6.5 mm 구역을 넘어서는 구간은 처리되지 않았습니다.
2. 배양 후에는 표준 H&E 염색 프로토콜을 사용하여 RNA 완전성을 유지하기 위해 수돗물 대신 탈이온수(deionizeded) 물로 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색을 수행합니다.
3. 80% 글리세롤을 사용해 커버슬립을 마운트하고, 고해상도 H&E 이미지를 획득하여 슬라이드 영상 및 조직 이식 시스템에서 생성된 일반적인 H&E 이미지를 대체할 고품질 참조 이미지를 제공합니다.
4. 영상 촬영 후, 슬라이드를 50mL 튜브에 개별 담가 제거하여 커버슬립을 제거하고, 이후 처리를 위해 코어 시설로 제출할 준비를 합니다.

5. 영상 기반 공간 전사체학

참고: 제조사에서 제공한 슬라이드는 각각 12 mm × 24 mm 크기의 지정된 영상 영역(윤곽선 표시)을 포함하고 있으며, 약 235 mm²(10.45 mm × 22.45 mm)의 샘플 배치 영역을 가집니다.

1. 조직 절편을 이 정의된 영역 내에 완전히 배치하여 잔류 파라핀을 포함한 절편들이 겹치지 않도록 하세요. 여러 인접 구간을 설치할 때는 슬라이드를 40°C의 슬라이드 워머로 잠시 가열하여 접착을 촉진하고 이전에 장착된 구간이 떨어지는 것을 방지합니다.
2. 모든 조직 절편이 위치된 후, 슬라이드를 덮개가 있는 슬라이드 워머에 넣고 40°C에서 하룻밤 배양하여 적절한 부착력을 확인하세요.
3. 인큐베이션 후에는 제조사의¹⁹ 프로토콜을 따라 슬라이드를 처리하고 RNA 시퀀싱을 위해 기계에 적재하며, 절차적 세부 사항은 주기적으로 업데이트되므로 최신 버전과 대조합니다.
   참고: 프로토콜 기간 중 생성된 모든 유해 물질, 예를 들어 포르말린, 에탄올, RNase 제염 용액은 기관 안전 정책과 지역 규정에 따라 적절한 화학 폐기물 용기, 생물학적 위험물 처리 방법, 연기 후드 관행을 사용하여 폐기되어야 합니다.

Results

이 방법은 갓 해리된 쥐 배아 머리를 처리하여 발달 중인 치아를 포함한 두개안면 조직의 FFPE 샘플을 생성하며, 이를 마이크로톰으로 쉽게 절절하여 RNA 무결성을 유지할 수 있음을 설명합니다(그림 1). 이 프로토콜은 E13.5(배아 13.5일), E15.5, E16.5 마우스 배아 머리에 고해상도 이미지 기반(그림 2) 및 시퀀싱 기반 공간 전사체(그림 3) 두개안면 영역에 성공적으로 적용되었습니다. 시퀀싱 기반 공간 전사체 데이터셋에서는 공간 클러스터 간 차등 발현을 분석하고, 특정 클러스터 내에서 풍부하게 된 전사체를 검출하며, 공간적으로 제한된 발현 패턴을 가진 유전자를 분석하여 마커 유전자를 식별합니다. 이러한 결합된 접근법은 유전자를 서로 다른 세포 유형과 공간 영역에 신뢰성 있게 할당할 수 있게 ...

Discussion

본 연구에서는 고해상도 공간 RNA 영상 플랫폼(시퀀싱 및 영상 기반 공간 전사체학)과 최적화된 마우스 배아 머리의 FFPE 블록을 준비하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜의 핵심 목표는 두두부 전체의 조직 형태와 핵산 무결성을 보존하는 것이며, 특히 발달 중인 두개안면 부위에 중점을 둡니다. 이러한 보존 수준을 보장하는 것은 발달 중인 구개와 치아 구조와 같은 복잡하고 다조직 환경에서 공간적 유전자 발현 패턴을 정확히 해명하는 데 매우 중요합니다.

최근 연구들은 두개안면 발달 과정에서 세포 이질성과 계통 특정성을 해부하는 데 공간적 전사체학의 중요성을 강조합니다. 예를 들어, 단일 세포 RNA 시퀀싱과 공간 전사체학의 통합은 치아 발달의 포괄적인 전사 아틀라스 구축을 가능하게 했습니다^14,15. 이 통합...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1배 PBS	서모 피셔	10010023	Use  작업 흐름 중에 워시를 수행하기 위해
50 mL 원뿔 튜브(Ambion) RNAse 자유	서모 피셔	AM12502	샘플을 다양한 용액에 보관하는 데 사용하세요
고급 궤도 셰이커	VWR	6683-470	인큐베이션 중 고정액에서 조직을 흔들 때 사용하세요
알코올 70%, 피셔브랜드, 히스토프렙	피셔 사이언티브	HC-1000-1GL	작업 공간을 청소하고 소독하는 데 사용하세요
자동 진공 조직 처리	라이카 바이오시스템	ASP300S	샘플의 투명화, 탈수, 재수화 및 왁스 침투에 사용됩니다
커버 유리 두께 1.5, 25 mm x 25 mm	코닝	2850-25	Visium HD 워크플로우에서 슬라이드 장착에 사용
Dako 블루잉 버퍼, 즉시 사용 가능	애질런트 테크놀로지스	CS70230-2	Use for H& E 염색
이오신-Y와 플록신	피셔 사이언티브	22050198	Use for H& E 염색
헤마톡실린, 마이어스, 즉시 사용 가능한 수용액	애질런트 테크놀로지스	S330930-2	Use for H& E 염색
히스토코어 워터 배스	라이카 바이오시스템	HIS2326	40-43 & deg; C는 FFPE 단면의 주름을 제거하기 위해 nbsp;
루페 브라우저  9.0.0	10X 지노믹스, Inc.		Visium HD 데이터 분석에 사용하세요.
저프로파일 일회용 블레이드 DB80LX	라이카 바이오시스템	14035843496	FFPE 블록을 구획하는 데 사용하세요;
중성 완충 포르말린 10%	아제르 사이언티픽	NBF-4-G	조직 고치는 데 사용해
RNaseZap RNase 오염 제거 용액	서모 피셔	AM9782	RNase를 청소하고 제거하는 데 사용
반자동 회전 미세절기	라이카 바이오시스템	RM2245	지침에 보고된 대로 FFPE 블록을 구획으로 사용하세요.
커버가 있는 슬라이드 워머	프리미어	XH2004	다양한 온도에서 슬라이드를 배양하는 데 사용됩니다
슈퍼프로스트 플러스 슬라이드	피셔 사이언티브	12-550-15	Vsium HD용 섹션 부착에 사용
수술용 칼날 11호	인테그라 밀텍스	4-311	FFPE 조직 채점에 대한 사용
서지패스 패러플라스트	라이카 바이오시스템	39601006	조직 침윤 및 조직 박출을 수행하는 데 사용됩니다
TISsue 배양 접시 100X20MM 500/CS	피셔 사이언티브	877222	1x PBS에서 샘플을 채취하고 해부하는 데 사용
울트라퓨어 글리세롤	서모 피셔	15514011	CytAssist 이전에 커버글라스의 Visium HD 슬라이드 장착에 사용
비시움 키트어시스트	10X 지노믹스, Inc.	PN-1000442	Visium HD 워크플로우 실험에 대한 사용
Visium HD 공간 RNA 시퀀싱	10X 지노믹스, Inc.	1000676	공간 전사체 실험 수행에 사용
Xenium 5K 현장 내 RNA 위치 및 nbsp;	10X 지노믹스, Inc.	PN-1000724	공간 전사체 실험 수행에 사용
제늄 분석기	10X 지노믹스, Inc.	PN-1000481	Xenium 및 Xenium 5K RNA 이미징을 수행하세요;
제니엄 익스플로러 4	10X 지노믹스, Inc.		Xenium 데이터 분석에 사용하며,
제늄 인사이트 RNA 위치	10X 지노믹스, Inc.	1000672	공간 전사체 실험 수행에 사용