CAR T 세포의 기능적 프로파일링을 위한 비드 기반 다중 흐름 세포 검사법

Summary

이 기사는 키메릭 항원 수용체(CAR)-T 세포 유래 상층액에서 최대 12가지 사이토카인 및 이펙터 분자를 정량화하기 위한 다중 비드 기반 유세포 분석법을 소개하며, 이를 통해 소량의 샘플 볼륨으로 엔지니어링된 T 세포의 기능성을 신속하고 재현 가능하게 분석할 수 있습니다.

Abstract

CAR T 세포의 프로파일링은 그들의 이질성, 복잡한 면역 반응 및 제한된 샘플 가용성 때문에 어려움을 초래합니다. 멀티플렉스 분석은 다양한 효과 분자의 동시 검출을 가능하게 함으로써 기능적 평가를 가능하게 합니다. 여기서는 인간 키메릭 항원 수용체(CAR)-T 세포에 의한 효과 분자 분비 분석을 위해 유세포 분석과 호환되는 비드 기반 멀티플렉스 분석법을 설명합니다. CAR T 세포 상층액은 여러 형광 코드 인구를 포함하는 캡처 비드 혼합물과 함께 배양됩니다. 이 비드는 샘플의 용해성 표적에 결합하여 비드-분석물 복합체를 형성하고, 이는 후속적으로 표지된 탐지 항체를 사용하여 검출됩니다. 이 분석에는 인터페론(IFN)-α, 인터루킨(IL)-2, 종양 괴사 인자(TNF)-α, IL-6, IL-10, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 및 Granzyme B와 같은 면역 매개체 패널이 포함됩니다. 미리 정의된 표준의 사용으로 단일 샘플로부터 다중 분석물의 정량적 측정이 가능합니다. 데이터 수집 및 분석은 기기 관련 또는 웹 기반 소프트웨어 도구에서 제공하는 자동화된 게이팅 접근법을 사용하여 수행할 수 있어 데이터 처리를 용이하게 합니다. 결론적으로, 제시된 멀티플렉스 분석법은 CAR T 세포의 다중 매개 분석을 가능하게 하며, 연구, 품질 관리 테스트, 메커니즘 연구 및 기능적 특성화와 같은 맥락에 적용될 수 있습니다.

Introduction

CAR T 세포 검사에서 기능 특성화는 이러한 치료법의 효능, 안전성 및 작용 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하므로 필수적입니다. 사이토카인 및 세포독성 매개체 서명을 이해하는 것은 치료 효과 및 잠재적 부작용을 평가하는 데 도움이 되며, 안전하고 효과적인 치료제의 개발을 보장합니다. 전통적인 단일 복합 분석법, 예를 들어 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA)은 높은 시료 부피 요구, 긴 처리 시간, 각 분석물에 대한 별도의 실행 등의 한계가 있으며, 개별 시료 내에서 제한된 동적 범위를 제공합니다^1,2. 반면에 멀티플렉스 비드 기반 분석법은 여러 가지 용존 매개체를 동시에 검출할 수 있어 처리 시간과 시료 요구량을 줄이면서도 동적 범위를 증가시킵니다^1,2. 이러한 효율성과 분석 깊이는 CAR T 세포 연구 및 개발을 촉진하는 귀중한 도구를 제공합니다^3,4,5.

본 연구에서 제시된 멀티플렉스 분석법은 불변의 형광 프로파일을 나타내는 플루오레세인 아이소티오시아네이트(FITC) 및 피코에리트린(PE) 채널에 용존 분석물에 대한 특정 항체로 코팅된 캡처 비드를 사용합니다. 시료와 함께 배양하면 이 비드는 용액에서 대상 분석물을 선택적으로 결합합니다. 분석물 캡처 후, 분석물 특이적 샌드위치 복합체를 형성하기 위해 검출 항체가 추가됩니다. 이러한 항체는 알로피코시아닌(APC)(직접 검출) 또는 바이오틴(간접 검출)에 직접 결합되거나 간접 검출의 경우 바이오틴에 결합된 APC 항체와의 후속 배양이 필요합니다(그림 1). 캡처 비드, 분석물 및 검출 항체로 구성된 결과 복합체는 형광 세포 분석기를 사용하여 분석물 농도를 정량화합니다. 멀티플렉스 분석법은 분석물 특이적 표준 곡선을 생성하는 데 사용되는 미리 정의된 표준을 포함하는 플레이트 기반 기술입니다^1,2.

그림 1: 사이토카인 기술 원리 및 분석 워크플로우. 본 분석법은 분석물 특이적 항체에 결합된 12개의 형광 코드 캡처 비드 집단을 기반으로 합니다. 시료와의 배양 시 비드-분석물 복합체가 형성되어 특정 검출 항체를 사용하여 형광 세포 분석기로 검출할 수 있습니다. 분석 워크플로우에는 1) 필터 플레이트에 분석물 표준 및 관심 시료 준비, 2) 캡처 비드와의 배양, 3) 바이오틴 표지 항-분석물 항체와의 배양을 통한 샌드위치 복합체 형성, 4) APC 표지 항-바이오틴 항체와의 배양, 5) 측정을 위한 버퍼에서 재현, 6) 시료 획득 등이 포함됩니다. 여기를 클릭하여 이 그림의 확대본을 확인하십시오.

본 연구에서 설명된 멀티플렉스 분석법은 파란색(예: 488 nm; FITC 및 PE 채널) 및 빨간색 레이저(예: 635 nm; APC 채널)가 장착된 표준 형광 세포 분석기와 호환됩니다. 형광 세포 분석기는 연구 실험실, 임상 환경 및 품질 관리 환경에서 널리 사용되기 때문에 이러한 호환성은 추가 특수 장비를 요구하지 않고 구현을 용이하게 합니다⁵. CAR T 세포 기�

Protocol

모든 인간 샘플은 서면 동의서를 얻은 후 무명의 건강한 자원자로부터 수집되었습니다. 모든 절차는 Nordrhein의 의사회(#2020272)의 윤리위원회에서 승인되었으며 필요한 윤리 및 생물안전 규정에 따라 수행되었습니다.

1. CAR T 세포 공동 배양

1. 공유 항원, 예를 들어 항원 제시 종양 세포와의 비교에서 공유 항원이 없는 경우 2.5:1(이펙터: 표적 세포)의 비율로 변형된 인간 CAR T 세포의 세포 배양을 준비합니다.
2. 분비된 사이토카인을 한 번 분석하거나 정의된 시간 프레임 동안 사이토카인 동력학을 분석하기 위해 상청액 수집을 위한 하나 이상의 시간 지점을 정의합니다. 예: 4, 8, 16, 24, 48시간.
   노트: 상청액은 바로 사용하거나 나중에 사용할 수 있도록 동결할 수 있습니다.

2. 표준 및 샘플 준비

1. 200 µL의 완충액 또는 세포 배양 배지를 펠렛에 추가하여 분석물 표준을 재구성하고 부드럽게 혼합합니다. 재구성된 표준의 1:5 희석 시리즈를 6개의 시약 튜브에서 수행하고 3.2 pg/mL 또는 0.6 pg/mL(분석물에 따라 다름)까지 준비하고, 블랭크를 준비합니다.
2. 공동 배양 후 16시간 또는 24시간 후에 CAR T 공동 배양 상청액을 수집합니다. 선택적으로 흐름 세포분석을 사용하여 평행 표현형 분석을 위해 CAR T 세포를 수확합니다.
3. 샘플을 10,000 × g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리합니다. 표준 곡선 범위에 맞추기 위해 상청액을 그대로 사용하거나 희석합니다.

3. 분석 워크플로우

1. 캡처 비드 믹스를 완전히 재현하도록 보텍스합니다. 96웰 필터 플레이트의 웰에 50 µL의 표준 또는 샘플과 20 µL의 사전 희석된 비드를 추가합니다.
2. 실온에서 450 rpm에서 흔들며 어둠 속에서 2시간 동안 배양합니다. 진공 매니폴드 또는 원심분리기를 사용하여 버퍼 200 µL로 웰을 두 번 세척합니다.
3. 1:50 사전 희석된 탐지 시약 1(버퍼 내) 100 µL를 추가합니다. 실온에서 450 rpm에서 흔들며 어둠 속에서 1시간 동안 배양합니다. 두 번 세척합니다.
4. 1:50 사전 희석된 탐지 시약 2(버퍼 내) 100 µL를 추가합니다. 실온에서 450 rpm에서 흔들며 어둠 속에서 30분 동안 배양합니다. 한 번 세척합니다.
5. 획득을 위해 버퍼 200 µL에 샘플을 재현합니다. 분석 워크플로우의 개요는 그림 1에 나타나 있습니다.

4. 획득 및 데이터 분석

1. 파란색 및 빨간색 레이저(PE, FITC 및 APC 채널 필요)가 장착된 흐름 세포분석기에서 데이터를 획득합니다. MACSQuant 흐름 세포분석기를 사용할 때는 완전 자동화된 게이팅 및 데이터 분석을 위해 Express 모드 템플릿을 사용합니다.
2. 대체적으로 FSC 또는 MQD 데이터 파일을 웹 기반 InspectoR 도구에 업로드하여 자동화된 정량적 사이토카인 측정을 수행하고 사용된 기기와 관계없이 내보내기 준비된 결과를 제공합니다.
3. FITC 대 PE 채널에서 12개의 다른 캡처 비드 그룹의 적절한 분리를 확인합니다.
4. 표준 곡선을 적용하여 사이토카인 농도를 계산하고 결과를 내보내고 시각화합니다.
5. MACSQuant 흐름 세포분석기에서의 데이터 획득을 위해 캡처 비드 바이알의 2D 바코드를 사용하여 모든 관련 획득 설정이 포함되어 있습니다.
   1. 소프트웨어에 로그

Results

Identification of representative Capture bead populations encoding for 12 soluble analytes

Capture bead populations were identified using the FITC and PE channels of the flow cytometer. Distinct bead clusters representing individual analytes were clearly resolved in the biaxial plot, including IL-10, Granzyme B, MCP-1, IL-17A, Perforin, IL-2, IL-6, IFN-γ, TNF-α, IL-21, IL-4, and GM-CSF (Figure 2). Each population exhibited a unique fluorescence signature, confirming successful multiplex detection and clear differentiation of the measured cytokines and effector molecules.

Figure 2: Detection of representative multiplex capture bead populations. Capture beads contain inherent fluorescence intensities that can be used to distinguish the different analyte-specific populations. The scatter plot displays the separation of analyte-specific signals based on fluorescence intensity in the FITC (B1) and PE (B2) channels. The image shows a representative profile of the 12 Capture bead populations encoding for GM-CSF, Granzyme B, IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, MCP-1 (CCL2), Perforin, and TNF-α. Please click here to view a larger version of this figure.

Representative cytokine concentration profile of CAR T cells after co-culture with tumor cells

Following co-culture of CAR T cells with tumor target cells, cytokine concentrations were quantified using the human cytotoxicity panel of the multiplex assay (Figure 3). The CAR T cells secreted high levels of Granzyme B (49,950.2 pg/mL), IFN-γ (48,367.8 pg/mL), TNF-α (7,055.2 pg/mL), and GM-CSF (6,653.5 pg/mL), indicating potent activation and cytotoxic effector function in response to tumor engagement. IL-2 levels exceeded the upper detection limit (>10,000 pg/mL), consistent with strong proliferative signaling. The sample was not further diluted or re-measured. In contrast, cytokines associated with regulatory or alternative helper T cell responses, including IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, and MCP-1, were present at low or near-undetectable levels. These results suggest that the CAR T cells mounted a predominantly type 1 (Th1/cytotoxic) immune response characterized by high effector activity and limited immunosuppressive cytokine production.

Figure 3: Representative cytokine profile of CAR T cells after co-culture with tumor cells. Engineered Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells were co-cultivated overnight with JeKo-1 tumor cells. Cell culture supernatants were harvested after 16 hours of incubation and centrifuged to remove particulates. Diluted samples were analyzed using the human cytotoxicity panel of the multiplex assay. Two standard curves were carried out and the concentrations of all 12 analytes were determined. A representative data output for the analysis and calculation of analyte-specific concentrations using the flow cytometer's Express Mode is shown. The bar graph and accompanying table show the calculated levels (picogram/milliliter) of the 12 effector molecules. Please click here to view a larger version of this figure.

Cytokine secretion kinetics of CAR T cells upon antigen-specific stimulation

Following co-culture of CAR T cells with target cells expressing (Antigen⁺) or lacking (Antigen⁻) the cognate antigen, cytokine secretion was monitored over time using the human cytotoxicity panel of the multiplex assay. CAR T cells exhibited rapid and robust cytokine release upon recognition of Antigen⁺ targets, with strong upregulation of Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, and IL-2 within 8–24 h, reaching peak levels by 48 h (Figure 4). This pattern indicates potent activation and cytotoxic effector function following antigen engagement. Moderate increases in IL-6, IL-17A, and IL-21 were also observed, whereas IL-4, IL-10, MCP-1, and Perforin remained low or modestly elevated. In contrast, co-cultures with Antigen⁻ targets showed minimal cytokine induction across all analytes (Figure 4). Together, these data demonstrate that CAR T cell activation and effector cytokine production occur specifically in response to antigen recognition and intensify over time.

Figure 4: Effector molecule secretion kinetics of CAR T cells co-cultured with antigen-positive or antigen negative target cells​. Engineered Chimeric Antigen Receptor (CAR) T cells were co-cultured with target cells either expressing (Antigen⁺) or lacking (Antigen⁻) the cognate CAR T cell antigen for 4, 8, 16, 24, and 48 h. At each time point, culture supernatants were collected and analyzed using the human cytotoxicity panel of the multiplex assay to quantify a broad panel of soluble effector analytes over time. Cytokine kinetics for 12 analytes are shown (picogram/milliliter). Please click here to view a larger version of this figure.

Discussion

멀티플렉스 분석은 CAR T 세포 공동 배양에서 용해성 면역 매개체 반응을 분석하는 데 사용되었습니다. 항원 양성 표적 세포와 공동 배양된 CAR T 세포는 IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, Granzyme B 및 IL-2의 분비 증가를 보였으며, 이는 효과자 활성화 및 세포독성 기능과 일치합니다^4,5,8. 반면에 항원 음성 대조군은 낮은 사이토카인 생산을 보였으며, 이는 테스트된 조건에서 분석의 항원 특이성 반응을 구별하는 능력을 보여줍니다^5,8. 이러한 결과는 CAR T 세포 기능성 평가에 대한 분석의 적용 가능성을 지지하며, 능력 관련 분석, 안전성 관련 프로파일링 및 기전 연구에 사용할 수 있습니다.

고정 12-분석 패널은 CAR T 면역 활동에 대한 광범위한 개요를 제공하지만, 모든 응용 프로그램에서 분석 범위의 전체를 포착하는 것은 실용적이지 않을 수 있습니다. 예를 들어, 분석 검증이나 CAR T 세포 제품의 품질 관리(QC) 테스트와 같은 집중된 워크플로에 대해서는 패널을 축소된 하위 집합(예: IL-2, IFN-γ, 및 TNF-α)으로 축소하여 분석을 간소화하면서도 기능적 민감도를 유지할 수 있습니다^1,2.

프로토콜의 중요한 단계에는 CAR T 세포 공동 배양의 설계와 샘플링 조건의 적절한 선택이 포함됩니다. 특히 공동 배양 기간과 효과자 세포 수(E:T 비율)는 사이토카인 크기를 직접적으로 결정하므로 분석 설정 중에 정의되어야 합니다^5,6. 또한 샘플 희석은 분석 범위 내에 분석물 농도가 들어가도록 조정되어야 합니다^1,2. 따라서 문제 해결은 표준 곡선 성능 확인과 신호가 정량화 가능 범위를 벗어나는 경우 공동 배양 조건이나 희석 계수 조정에 초점을 맞추어야 합니다^1,2.

전통적인 단일 플렉스 ELISA와 비교하여 유세포 분석 기반의 멀티플렉스 플랫폼은 최소한의 샘플 볼륨에서 고밀도의 다중 분석물 데이터세트를 생성합니다. 단일 샘플 내에서 여러 분석물을 동시에 측정할 수 있으므로, 멀티플렉싱은 전체 시약 소모량을 줄이고, 샘플 처리량을 늘리고, 여러 단일 플렉스 분석을 수행하는 것에 비해 분석 시간을 단축할 수 있습니다^1,2. 자동화된 획득 및 표준화된 분석 옵션은 사용자 의존성 가변성을 줄이고, 실험 또는 제조 환경 전반에서 재현성 및 확장성을 지원할 수 있습니다^5,8. 표준 ELISA 검출 민감도는 일반적으로 16~2000 pg/mL 범위(고감도 키트의 경우 더 낮을 수 있음)⁷입니다. 이 연구에서 제시된 플랫폼 내에서 가장 낮은 검출 가능한 농도는 가장 민감한 분석물의 경우 0.05 pg/mL에서 고유하게 낮은 분석 민감도를 가진 분석물의 경우 약 93.8 pg/mL까지 다양합니다. 내부 평가에 따르면 측정된 분석물의 74% 이상이 5 pg/mL 미만의 검출 한계를 표시하고, 38%는 1 pg/mL 미만에서 검출 가능하며, 이는 시스템의 전반적인 민감도를 강조합니다. 멀티플렉스 민감도가 사이토카인에 따라 다양할 수 있으므로, 잠재적인 에피토프 경쟁은 중요한 고려 사항입니다. 이러한 간섭을 최소화하기 위해 분석은 각 분석물의 포집 및

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human	Miltenyi Biotec	130-125-800	Bead-based multiplex cytokine assay for flow cytometry
MACSPlex InspectoR Tool	Miltenyi Biotec	\	Web-based tool for automated gating and analysis of MACSPlex data
MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-096-343	Flow cytometry instrument of multiplex data measurement
MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer	Miltenyi Biotec	130-109-803	Flow cytometry instrument of multiplex data measurement
MACSQuant Express Mode	Miltenyi Biotec	\	Software for automated gating and analysis
TexMACS Medium	Miltenyi Biotec	130-097-196	Optimized serum-free cell culture medium developed for the cultivation and expansion of human and mouse T cells