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방법 논문

전립선염 치료에 있어 얼미아오 분말의 기전: 네트워크 약리학 및 실험적 검증에 기반한 연구

161 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70356

⸱

2026년 5월 29일

 , 
1Department of Traditional Chinese Medicine, Aerospace Center Hospital, 2The Second Department of Healthcare, China-Japan Friendship Hospital

이 논문에서

요약

네트워크 약리학적 접근법을 사용한 이 연구는 얼미아오 파우더가 염증 인자와 관련 신호 경로를 억제함으로써 전립선염에 치료 효과를 발휘한다는 사실을 밝혀냈습니다. 이후 시험 관 내 실험에서는 LPS 유도 전립선 상피세포 모델에서 이 추출물이 주요 염증성 사이토카인의 발현을 유의미하게 억제한다는 점이 추가로 입증되었습니다.

초록

이 프로토콜은 전립선염 치료에서 Ermiao Powder(EMP)의 작용 기전을 조사하기 위한 네트워크 약리학 및 실험적 검증 접근법을 제시합니다. 워크플로우는 단계별 설계를 따릅니다: (i) 활성 화합물 및 표적의 데이터베이스 기반 스크리닝, (ii) 상호작용 네트워크의 구축 및 분석, (iii) 시험관 내 실험 검증. 첫째, EMP의 활성 성분과 해당 표적은 TCMSP 데이터베이스에서, 전립선염 관련 표적은 GeneCards 데이터베이스에서 수집했습니다. EMP 표적과 질병 표적의 교차점을 이용해 주요 치료 표적을 식별하였습니다. 둘째, Cytoscape를 사용하여 "약물-활성 성분-표적-질병" 네트워크를 구축했습니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 분석과 교토 유전자 및 게놈 백과사전(KEGG) 경로 풍부화가 주요 표적에 대해 수행되었으며, IL6와 TNF와 같은 염증 인자가 핵심 표적으로 작용했고, PI3K/AKT와 MAPK를 포함한 경로가 유의미하게 풍부해졌음을 밝혀냈습니다. 마지막으로, LPS 유도 전립선 상피세포의 염증 모델을 사용하여 시험 관 내 검증이 수행되었습니다. EMP 치료는 LPS 치료 그룹에 비해 염증성 인자인 IL-6와 TNF-α의 방출을 유의하게 감소시켰으며(p < 0.05), EMP의 항염증 효능을 확인하였습니다. 이러한 통합적 접근법은 재현 가능한 틀을 제공하며, 이를 다른 다구성 치료 시스템 연구에 적용할 수 있습니다. 결론적으로, 본 연구는 EMP가 염증 반응 억제와 밀접하게 연관된 다중 성분, 다중 표적, 다중 경로 메커니즘을 통해 항전립선염 효과를 발휘한다는 점을 예비적으로 밝혀 임상적 응용에 과학적 근거를 제공한다.

서론

전립선염, 특히 만성 비세균성 전립선염은 복잡한 원인과 효과적인 치료법의 부재를 특징으로 하는 흔한 비뇨기학적 질환으로, 환자의 삶의 질에 상당한 부담을 줍니다 1,2,3. 현재 전립선염 임상적 관리는 항생제, α수용체 차단제, 비스테로이드성 소염제(4,5,6)를 포함한 통합적 접근법을 사용합니다. 주요 과제는 병인별 치료법의 부재와 심리적 요인과 신체 증상 간의 복잡한 상호작용으로, 이들이 불만족스러운 치료 결과와 빈번한 재발에 기여한다는 점입니다. 최근 몇 년간 침술과 한방 의학과 같은 통합 의학 접근법이 전립선염 관리에 널리 적용되어 유망한 효능을 보여주고 있습니다. 이러한 치료법의 안전성과 효능은 일련의 고품질 연구 증거(8,9,10,11,12)에 의해 입증되었습니다.

이와 관련해, 항염증 및 해독 효과로 알려진 얼미아오 파우더(EMP)와 같은 전통 중의학 제제는 유망한 대체 치료법을 제시합니다 13,14,15. 그러나 EMP가 전립선염에 대해 효능을 갖는 정확한 약리학적 기전은 다성분 특성 때문에 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다. 네트워크 약리학의 등장은 TCM 공식16,17의 특징적인 복잡한 '다중 성분, 다중 표적, 다중 경로' 작용 기전을 해독하는 강력한 도구를 제공합니다. 우리의 전략은 EMP의 활성 구성 요소와 잠재적 목표를 식별한 후, 네트워크 분석을 통해 주요 목표와 경로를 정확히 파악하는 것이었습니다. 이후 항염증 효과와 핵심 메커니즘을 생물학적으로 검증하기 위한 실험들이 진행되었으며, EMP 적용의 과학적 근거를 확립하는 것을 목표로 했습니다. 본 연구는 다성분 치료의 기전적 해석을 향상시키는 네트워크 약리학-실험적 검증 프레임워크를 도입합니다

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프로토콜

이 연구는 인간 참가자나 임상 샘플이 포함되지 않아 윤리적 승인이 필요하지 않았습니다. 세포주를 이용한 모든 절차는 기관의 생물안전 지침과 규정에 따라 수행되었습니다. 본 연구에 사용된 전립선 상피 세포주는 인증된 상업 공급업체로부터 획득하였습니다.

참고: 이 연구에 사용된 모든 시약, 기기 및 소프트웨어는 재료표에 나열되어 있습니다. 이 연구의 흐름도는 그림 1에 제시되어 있습니다.

1. 활성 성분 선별

  1. TCMSP 데이터베이스에 접속하세요.
  2. 검색창에서 "허브 이름"을 선택하고 "황보"를 입력한 후 "검색"을 클릭하세요.
  3. "OB" 필터를 클릭하고 "≥30"을 설정한 후 적용하세요.
  4. "DL"을 클릭하고 "≥0.18"을 설정한 후 적용하세요.
  5. 필터링된 결과를 엑셀 스프레드시트에 복사하세요.
  6. "창주"의 활성 성분을 얻기 위해 동일한 선별 방법을 적용하세요.
  7. 모든 데이터셋을 Microsoft Excel(버전 2019)에 가져오고, 화합물 목록을 Excel 형식으로 병합하여 중복된 활성 성분을 제거하세요.
  8. 중복된 활성 성분을 제거하려면 화합물명을 표준화하고 동일한 항목을 식별합니다. 여러 기록이 동일한 복합체에 해당할 경우, 대표적인 항목은 단 하나만 남았습니다.
  9. "황보", "창주", 그리고 활성 성분 간의 연관성을 확립하세요.

2. 활성 성분에 대응하는 표적을 얻는다

  1. TCMSP 데이터베이스에 접속하세요.
  2. 검색창에서 "화학물질명"을 선택하고 활성 성분을 입력한 후 "검색"을 클릭하세요.
  3. 각 활성 성분에 해당하는 타겟 이름을 복사하세요.
  4. 중복된 타겟 이름을 제거하고 활성 성분과 타겟 이름 간의 연관성을 확립하세요.
  5. UniProt 데이터베이스 (https://www.uniprot.org/)18에 접속하여 각 타겟 이름의 공식 유전자 심볼을 찾아 체계적으로 교체합니다.

3. 질병 표적 획득

  1. GeneCards 데이터베이스 (https://www.genecards.org)19.
  2. 검색란에 "Prostatitis"를 입력하고 검색 아이콘을 누르면 관련 유전자 목록을 얻을 수 있습니다.
  3. 유전자를 관련성 점수에 따라 내림차순으로 정렬하세요.
  4. 관련 유전자를 엑셀 형식으로 내보내세요.
  5. 점수 ≥1을 받은 표적을 전립선염 관련 표적으로 선정하였습니다.

4. 약물-활성 성분-표적-질병 규제 네트워크 구축 준비

  1. 활성 성분과 전립선염 관련 표적 간의 교차점을 얻고, 이를 전립선염 치료를 위한 EMP 표적으로 정의합니다.
  2. 전립선염 EMP의 활성 성분과 치료 표적 간의 연관성을 확립합니다.
  3. "Network"라는 이름의 엑셀 파일을 만들고, 앞 세 열은 "Node1", "Node2", "Net"으로 명명되어 있습니다.
  4. EMP와 약물 간의 연관성을 "Node1"과 "Node2" 열에 붙여넣고, 모든 행의 "Net" 열에 "drug"를 입력하세요.
  5. 약물-활성 성분 연관성을 "Node1"과 "Node2" 열에 붙여넣고, 모든 행의 "Net" 열에 "ingredient"를 입력하세요.
  6. 전립선염 치료를 위한 EMP 표적의 활성 성분-표적 연관성을 "Node1"과 "Node2" 열에 채우고, "Net" 열에는 "target"을 입력합니다.
  7. 전립선염에 대한 EMP의 치료 표적을 "Node1" 열에 붙여넣고, 모든 행에 대해 "Node2" 열에 "prostatitis"를, "net" 열에 "disease"를 입력하세요.
  8. Excel 파일 "Network"를 txt 형식 파일로 저장하세요.
  9. "Type"이라는 이름의 엑셀 파일을 만들고, 첫 두 열은 "Node"와 "Type"으로 명명됩니다.
  10. "Node" 열에 "EMP"를, "Type" 열에 "formula"를 입력하세요.
  11. "Huangbo"와 "Cangzhu"를 "Node" 열에 입력합니다; 모든 행의 "Type" 열에 "drug"를 입력하세요.
  12. "노드" 열에 활성 성분을 입력하고, 해당 행의 "Type" 열에 "ingredient"를 입력하세요.
  13. "노드" 열에는 전립선염 EMP의 치료 표적을 채우고, "타겟"은 "유형" 열에 입력합니다.
  14. 전립선염 관련 표적은 "노드" 열에 입력하고, 모든 해당 행의 "유형" 열에는 "질병"을 입력하세요.
  15. Excel 파일 "Type"을 .txt 형식 파일로 저장하세요.

5. Cytoscape의 "약물-활성 성분-표적-질병" 규제 네트워크 시각화

  1. 사이토스케이프를 런칭하세요.
  2. "파일 > 파일 시스템에서 네트워크 가져오기"> "파일 시스템"에 가서 "network.txt" 파일을 열어보세요.
  3. "스타일" 패널을 열어보세요. "Shape"를 선택한 후 "Column" 드롭다운에서 "Type"을 선택한 후 "Mapping Type"을 "Discrete Mapping"으로 설정하세요.
  4. 다음 범주에 명확한 노드 모양을 할당합니다: 조제, 약, 성분, 표적, 질병.
  5. "채우기 색상"을 선택하고, "열" 드롭다운에서 "유형"을 선택한 후 "매핑 유형"을 "이산 매핑"으로 설정하세요.
  6. 다음 범주에 대해 각각 다른 노드 색상을 할당하세요: 조제, 약물, 성분, 표적, 질병.
  7. "높이"와 "너비"를 선택하고, "컬럼" 드롭다운에서 "유형"을 선택한 후 "매핑 유형"을 "이산 매핑"으로 설정하세요.
  8. 다음 범주에 대해 서로 다른 노드 크기를 할당합니다: 조제, 약물, 성분, 표적, 질병.
  9. "라벨 글꼴 크기"를 선택하고, "열" 드롭다운에서 "Type"을 선택한 후 "Mapping Type"을 "Discrete Mapping"으로 설정하세요.
  10. 다음 범주에 대해 별도의 라벨 글꼴 크기를 할당하세요: 분유, 약물, 성분, 표적, 질병.
  11. 네트워크 레이아웃을 최적화하기 위해 노드를 수동으로 재배치하세요.
  12. "파일 > 네트워크 이미지를 파일로 내보내기"> 네트워크를 이미지로 저장하세요.

6. PPI 네트워크 분석 및 시각화

  1. https://cn.string-db.org/ 에 접속해서 "다중 단백질" 모듈로 가세요.
  2. 검색 창에 목표 유전자 목록을 입력하고, 생물체로 "Homo sapiens"를 선택한 후 "Search"를 클릭하세요.
  3. 결과가 로드된 후 "계속"을 클릭하세요.
  4. "설정" 패널을 열고 "최소 필요 상호작용 점수"를 "높은 신뢰도(0.700)"로 설정한 뒤, "네트워크 내 연결 없는 노드 숨기기"를 체크하세요.
  5. "Update"를 클릭한 후, "내보내기" 메뉴를 통해 PPI 연관 데이터를 TSV 형식으로 내보내세요.
  6. Cytoscape를 실행하고 파일 메뉴로 이동한 후 "파일 시스템에서 네트워크 가져오기"를 선택해 TSV 파일을 열어보세요.
  7. "도구" 메뉴로 이동한 후 "NetworkAnalyzer > 네트워크 분석 > 네트워크 해석 > 네트워크는 방향성이 없다고 취급하기"를 선택하세요.
  8. "파일" 메뉴로 이동해 "테이블 내보내기" 시스템을 선택한 후 네트워크 데이터를 내보내세요.
  9. "스타일" 패널로 이동해 "Shape", "Fill Color", "Height", "Width" 속성을 설정하세요.
  10. 노드를 재배치하여 PPI 네트워크 레이아웃을 조정하세요.
  11. "파일" 메뉴로 이동해 "네트워크 이미지를 파일로 내보내기"를 선택한 후 시각화된 네트워크를 이미지로 내보내세요.
  12. WPS로 내보낸 PPI 네트워크 데이터를 열고 "Degree" 열로 내림차순으로 정렬하세요.
  13. 상위 20개의 정렬된 대상을 선택하고, 막대 차트를 생성한 후 차트를 이미지로 저장하세요.

7. KEGG 경로 농축 분석

  1. 터미널이나 명령 프롬프트를 열고 R을 입력한 후 Enter 키를 누르세요.
  2. R 콘솔에서 다음 명령어를 하나씩 실행하세요:
    install.packages(c("RSQLite", "colorspace", "stringi", "BiocManager"))
    BiocManager::install(c("org. Hs.eg.db", "DOSE", "clusterProfiler", "pathview"))
  3. 전립선염 치료를 위한 EMP 표적의 유전자 심볼을 org를 사용하여 Entrez ID로 변환합니다. Hs.eg.db.
  4. Entrez ID를 읽고 clusterProfiler 패키지를 사용하여 매개변수를 사용하여 KEGG 농축 분석을 수행합니다: 생물체 = "has", pvalueCutoff = 0.05, qvalueCutoff = 0.05.
  5. 얻은 KEGG 농축 분석 결과에서 인간 질병 및 대사 관련 경로를 제거한 후, 남은 경로는 농축된 유전자 수에 따라 정렬합니다.
  6. 상위 15위 신호 경로와 표적 간의 연관성을 확립하세요.
  7. "경로"와 "타겟" 연관이 있는 2열 파일을 준비한 후, "파일 > 파일에서 네트워크> 가져오기"를 통해 Cytoscape로 가져오세요.
  8. "스타일" 패널을 사용해 경로와 타겟을 구분할 수 있도록 노드 모양과 색상을 설정하세요.
  9. 레이아웃을 수동으로 조정하고 네트워크를 이미지로 내보내세요.

8. 의약품 제제

참고: EMP 제형은 Phellodendri Chinensis Cortex(황보) 15g과 Atractylodis Rhizoma(창주) 15g으로 구성되어 있습니다. 이후 세포 기반 실험에서 추출물을 얻기 위해 물 추출 및 알코올 침전 방법이 사용되었다20.

  1. 약물을 10배 크기의 물에 1시간 동안 담가세요.
  2. 1시간 동안 도장한 후 거즈를 통과시켜 도덕을 얻습니다.
  3. 다시 10배의 물을 첨가하고 30분간 건조한 후 거즈로 걸러내어 증제액을 얻으세요.
  4. 다시 10배 정도의 물을 첨가하고 30분간 건조한 후 거즈로 걸러내어 증액을 얻으세요.
  5. 세 가지 여과된 첨가물을 섞은 후, 필터 페이퍼로 혼합물을 걸러냅니다.
  6. 감압 하에서 원래의 10%까지 증축하세요.
  7. 농축액을 식히고, 천천히 75%까지 저으며 에탄올을 넣은 뒤, 밀봉하고 4°C에서 12시간 보관합니다.
  8. 혼합물을 원심분리하여 상원액을 수집합니다.
  9. 저압 상태에서 증류를 계속하세요.
  10. 마지막으로 진공 동결건조기를 사용해 제품을 동염합니다.
    참고: 동건조 분말은 –20ºC에서 최대 3개월간 보관할 수 있어 안전한 휴식 지점 역할을 합니다. 다시 시작하자면, 필요에 따라 적절한 용매에서 가루를 재구성하세요.

9. 세포 해동 및 배양

참고: 구매한 세포는 드라이아이스에 의해 실험실에 전달되었습니다. 실험 시작 전, 케라티노사이트(K-SFM)는 인간 재조합 표피 성장 인자(rEGF)를 최종 농도인 5 ng/mL, 소 뇌하수체 추출물(최종 농도는 50 μg/mL), 그리고 1% 페니실린-스트렙토마이신을 보충하여 미리 준비했습니다.

  1. 물욕을 작동시키고 온도를 37°C로 조절하세요.
  2. 드라이아이스에서 세포를 꺼내 즉시 물욕에서 완전히 녹을 때까지 저어주세요.
  3. 세포에 5mL의 K-SFM을 추가하세요. 부드럽게 섞은 후 원심분리(4 °C, 500 × g, 5분)를 사용하세요.
  4. 상청액을 제거하고 펠릿을 완전한 K-SFM으로 재현탁합니다.
  5. 세포를 T-25 플라스크로 옮겨 세포 배양 인큐베이터에 넣으세요.
    참고: 세포 배양 인큐베이터의 환경 조건은 37°C, 5% CO₂, ≥ 95% 상대습도로 유지되었습니다.

10. 세포 하층 배양

참고: 세포 합류 비율이 80–90%에 도달했을 때 서브컬처링이 수행되었으며, 아위배양 비율은 1:2에서 1:3이었습니다.

  1. 배양액 상액을 유도한 후, 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.
  2. 2mL의 트립신-EDTA를 투여하고 세포를 3분간 방치시켜 효소 해리를 진행합니다.
    주의: 이 프로토콜은 지지다당류(LPS), 클로로포름, 에탄올, TRIzol 시약 등 유해 시약의 사용을 포함합니다. 유해 화학물질이 관련된 모든 시술은 인증된 화학 연기구 후드에서 적절한 개인 보호 장비(실험복, 장갑, 안구 보호구)를 착용한 채 수행되어야 합니다. 생물학적 물질은 기관의 생물안전 지침에 따라 취급되어야 합니다.
  3. 소화를 종료하기 위해 10% 태아 소 혈청을 보충한 K-SFM 배지를 추가하세요.
  4. 세포 혼합물을 15 mL 원심분리관에 옮기고, 원심분리기(4 °C, 500 × g, 5분)로 옮긴 후 상청액을 제거합니다.
  5. 세포 펠릿은 완전한 K-SFM에 재현탁된 후 새로운 배양 플라스크로 옮겨졌습니다.

11. MTS 분석을 통한 최대 약물 처리 농도 결정

참고: 각 약물 농도는 5회의 기술 복제로 테스트되었습니다.

  1. 로그 성장기의 RWPE-1 세포를 소화합니다.
  2. 세포를 완전한 K-SFM 배지에 재현탁한 후, 셀 농도를 세기로 측정합니다.
  3. 완전한 K-SFM 배지를 사용하여 세포 현탁액을 1 ×10 5 cells/mL로 조절합니다.
  4. 셀 현탁액을 96웰 플레이트에 100 μL씩 분배합니다.
  5. 96웰 플레이트는 배양을 위해 세포 배양 인큐베이터에 넣었습니다.
  6. 24시간 후, 세포가 완전히 접착되면 배양지를 흡입하여 버렸습니다.
  7. 배지를 다른 농도의 EMP 용액을 포함한 완전한 K-SFM 배지로 교체하세요.
  8. 플레이트를 다시 세포 배양 인큐베이터에 넣어 24시간 더 배양하세요.
  9. 배지를 흡인한 후 PBS로 세포를 두 번 헹구세요.
  10. 각 웰에 100μL의 완전한 K-SFM 배지를 추가한 후, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 추가로 4시간 더 배양합니다.
  11. 각 웰에 10 μL MTS 용액을 분사하고, 1시간 인큐베이션 후 490 nm에서 OD를 측정합니다.
  12. 블랭크 대조군(LPS 자극이나 약물 처리 없이 완전 배양지에서 배양한 세포)을 기준선으로 사용하여 각 처리 농도별 세포 증식을 계산하였다.
    참고: 세포 증식에 유의미한 영향을 미치지 않는 최고 농도는 고용량 치료로 정의되었고, 그 다음이 중간 용량 치료의 절반, 저용량 치료로 4분의 1 농도가 순이었습니다.

12. 세포 개입

  1. 로그 성장기의 RWPE-1 세포를 소화합니다.
  2. 세포들은 완전한 K-SFM 배지에 재현탁되었고, 세포 농도는 세포 계수로 결정되었습니다.
  3. 세포 현탁액은 완전한 K-SFM 배지를 사용하여 5 ×10 5 cells/mL의 밀도로 조정되었습니다.
  4. 세포 현탁액은 6웰 플레이트에 웰당 2mL로 시딩되었습니다.
  5. 플레이트는 배양 인큐베이터에 넣어 세포 부착을 위해 12시간 배양했습니다.
  6. 세포는 각각 저농도(150 μg/mL), 미디엄(300 μg/mL), 고용량(600 μg/mL) EMP 농도로 처리되었습니다.
  7. 1시간 후 배양액에 10 μg/mL의 LPS 용액을 첨가했습니다.
  8. 24시간 치료 후, 상정액을 수집하여 ELISA를 사용하고, 세포를 채취하여 RT-PCR 분석을 진행했습니다.
    참고: LPS는 전립선 상피 세포에서 염증 유발 신호 경로를 활성화하는 확고한 능력 때문에 염증 반응을 유도하는 데 선택되었습니다; 농도(10 μg/mL)는 이전 연구에서 강력한 사이토카인 유도를 입증한 바탕으로 선택되었습니다.

13. 총 RNA 분리

참고: RNA 분해를 방지하기 위해 실험 과정 내내 장갑과 마스크를 착용했으며, RNase 프리 피펫 팁과 원심분리관을 사용했습니다.

  1. 중재 후에는 PBS로 세포를 두 번 세척하세요.
  2. 트리졸 시약 1mL를 세포에 첨가하고 피펫으로 반복해서 혼합하여 균질화를 보장합니다.
    주의: 모든 절차를 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 화학 연기 후드에서 수행할 것.
  3. 용해물을 1.5mL 마이크로 원심분리관으로 옮겨 실온에서 15분간 배양합니다.
  4. 그 후 0.2mL의 클로로포름을 첨가하고 샘플을 강하게 소용돌이로 만듭니다.
  5. 실온에서 5분간 두었다가 10,000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리합니다.
  6. 원심분리 후에는 상부 무색 수상을 조심스럽게 신선한 마이크로 원심분리관으로 옮기세요.
  7. 같은 부피의 미리 냉각된 이소프로판올을 넣고 충분히 섞은 후 실온에서 10분간 배양합니다.
  8. 샘플을 다시 원심분리(4 °C, 10,000 × g, 10분)한 후 액체 상을 버리고 침전물을 유지합니다.
  9. 펠릿을 1mL의 미리 냉각된 75% 에탄올로 헹구고 피펫으로 부드럽게 재현탁합니다.
  10. 4 °C, 7,500 × g 에서 10분간 최종 원심분리를 수행한 후 상원액을 제거하고 RNA 펠릿을 생물안전 캐비닛에서 자연 건조시킵니다.
  11. 정제된 RNA를 DEPC 처리된 물 50μL에 녹입니다.
  12. NanoDrop 분광광도계를 사용하여 RNA 순도를 평가하고 단백질 및 용매 오염을 최소화한 후 RNA 농도, A260/A280 비율, A260/A230 비율을 측정합니다.

14. RT-PCR

  1. 총 RNA 1 μg를 사용하여 20 μL 역전사 반응 시스템을 준비합니다.
  2. 반응 시스템을 42°C에서 15분간 배큐하고, 95°C에서 5분간 배큐한 후 4°C까지 냉각합니다.
  3. 증류수를 사용해 생성된 cDNA를 10배로 희석합니다.
  4. 희석된 cDNA를 사용해 20 μL PCR 반응 시스템을 준비합니다.
  5. 열 사이클러를 프로그래밍하고 초기 대기 상태를 95°C에서 60초간 설정한 후, 95°C에서 15초, 60°C에서 60초간 40주기를 진행합니다.
  6. 완성 후 모든 목표 유전자와 참조 유전자의 CT 값을 기록하여 용융 곡선 분석을 수행하세요.
  7. 2(-ΔΔCT) 방법을 사용하여 표적 유전자의 정규화된 발현 수준을 측정합니다.

15. ELISA 분석

참고: ELISA 키트를 보관 후 30분 동안 실온에서 평형으로 두어 사용하세요.

  1. 제조업체의 지침에 따라 표준 용액을 준비하고, 표준 용액, 비오티닐화 항체, 효소 접합체, 세척 완충제에 대해 적절한 희석을 수행하세요.
  2. 수집한 세포 배양 상청액(4 °C, 10,000 g × 10분)을 원심분리하여 상청액을 수집합니다.
  3. 표준 희석액 100 μL과 시험 샘플을 미리 코팅된 우물로 옮깁니다.
  4. 접착 스트립으로 웰을 밀봉하고 플레이트를 37°C에서 90분간 배양하세요.
  5. 웰에서 액체를 버리고 자동 플레이트 와셔로 플레이트를 세척하세요.
    참고: 자동 세척기 매개변수를 다음과 같이 설정하세요: 웰당 350 μL 세척 버퍼, 분배와 흡입 사이 15초 담금, 5회 완전 사이클.
  6. 각 웰에 100 μL 비오틴화 항체 작업 용액을 투여합니다. 37°C에서 60분간 배양하세요.
  7. 용액을 버리고 15.5에 설명된 대로 플레이트를 세척하세요.
  8. 웰당 효소 결합액 100 μL 피펫을 채운 후 37 °C에서 60분간 배양합니다.
  9. 용액을 버리고 15.5에 설명된 대로 플레이트를 세척하세요.
  10. 각 웰에 100 μL의 염색 기질을 추가합니다. 빛으로부터 보호하며 37°C에서 15분간 유지하세요.
  11. 각 웰당 100 μL 정지 용액을 피펫 채운 후 부드럽게 혼합합니다.
  12. 즉시 450 nm에서 광학 밀도(OD)를 측정하세요.
  13. Curve Expert 소프트웨어를 사용해 평균 OD 값을 표준 농도와 대비하여 표준 곡선을 설정하세요.
  14. 각 샘플의 농도를 표준 곡선에서 보간하여 OD 값을 결정합니다.

16. 통계 분석

  1. SPSS 소프트웨어(버전 20.0)를 작동하세요.
  2. 데이터셋을 SPSS Statistics에 가져오고 변수를 적절히 정의하세요. Analyze > Descriptive Statistics> Explore 를 사용하여 평균 및 표준편차(SD)를 계산하세요.
  3. 다중 그룹 비교에는 Analyze > Compare Means> 단방향 ANOVA 를 사용하세요.
  4. 테스트 결과 표에서 p값을 직접 얻어 적절히 보고하세요.
  5. 모든 결과를 평균± SD로 제시하고, p < 0.05 시 통계적으로 유의미한 차이를 고려합니다.

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결과

활성 화합물 식별 및 표적 예측

이 결과들은 전립선염에서 EMP의 치료 표적을 식별하고 검증하는 데 있어 통합 네트워크 약리학과 시험관 내 접근법의 효과를 입증합니다. TCMSP 데이터베이스 검색을 통해 EMP의 구성 허브에서 46가지 생리활성 성분이 확인되었으며, 이는 178개의 잠재적 표적에 해당합니다. Genecards 데이터베이스에서 전립선염 관련 표적 13,960개가 획득되었습니다. 두 세트 모두에 공통적으로 존재하는 162개의 표적이 전립선염 치료에서 EMP의 표적으로 정의되었습니다. 이후 Cytoscape를 사용하여 화합물-표적 상호작용 네트워크가 구축되고 시각화되었습니다(그림 2). 포괄적인 "약물-활성 성분-표적-질병" 규제 네트워크에 참여하는 활성 성분은 표 1에 나열되어 ...

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토론

이 프로토콜은 네트워크 약리학과 실험적 검증을 통합하여 다성분 치료 기전 연구를 위한 체계적인 틀을 제공합니다. 중요한 단계로는 정의된 임계값(OB ≥ 30%, DL ≥ 0.18)을 이용한 활성 화합물의 정확한 스크리닝, 신뢰할 수 있는 네트워크 구축, 그리고 적절한 실험 검증 모델의 선택이 포함됩니다. 생물정보학 분석에서 신중한 매개변수 선택과 실험 조건의 엄격한 통제가 재현성을 보장하는 데 필수적입니다.

전립선염은 불명확한 병인, 기존 치료에 대한 부적절한 반응, 그리고 지속 증상에 대한 심리적 요인의 복잡성 때문에 임상적으로 관리하기 어려운 비뇨기 질환입니다. EMP와 기타 중의학 치료법은 전립선염 증상과 염증에 대한 유망한 효능으로 보완 치료법으로 주목받고 있습니다. 이 연구 결과는 네트워크 약리학과 시험관 내 실험을 통해 입증된 EMP의 다중 표적 항염증 효과에 대한 새로운 시각을 제시합니다. ...

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공개 사항

저자들은 이 연구에서 이해 상충이 없다고 보고했습니다.

감사의 글

이 연구는 중국-일본 우호병원 청년 프로젝트(번호 2020-1-QN-8)의 지원을 받았으며, 항공우주센터병원(번호 YN202530).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
인간 IL-6 엘리사 키트4아비오CHE0009
인간 TNF-&α; 엘리사 킷4아비오CHE0019
K-SFM 보충자료프로셀CM-0200
지포다당류솔라비오L8880
MTS프로메가G1111
역전사 시스템프로메가A3500
RWPE-1프로셀CL-0200RRID:CVCL_EQ24
RWPE-1 세포 완전 배지프로셀CM-0200
SYBR 그린 실시간 PCR 마스터 믹스토요보QPK-201
트리졸 시약서모피셔 사이언티브 (인비트로젠)15596026
트립신-EDTA깁코 (써모피셔)25200072

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