방법 논문

CRISPR 시스템을 위한 단일 가이드 RNA DNA 템플릿의 신속 합성을 위한 1단계 겹침 PCR

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DOI:

10.3791/70369

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2026년 4월 24일

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1Institute of Cytology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China, 2Translational Medicine Institute, the First People's Hospital of Chenzhou, Hengyang Medical School, University of South China, 3National Health Commission Key Laboratory of Birth Defect Research and Prevention & Ministry of Education Key Lab of Rare Pediatric Diseases, Institute of Cell Biology and Genetics, School of Basic Medical Sciences, Hengyang Medical School, University of South China

이 논문에서

요약

네 가지 프라이머를 이용한 한 단계 겹침 PCR 방법은 시험 관 내 sgRNA 전사를 위한 DNA 템플릿의 빠르고 저비용으로 생성할 수 있게 합니다. 최적화된 프라이머 비율(50:5:1:50)은 5시간 이내에 고품질 sgRNA를 생성하며, 시험 관 내 분석과 HEK293T 세포 내 편집 활동을 통해 기능적 검증이 입증되었습니다.

초록

CRISPR–Cas 시스템은 유전체 편집에 혁신을 가져왔습니다; 그러나 단일 가이드 RNA(sgRNA) 생성을 위한 기존의 방법은 종종 시간이 많이 소요되는 클로닝 단계나 고가의 상업용 합성 키트를 포함합니다. 시험 관 내 sgRNA 전사를 위한 DNA 템플릿의 빠르고 비용 효율적인 합성을 위한 최적화된 1단계 겹침 PCR 전략이 제시되었습니다. T7 프로모터, 표적 특이적 가이드 서열, sgRNA 스캐폴드에 걸쳐 부분적으로 겹치는 네 개의 프라이머를 사용하여 클로닝 없이 단일 PCR 반응으로 전체 길이 템플릿을 조립합니다. 체계적인 실험 최적화를 통해 최적의 프라이머 비율(AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:50:50)이 확립되어 비특이적 부산물을 최소화하고 전체 길이 생성물 수율을 극대화하는 것으로 아가로스 겔 전기영동으로 확인되었습니다. 이 접근법은 Staphylococcus aureus Cas9(saCas9) sgRNA의 주형을 생성하는 데 성공적으로 확장되었으며, Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9)를 넘어 교차계 적용 가능성을 입증했습니다. sgRNA의 직접 화학 합성은 높은 순도, 안정성을 위한 화학적 변형, 표적 외 효과 감소 등의 장점을 제공하지만, 고처리량 응용이나 다수의 sgRNA가 필요한 대규모 스크리닝에는 여전히 비용이 매우 높습니다. 시험관 내 절단 분석법은 이 방법으로 생성된 가이드 RNA가 기존 플라스미드 기반 클로닝 과 유사한 편집 효율성을 달성함을 입증했습니다. 더불어, 이 sgRNA로 조립된 리보핵단백질 복합체가 전기천공 을 통해 HEK293T 세포에 전달되면, 표적 유전자좌에서 감지 가능한 인델 형성이 이루어져 생체 내 기능을 확인했습니다. 비용 분석 결과, 이 방법은 상업용 합성 키트에 비해 템플릿 준비 비용을 크게 줄이고, 소요 시간을 며칠에서 몇 시간으로 단축시켜 유전학 연구에 참여하는 실험실에 접근성 있고 확장 가능한 접근법을 제공합니다.

서론

박테리아와 고세균의 적응 면역 기전에서 유래한 CRISPR–Cas 시스템은 다양한 생물에 대한 정밀한 게놈 편집을 가능하게 하여 유전공학에 혁신을 가져왔습니다 1,2. 핵심 구성 요소는 단일 가이드 RNA(sgRNA)로, Cas 뉴클레아제를 특정 게놈 유전자위로 유도하는 키메라 RNA입니다; 모듈식 설계는 약 20개의 뉴클레오타이드 프로토스페이서 서열을 변형하여 재표적화할 수있습니다. SpCas9 외에도 독특한 특성을 가진 다른 Cas 뉴클레아제들이 널리 채택되었습니다. 황색포도상구균 Cas9(saCas9)는 크기가 작아 선상 관련 바이러스(AAV) 전달을 용이하게 하여 전달 옵션을 확장합니다. 각 시스템은 특정 가이드 RNA 구조를 필요로 하므로, 다재다능한 합성 방법이매우 중요합니다.

기능적 가이드 RNA를 생성하는 전통적인 방법으로는 플라스미드 기반 클로닝, 상업용 sgRNA 합성 키트, 또는 sgRNA의 직접 상업 적 합성 5,6이 있습니다. 플라스미드 기반 클로닝은 제한 소화, 연결, 형질전환, 콜로니 스크리닝 등 여러 노동 집약적 단계를 필요로 하며, 보통 48시간 이상 소요됩니다. 상업용 sgRNA 키트는 간소화된 작업 흐름(<5시간)을 제공하지만, 고처리량 응용에는 여전히 매우 비싸며, 반응당 비용이 보통 $35–$45입니다. sgRNA의 직접 화학 합성은 높은 순도, 안정성을 높이는 화학적 변형, 그리고 오프타겟 효과 감소 등의 장점을 제공합니다. 그러나 고처리량 응용이나 수백 개의 sgRNA가 필요한 대규모 스크리닝에서는 비용이 매우 비싸며(일반적으로 sgRNA 당 200–$280) 부담이 큽니다.

반면, 여기서 설명한 1단계 겹침 PCR 방법은 표준 프라이머를 사용하여 5시간 이내에 템플릿 합성을 완료하며, sgRNA당 약 5–8달러의 비용을 부담하여 시간과 재료 비용 모두에서 상당한 절감을 의미합니다. 더불어, 이 방법으로 생성된 sgRNA는 시험 관 내 절단 분석으로 확인된 바와 마찬가지로 플라스미드 기반 클로닝과 유사한 편집 효율을 달성합니다. 이 방법들의 비교는 그림 1에 나와 있습니다.

오버랩 확장 PCR(OE-PCR)은 DNA 조각을 빠르고 리가아제에 의존하지 않는 전략으로 조립할 수 있는 전략을 제공합니다8. 이 접근법은 겹치는 프라이머를 이용한 sgRNA 템플릿 합성에 적용되었습니다. 네 개의 부분적으로 겹치는 프라이머를 이용한 단일 단계 반응에서는 경쟁 결합이 일어납니다: 외부 프라이머(AF1 및 Tracr-R)가 증폭 경계를 정의하고, 내부 프라이머(AF2와 AF3)는 양 끝에서 중심으로 질서 있게 확장되도록 희석되어야 합니다. 이러한 이론적 틀에도 불구하고, 조립 효율에 영향을 미치는 중요한 매개변수인 최적 프라이머 비율은 체계적으로 연구되지 않았습니다. 더불어, 이러한 OE-PCR 방법들이 다양한 CRISPR 시스템 전반에 걸쳐 더 널리 적용될 가능성은 아직 충분히 탐구되지 않았습니다.

이러한 한계를 해결하기 위해 sgRNA 주형 합성을 위한 한 단계 겹치는 PCR 방법을 최적화하고 검증하는 연구가 설계되었습니다. 최적의 프라이머 비율은 구조화된 실험 설계를 통해 확립되었으며, 아가로스 겔 전기영동을 통해 단일 적정 크기의 산물을 얻는 조건을 식별했습니다. 최적화 후, 이 방법의 다양성을 두 가지 널리 사용되는 CRISPR 시스템(SpCas9와 saCas9)에서 평가했으며, 두 템플릿 모두 성공적으로 증폭되었습니다. 시험 관 내 절단 분석법을 이용한 기능 검증 결과, 이 방법으로 생성된 sgRNA 가 플라스 미드 기반 클로닝과 유사한 효율성을 달성함을 입증했습니다.

세포 맥락에서의 기능을 추가로 평가하기 위해, SpCas9 sgRNA는 Cas9 단백질과 복합체화되어 리보핵단백질(RNP) 복합체를 형성하고 전기천공 을 통해 HEK293T 세포에 전달했습니다. 내인성 유전자 좌위의 게놈 편집은 T7 엔도뉴클레아제 I(T7EI) 분석법을 사용하여 평가되었으며, 아가로스 겔에서의 절단 패턴은 생체 내에서 감지 가능한 인델 형성을 나타냅니다. 종합적으로 이 방법은 고품질의 기능성 sgRNA 템플릿을 신뢰성 있게 생성함을 보여줍니다. 다음 프로토콜은 SpCas9를 대표적인 예로 사용하여 다른 Cas 뉴클레아제에 적응할 수 있는 프라이머 템플릿을 상세히 설명합니다.

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프로토콜

상용 HEK293T 세포주(ATCC CRL-3216)의 사용은 중국 남방대학교 천저우시 제1인민병원 윤리위원회의 인간유래세포주 사용 지침에 따라 진행되었습니다. 사용된 시약, 소프트웨어 및 장비는 재료표에 기재되어 있습니다.

1. sgRNA 표적 서열 설계

  1. CRISPRscan, CHOPCHOP, Broad Institute CRISPick과 같은 기존 온라인 도구를 사용하여 목표 유전체 영역을 식별합니다.
  2. https://chopchop.cbu.uib.no/ 3.9에서 CHOPCHOP 웹 서버에 접속하세요.
  3. 목표 유전자 정보를 입력하고 적절한 CRISPR/Cas 시스템(예: CRISPR/Cas9용 EGFR)을 선택하세요(그림 2A).
  4. 순위, 표적 서열, 유전체 위치, 가닥, GC 함량(%), 자기상보성, 예측된 오프타겟 부위(MM0, MM1, MM2, MM3), 효율성 점수(그림 2B)를 포함한 출력 표를 검토하십시오.
  5. 목표 내 효율이 높고 예측되는 오프타겟 활성이 낮은 가이드 RNA 서열을 선택하세요.
  6. 프라이머 설계를 위해 최종 sgRNA 표적 서열을 기록하세요(예: EGFR 표적 서열: "CTTAATTCCTTGATAGCGACGG")(그림 2B).

2. 네 가지 겹치는 프라이머의 합성 및 준비

  1. 다음과 같이 겹치는 영역을 가진 네 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머(AF1, AF2, AF3, Tracr-R)를 설계합니다(그림 3A):
    AF1: 5′–TTCTAATACACTCACTTAG
    [타겟 연속] GTTTTAGAGCTAGAAATAG–3′
    AF2: 5′–GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGT
    TAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAAC–3′
    AF3: 5′–GGCTAGTCCGTTATCAACTTG
    AAAAAGTGGCACCGAGTCGTGGTGTT–3′
    트랙-R: 5′–AAAAAAAACCACCGACTCGTGCCAC–3′
    참고: AF1 프라이머의 [표적 시퀀스]를 1.6단계에서 얻은 서열로 교체하세요.
  2. 표준 탈염 정제와 함께 25 nmol 스케일의 프라이머를 합성합니다.
  3. 건조된 프라이머를 뉴클레아제가 없는 물에 재고 농도 100 μM로 재현탁합니다. 원심분리기를 5000 × g 온도에서 실온에서 1분간 사용합니다.

3. sgRNA 템플릿 합성을 위한 프라이머 농도 최적화 및 1단계 겹침 PCR

  1. 표 1에 따라 AF2 및 AF3 농도가 다른 프라이머 혼합물을 준비 합니다. AF1과 Tracr-R은 10 μM으로 유지합니다.
  2. 표 2에 따라 0.2 mL 무뉴클레아제 튜브에서 PCR 반응을 준비 합니다. 고충실도 DNA 중합효소를 사용하세요.
  3. 피펫팅으로 5번 부드럽게 섞으세요. 소용돌이치지 마세요. 원심분리기는 5000 × g 에서 1분간 돌립니다.
  4. 표 3에 설명된 사이클링 조건을 사용하여 PCR을 실행하세요.

4. DNA 주형의 전기영동 및 회수

  1. 2% 아가로스 젤을 100 mL의 1× TAE 버퍼 100 mL에 녹여 준비합니다. 50–60 °C로 식힌 후 5 μL 핵산 염색액을 추가한 후 젤을 주조합니다.
  2. 젤을 실온에서 30분간 굳히세요.
  3. 10 μL PCR 산물을 6× 로딩 버퍼 2 μL과 혼합하여 투여합니다. 100 bp DNA 래더를 포함하세요.
  4. 100V에서 30–40분간 전기영동을 진행하세요.
  5. 자외선 조명 아래에서 시각화하세요. 조건 9(AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:50:50:1:50)가 단일 ~120 bp 밴드를 생성하는지 확인하세요 (그림 4A).
  6. 최적화된 프라이머 농도를 사용: AF1 10 μM, AF2 1 μM, AF3 0.2 μM, Tracr-R 10 μM.
  7. 멸균 메스로 목표 밴드를 절제하세요. 자외선 노출은 ≤30초로 제한하세요.
    참고: 젤 슬라이스는 −20 °C에서 최대 1주일간 보관하거나 즉시 보관하세요.

5. DNA 주형의 정제

  1. 제조사 지침에 따라 젤 추출 키트를 사용해 DNA를 정제하세요10.
  2. 20–30 μL 예열(60 °C) 무뉴클레아제물에서 DNA를 용출합니다.
  3. DNA 농도를 측정하세요. 일반적인 수율: 15–50 ng/μL; A260/A280: 1.8–2.0.
    참고: 정제된 DNA는 −20 °C에서 최대 1년간 보관하세요.

6. 시험관 내 전사 및 sgRNA 정제

  1. T7 RNA 합성 키트를 사용해 전사 반응을 조립합니다(표 4). 얼음 위에 준비하세요11.
    참고: RNase 무첨가 재료를 사용하고 모든 표면을 오염 제거하세요.
  2. 37°C에서 16시간 배양하세요.
  3. 1 μL DNase I를 추가하고 37 °C에서 15분간 배큐합니다.
  4. RNA 정화 키트를 사용해 sgRNA를 정제하세요12.
  5. 30–50 μL 무핵효소 물에 용출.
  6. sgRNA를 정량화합니다. 예상 수율: 700–900 ng/μL; A260/A280: 1.9–2.1.
    참고: sgRNA는 −80 °C에서 최대 1년간 저장하세요.

7. sgRNA 활성을 검증하기 위한 시험관 내 절단 분석

  1. 표적 DNA를 준비하고 정제하세요. 농도를 60 ng/μL13으로 조절하세요.
  2. 절단 반응을 조립하라(표 5)—DNA 없이 25°C에서 30분간 사전 인큐베이션. 음성 대조군을 포함한다.
  3. 1 μL 표적 DNA를 추가합니다.
  4. 37°C에서 2시간 배양하세요.
  5. 반응을 멈추기 위해 6× 로딩 버퍼 4μL를 추가합니다.
  6. 2% 아가로스 젤에 100V 전압으로 30–40분간 제품을 돌립니다.
  7. 자외선 아래에서 시각화하세요. 절단 상태를 확인하세요(예: 617 bp → 414 bp + 203 bp) (그림 4C).

8. sgRNA 유도 Cas9 편집의 세포 검증

  1. Cas9 단백질과 sgRNA를 1:2 몰 비율로 혼합하여 리보핵단백질(RNP) 복합체를 준비합니다. Cas9 10 μL (4 mg/mL), 280 μL sgRNA(60 ng/μL), 200 μL DMEM을 결합합니다. 15분간 배큐합니다.
  2. 세포를 ~80% 융합률로 배양HEK293T. 샘플당 3× 106개의 세포 로 수확 및 조정합니다.
  3. RNP 복합체와 세포를 결합한 후 상온에서 10분간 배양합니다.
  4. 2mm 전기천공 쿠벳으로 옮깁니다. 115 V에서 4 ms, 한 펄스(575 V/cm)로 전기소공화합니다. 즉시 10 mL 완전 배지를 추가하고 6웰 플레이트로 옮깁니다.
  5. 37°C에서 5%CO2 와 함께 48시간 배양하세요.
  6. 처리된 대조 세포에서 유전체 DNA를 추출합니다. 농도를 측정합니다.
    참고: DNA는 −20°C에서 최대 6개월간 보관하세요.
  7. PCR로 표적 유전자를 증폭합니다(표 6 및 표 7).
    참고: EGFR의 예상 제품 크기: 617 bp.
  8. 2% 아가로스 겔에서 PCR 제품을 검증하세요. 올바른 밴드를 정제하고 DNA를 정량하세요.
  9. 이중이중이중 형성을 수행하세요(표 8 과 표 9).
  10. 1 μL T7 엔도뉴클레아제 I를 추가하고 37°C에서 15분간 배큐합니다. 85°C에서 10분간 비활성화합니다.
  11. 로딩 버퍼를 추가하고 2% 아가로스 젤에 투여하세요.
  12. 자외선 아래에서 시각화하세요. 인델 형성(617 bp → 414 bp + 203 bp) (그림 4D) 확인.

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결과

1단계 겹치는 PCR 프로토콜을 성공적으로 적용하면 아가로스 겔 전기영동으로 분석할 때 예상 크기의 단일 선명한 DNA 밴드가 생성됩니다.

특히 내부 프라이머가 과도하게 농도가 높은 프라이머 비율(AF2 및 AF3)은 예상보다 더 큰 추가 밴드를 발생시키며, 이는 비특이적 증폭 또는 프라이머-다이머 형성을 나타내며, 조립 중간체가 불완전하다는 희미한 밴드도 나타납니다(그림 4A, 조건 1, 4, 7, 10). 이러한 비최적 조건은 음성 대조군 역할을 하여 최적화된 조건과의 비교를 가능하게 합니다(그림 4A, 조건 9).

최적화된 프라이머 비율(AF1:AF2:AF3:Tracr-R = 50:50:50, 각각 10 μM, 1 μM, 0.2 μM, 10 μM에 해당)을 사...

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토론

1단계 겹치는 PCR 전략 을 통해 sgRNA DNA 주형을 합성하는 효율적이고 경제적인 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법은 플라스미드 구축과 클로닝의 필요성을 없애 주형 준비 시간을 며칠에서 약 5시간으로 단축시킵니다. 이 접근법의 핵심 측면은 프라이머 비율의 체계적 최적화로, 50:5:1:50 (AF1:AF2:AF3:Tracr-R)으로 결정되며, 각각 10 μM, 1 μM, 0.2 μM, 10 μM의 작업 농도에 해당합니다. 이 비율은 비특이적 부산물을 최소화하고 전체 길이 산물의 수율을 극대화하여 후속 시험관 내 전사 및 유전자 편집 응용을 지원합니다. 이 방법으로 생성된 sgRNA의 기능적 검증은 시험 관 내 절단 분석과 포유류 세포 맥락에서 HEK293T 세포를 이용한 실험을 통해 입증되었습니다.

조립 공정은 PCR 중 경쟁 프라이머 결합에 기반합니다. 주형...

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공개 사항

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감사의 글

이 연구는 후난성 보건위원회 보건 연구 프로젝트(보조금 번호 W20243264), 후난성 자연과학재단(보조금 번호 2023JJ50368), 후난성 교육부 핵심 연구 프로젝트(보조금 번호 24A0607), 그리고 첸저우 제1인민병원 혁신팀 프로젝트(보조금 번호 CX202103)의 지원을 받았습니다.

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재료

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이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 bp DNA LadderTIANGENMD109전기영동용 DNA 크기 마커
2Taq Plus MasterMixCWBIOCW2849MPCR 증폭 시약
50 bp DNA LadderTIANGENMD108소형 단편용 DNA 크기 마커
6DNA loading bufferTIANGEN1109565전기영동용 시료 로딩 버퍼
Agarose Gel DNA Recovery KitTIANGENDP219아가로스 겔에서 DNA 정제
Agarose I Thermo Scientific 17850아가로스 겔 준비
Broad Institute CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/publicsgRNA 설계 도구
CentrifugeHENGNUO2-16R시료 원심분리
Certified Copper Fetal Bovine SerumUmedium, Beijing BioTopped Technology Co., Ltd3023A세포 배양 보충제
CH3CO2HShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA758682TAE 완충액 제조 시약
CHOPCHOPhttps://chopchop.cbu.uib.no/sgRNA 설계 도구
CO2 incubatorThermo Scientific51032874포유류 세포 배양 육성
CRISPRscanhttps://www.crisprscan.org/sgRNA 설계 도구
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)KeyGEN BioTECHKGL1211-500세포 배양 배지
dsDNaseThermo Scientific EN0771전사 후 DNA 템플릿 제거
ECM 830 Square Wave Electroporation SystemBTXECM830세포 전기 투과
EDTA Na2BioSharpBS108TAE 완충액 제조 시약
Electric thermostatic water bathSHANGHAI SUMSUNG LABORATORY INSTRUMENT CO.,LTDDKD8온도 조절 육성
Electrophoresis Apparatus TrophoresisLIUYIDYCP-31BN아가로스 겔 전기영동
Gel Imaging analysis systemShanghHai JiaPengZF-258겔 시각화 및 이미징
GenCRISPR SpCas9GenScriptZ03624-GMP-2.5게놈 편집용 Cas9 뉴클레아제
Genomic DNA extraction kitTIANGENYDP304게놈 DNA 분리
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis KitNEBE2040SsgRNA의 시험관 내 전사
MiniAmp ThermocyclerThermo Scientific A37834PCR 증폭
NanoDrop 2000c SpectrophotometerThermo Scientific 2000c핵산 정량
Nucleic acid stain (e.g., GeneRed)TIANGENRT211아가로스 겔에서 DNA 시각화
PCR Using Q5 Quick-Load High-Fidelity 2X Master MixNEBM0578고충실도 PCR 증폭
Primers (AF1, AF2, AF3, Tracr-R)GenScriptsgRNA 템플릿 조립용 올리고뉴클레오티드
Tris-baseBioSharpBS083TAE 완충액 제조 시약
VAHTS RNA Clean BeadsVAHTSN412-01RNA 정제
```

참고문헌

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