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방법 논문

관상동맥 우회 이식 환자의 관상동맥 내적출술 조직에서 단일 핵 분리

699 조회수

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DOI:

10.3791/70382

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2026년 4월 3일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Biotechnology, Gujarat Biotechnology University, 2U. N. Mehta Institute of Cardiology and Research Centre

이 논문에서

요약

관상동맥 내막 절제술 조직 샘플은 최적화된 해리 프로토콜을 사용하여 단일 핵을 분리하기 위해 처리되었습니다. 분리된 핵의 무결성은 세 가지 보완적 접근법을 통해 검증되었습니다: 막 무결성 평가를 위한 트리판 블루 배제 염색, 핵 형태를 확인하기 위한 DAPI 기반 공초점 현미경, 핵수율과 순도를 정량화하는 유세포 측정법.

초록

동맥경화증은 동맥벽에 플라크가 축적되는 만성적이고 진행성 염증 질환입니다. 플라크 형성이 진행되는 과정에서 특정 병변이 불안정해지는 고위험 플라크가 있으며, 심근경색(MI)을 유발할 가능성이 있습니다. 동맥경화성 플라크는 평활근 세포, 내피 세포, 면역 세포, 지방 세포, 괴사 세포로 구성되며, 이들 중 어느 것이든 플라크 파열을 일으킬 수 있습니다. 죽상동맥경화성 플라크 내 세포 이질성을 연구하는 것이 플라크 불안정성의 기전을 더 잘 이해하기 위해 매우 중요합니다. 우리는 관상동맥 우회 이식(CABG) 수술을 받는 환자들로부터 얻은 인간 관상동맥 내막 적출술 조직에서 핵을 분리하고 검증하기 위한 쉽게 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 모든 조직은 세포의 완전성을 보존하기 위해 로즈웰 파크 메모리얼 연구소(RPMI) 배지의 습한 얼음 위에 보관됩니다. 조직 샘플은 곱게 다진 후 미세공으로 부드럽게 분해되어 세포를 용해하고 핵을 방출합니다. 분리된 핵은 복합 역현미경에서 트리판 블루 배제 분석법을 사용해 무결성과 수율을 평가합니다. DAPI 염색은 공초점 현미경으로 온전한 핵을 시각화할 수 있게 하며, 유세포 측정은 형광 기반 정량을 통해 핵 분리 수율을 평가하고 핵 집단을 검증합니다. 단일 세포 해리를 통한 전통적인 분리 방법과 달리, 핵 분리는 세포 스트레스를 줄이고 천연 전사체 환경을 유지하여 유전자 발현 변화를 방지합니다. 이 방법으로 얻은 고품질 핵 준비물은 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)과 같은 후속 응용과 호환됩니다.

서론

죽상동맥경화성 심혈관 질환(ASCVD)은 전 세계에서 사망과 장애의 주요 원인이며, 주요 치료법 발전에도 불구하고 그 부담은 여전히 줄어들지 않았습니다1. 죽상동맥경화증은 동맥벽의 만성 염증성 질환으로, 다양한 세포 집단 간의 복잡하고 역동적인 상호작용에 의해 조용히 진행되는 초기 아임상 질환에서 삶을 바꾸는 심혈관계(CV) 사건으로 조용히 진행되는 것을 함께 조율합니다2.

중대형 동맥에서 대식세포 내에 콜레스테롤 침착물이 축적되는 것은 죽상동맥경화증3의 특징입니다. 죽상동맥경화성 플라크는 지방산, 콜레스테롤, 염증 세포, 칼슘, 피브린, 평활근 세포, 내피세포, 그리고 후피하 내 세포 잔해로 구성되어 있습니다. 죽상경화성 플라크는 저위험과 고위험 두 가지 유형으로 분류됩니다. 고위험 플라크는 일반적으로 플라크 침식이나 파열5와 같은 메커니즘을 통해 이후 심혈관 사건을 유발하는 경향으로 식별됩니다.

고위험 플라크의 특징으로는 큰 지질 코어, 여러 염증 세포, 적은 평활근 세포, 얇은 섬유성 캡, 미세석회화, 플라크 내 출혈, 신생 혈관, 괴사성 코어6이 포함됩니다. 고위험 플라크의 검출은 관상동맥 컴퓨터 단층촬영 혈관조영술(CCTA)과 광학 일관성 단층촬영(OCT)이라는 비침습적 영상 기법을 사용하여 임상적으로 수행됩니다 7,8. 심혈관 영상 기술의 수많은 발전에도 불구하고, 심근경색(MI)을 유발하는 죽상경화성 플라크의 파열 예측은 여전히 어렵으며,임상 환경에서는 항상 유용하지도 않습니다.

수십 년간의 연구에도 불구하고, 우리는 여전히 고위험 플라크 표현형을 구체적으로 식별할 수 있는 신뢰할 수 있는 순환 바이오마커가 부족해 동맥경화증 임상 관리에 심각한 공백이 생겼습니다. 이는 이러한 플라크를 보다 근본적인 생물학적 수준에서 특성화할 수 있는 분자 전략의 필요성을 강조합니다 7,10. 이 맥락에서 RNA 기반 마커는 플라크 미세환경 내에서 일어나는 복잡한 전사 활동을 포착할 수 있어 상당한 주목을 받고 있습니다. 최근 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)의 발전은 특히 강력하게 작용하여, 죽상동맥경화성 플라크 내 개별 세포를 프로파일링하고, 플라크 취약성을 뒷받침하는 독특한 세포 집단, 유전자 발현 패턴, 분자 경로를 밝혀내는 전례 없는 해상도를 제공했습니다12,13. 이러한 발전에도 불구하고, 죽상경화증 발달에 관여하는 다양한 세포 유형의 조절 과정, 상호작용, 기능적 중요성에 대한 지식은 거의 없습니다14.

동맥경화성 부담이 심하고 확산될 때는 외과적 혈관 재생이 결정적인 치료 전략이 됩니다. 관상동맥 내막 절제술(CE)은 관상동맥 우회 이식(CABG) 수술의 보조 수술로, 확산된 관상동맥에서 동맥경화성 플라크를 기계적으로 제거하여 우회 이식을 가능하게 하고 완전한 심근 재혈관화를 달성하는 수술입니다15,16. 죽상경화성 플라크와 동맥내막 절제 표본은 괴사 조직, 지질 침전물, 섬유균, 석회화 물질이 풍부하기 때문에 특히 다루기 어렵습니다. 이 조직들이 분석을 위해 분해될 때, 상당한 이물질이 발생하여 필터와 마이크로유체 시스템을 막아, 생존 가능한 단일 세포 분리가매우 어려워집니다. 실제로 한 경동맥 플라크 연구에서는 조직 처리 후 생존 가능한 세포가 전체 입자의 1% 미만을 차지하는 것으로 나타났습니다. 나머지는 단순히 플라크 파편18번이었습니다.

이 문제를 더욱 악화시키는 것은 죽상경화성 플라크가 만성 대사 및 산화 스트레스 상태에 있다는 점입니다. 세포가 세포자멸사, 노화 및 기타 퇴행성 과정을 겪으면 세포막이 점점 더 취약해지고 손상되기 쉽고, 생존 가능한 단일 세포의 분리가 매우 어렵습니다 18,19,20. scRNA-seq를 위해 샘플을 준비하는 데 필요한 기계적 및 효소적 소화는 이미 손상된 세포들을 손상시켜 생존력을 더욱 저하시키고 세포 포획률이 저하됩니다. 이 과정은 또한 취약하거나 희귀한 세포 집단을 선택적으로 손실하는 경향이 있어, 전사체 데이터와 최종 결과에 나타난 세포 유형 모두에 상당한 편향을 초래합니다. 이 문제는 석회화되거나 심하게 병든 플라크에서 더욱 두드러지는데, 조직을 분해하는 데 필요한 혹독한 처리 조건이 세포 생존력에 추가적인 손상을 초래합니다 18,21,22.

반면, 핵은 이러한 불리한 조건에서도 구조적으로 온전하게 유지된다23. 이는 주로 핵 외피(핵 외피)에 기인하며, 핵 라민(라민 A/C 및 라민 B)에 의해 강화된 이중 지질 이중층으로, 원형질막을 쉽게 파괴하는 삼투압, 효소, 물리적 응력에 대한 기계적 강성과 저항성을 제공합니다24,25. 핵층은 주변 세포질이 심각하게 손상되어도 핵 형태를 보존합니다26. 이로 인해 단일 핵 RNA 시퀀싱(snRNA-seq)은 죽상동맥경화 조직 프로파일링을 위한 단일 세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)보다 더 실용적이고 신뢰할 수 있는 대안이 되었습니다. 전체 세포가 아닌 온전한 핵에서 전사 정보를 포착함으로써, snRNA-seq는 낮은 세포 생존력과 높은 이물질 함량으로 인한 한계를 우회하여 플라크 미세환경의 보다 정확하고 포괄적인 전사체 프로파일링을 가능하게 합니다18.

따라서 본 연구에서는 관상동맥 내막 절제술 조직을 위해 특별히 개발된 최적화된 핵 분리 프로토콜을 제시하는데, 이 프로토콜은 비이온 세제 기반 용해와 조직 석회화 정도에 따라 경험적으로 조정된 용해 기간을 포함하여 구조 및 RNA 완전성을 보존한 고품질 핵을 지속적으로 생산하여 snRNA-seq 분석에 적합하도록 합니다.

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프로토콜

본 연구는 유엔 메타 심장학 연구소 인간윤리위원회(EC/Approval/26/Cardio/14/12/2024)와 구자라트 생명공학대학교(GBU_IHEC/2023/006)의 승인 및 지침에 따라 수행되었습니다. 샘플 채취 전에 모든 참가자로부터 사전 동의를 받았습니다. 관상동맥 우회 수술과 관상동맥 내막 절제술을 받는 환자들이 본 연구의 대상이 되었습니다. 수술적 제거 후 동맥내막 절제 조직은 즉시 혈청 무첨가 RPMI 배지에 넣어 4°C로 유지한 후 약 12시간 이내에 냉동보관 상태로 실험실로 운반되었습니다. 다음 프로토콜에서 사용되는 모든 재료에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 핵 분리

참고: 모든 과정을 얼음 위에서 수행하시고 멸균 재료를 사용하세요. 모든 버퍼를 새로 준비하세요.

  1. 혈청이 없는 RPMI 배지로 조직을 한두 번 세척하여 혈흔과 파편을 제거하세요. 멸균 겸자를 사용해 조직을 멸균 배양 접시에 옮기고 무게를 기록합니다.
  2. 수술용 칼날(10번 칼)을 사용해 조직을 약 1 mm3 크기의 작은 조각으로 잘게 썬다.
  3. 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2(각 성분당 1M 스톡 용액 사용), 0.1% (v/v) Nonidet P-40을 뉴클레아제 무첨가물에 혼합하여 1mL 용해 완충액을 준비합니다. 성분을 다음 순서대로 첨가하세요: 뉴클레아제 프리 워터를 먼저 넣고, 그 다음에 Tris-HCl, NaCl, MgCl₂, NP-40을 마지막으로 넣어 거품을 방지합니다.
    참고: 용해 완충제는 사용 당일에 신선하게 준비해야 하며, 항상 얼음 위에 차갑게 보관해야 합니다. 얼지 마세요.
  4. 5mL 마이크로 원심분리관 안에 1mL 용해 완충제를 조직에 추가하세요.
  5. 미세공을 사용해 부드럽고 일정한 힘을 가해 조직을 녹여내고, 미세공을 시계 방향과 반시계 방향으로 번갈아 돌립니다. 약 30분간 해해를 계속하면서 샘플이 차갑게 유지되도록 하세요.
    참고: 조직이 탁할 때까지 용해하세요. 1000 μL 팁을 사용해 피펫으로 부드럽게 섞으세요.
  6. 100 μm 기공 크기 체를 사용해 15mL 원심분리관에 용액을 여과하여 이물질과 조직 덩어리를 제거합니다.
    참고: 여과액은 체에 눈에 띄는 이물질이 남아 있어 덜 탁해 보여야 합니다.
  7. 스윙잉 버킷 로터를 사용해 500 x g 압력에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
    참고: 튜브 바닥에 보이는 펠릿이 형성되어야 합니다.
  8. 일반 피펫 팁으로 상정액을 제거하면, 펠릿을 방해하지 마세요.
  9. 1% 소 혈청 알부민(BSA)(10% 스톡 용액 사용), 0.2 U/μL RNase 억제제(20 U/μL 스톡 용액 사용)를 1X Dulbecco's 인산 완충 식염수(DPBS)에 혼합하여 핵 세척 및 재현탁 완충제를 준비합니다. 구성 요소를 다음 순서대로 추가하세요: DPBS부터 시작하고, 그 다음 BSA, 마지막으로 RNase 억제제를 넣습니다.
    참고: 버퍼는 사용 당일에 신선하게 준비하고 항상 얼음 위에 차갑게 보관해야 합니다. 얼지 마세요.
  10. 핵 세척과 부유액 완충기에 펠릿을 재현탁하세요. 사용하기 전에 버퍼를 얼음에 올려 차갑게 하세요.
  11. 5 μL 트리판 블루로 염색하고 혈구세포계에서 계수하여 용해 효율과 세포 생존성을 평가합니다.
    참고: 생존 가능한 세포가 여전히 존재한다면, 500 x g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 3-10 구간을 반복합니다.
  12. 30 μm 구멍 크기의 체를 사용해 15mL 원심분리관에 용액을 여과하여 이물질과 덩어리를 제거합니다.
  13. 스윙잉 버킷 로터를 사용해 500 x g 압력에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
  14. 일반 피펫 팁을 사용해 상청액을 제거한 후, 펠릿을 1mL의 핵 세척액과 재현탁 완충제에 재현탁합니다.

2. 고립된 핵의 특성 분석

  1. 핵의 완전성 평가를 위한 트리판 블루 염색.
    1. 1.5 mL 마이크로 원심분리관에 분리된 핵 현탁액 15 μL을 투여합니다.
    2. 트리판 블루 염료 5μL(0.4% w/v)을 추가하고 피펫으로 부드럽게 섞습니다.
    3. 적절한 염색을 위해 실온에서 5분간 배양하세요.
    4. 염색된 혼합물 10 μL을 혈구계에 적재합니다.
    5. 복합 역현미경으로 형태를 관찰하고 핵 수를 세어보세요.
  2. 단일 핵 현탁의 유동 세포분석
    1. 분리된 핵 현탁액 1mL를 추출한 후 스윙 버킷 로터를 사용해 500 x g 온도에서 4 °C 온도에서 5분간 원심분리합니다.
    2. 일반 피펫 팁을 사용해 상원액을 제거하고, 200 μL FACS 버퍼(1X PBS 및 1% BSA)에 재현탁합니다.
    3. 재현탁된 핵 200 μL을 두 가지 분할로 나누어 100 μL을 염색되지 않은 대조군으로, 100 μL을 염색된 샘플로 사용합니다.
    4. 염색된 샘플에 1 μL 4', 6-디아미디노-2-페닐린돌(DAPI)(1 mg/mL 스톡)을 첨가하여 최종 농도는 10 μg/mL로 만듭니다. 부드럽게 혼합한 후 실온에서 어두운 환경에서 5분간 배양한 후 유세포 분석 절차를 진행하세요.
    5. 이 연구에 사용된 유세포계에서는 405nm의 보라색 레이저를 사용하고, 448/45nm로 검출합니다. 먼저 염색되지 않은 대조군 샘플을 실행하여 전체 모집단에서 최소 10,000건의 사건을 수집하세요.
    6. 전압을 순방향 산란(FSC)은 183 V, 측면 산란(SSC)은 300 V, V450(DAPI 레이저)은 400 V로 설정합니다. FSC의 임계값을 10,000으로 설정하세요.
      참고: 모든 계측기 전압과 게인 설정은 샘플 전반에 걸쳐 일정하게 유지되어 일관성을 유지합니다.
    7. 전방 산란 면적(FSC-A)과 전방 산란 높이(FSC-H)를 그래프로 표시하여 싱글렛과 더블릿 및 집합체를 구분합니다. 선형 관계를 보이는 사건들 주위에 게이트를 그려 싱글렛 핵만 유지한다.
    8. FSC-A와 측면 산란 면적(SSC-A)의 이변량 플롯을 생성합니다. 전체 산란 집단을 포함하는 넓은 게이트를 적용하세요. 고립된 핵은 일반적으로 뚜렷한 하위 집단 없이 이질적인 산란 프로필을 보입니다.
    9. SSC-A와 보라색 450 nm 면적(V450-A)의 2D 밀도(의사 색상) 플롯을 만듭니다. 염색되지 않은 대조군을 사용해 배경 형광을 정의하고 정확한 게이트 배치를 안내합니다. 완전한 핵에 해당하는 독특한 DAPI⁺ 집단을 식별하고 게이트합니다.
      참고: 단일 플루오로크롬(DAPI)을 사용하기 때문에 형광 보상은 필요하지 않습니다.
  3. 공초점 현미경을 이용한 분리된 핵 이미징
    1. 염색된 샘플에 50 μL 핵 현탁액을 1 μL DAPI(1 mg/mL)를 첨가하여 최종 농도가 10 μg/mL로 만들고, 부드럽게 혼합한 후 공초점 영상 촬영 전에 실온에서 5분간 어두운 환경에서 배양합니다.
    2. 5μL 염색된 핵 현탁액을 깨끗한 유리 슬라이드에 장착하고 커버슬립으로 덮습니다.
      참고: 핵 형태를 보존하기 위해 고정을 피하세요.
    3. 거꾸로 공초점 현미경을 사용해 핵을 시각화하세요. 공초점 현미경 소프트웨어를 열고 먼저 10배 밝은 시야에서 관찰한 후 40배 밝은 시야로 전환하세요.
    4. 스펙트럼 검출기와 대물렌즈 PLAN APO λD 40X (NA 0.95, RI 1.0)가 장착된 레이저 주사 공초점 현미경을 사용하여 공초점 이미지를 획득하세요. 405nm 레이저를 이용해 DAPI를 여기시키고 429-474nm 사이의 방출을 수집합니다.
    5. 영상 검사 결과는 다음과 같다:
      1. 검출기 모드: 다중 채널(GaAsP)
      2. 스캐너: 갈바노 단방향
      3. 스캔 모드: 밴드
      4. 라인 평균: 2배
      5. 해상도: 1024 × 1024 픽셀
      6. 거주 시간: 2.0 μs
      7. 핀홀 크기: 47.7 μm
      8. 레이저 출력: 0.1-9.3% (자기장 세기에 따라 다름)
      9. 검출기 이득: 37.8-45.9%
      10. 줌: 1.0X
      11. 보정: 0.43-0.58 μm/픽셀
    6. 동일한 광학 구성에서 AX 카메라를 최소한의 크로스토크 모드로 모든 이미지를 획득하면, 이미징 중 완벽한 초점 시스템(PFS)이 활성화되어 z-평면 안정성을 유지해야 합니다.

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결과

인간 관상동맥 내막 절제 조직은 CABG 수술을 받는 환자들로부터 채취되었습니다. 조직은 핵 분리를 위해 무게 측정 및 처리되었으며, 추가 분리된 핵은 유세포 측정과 공초점 현미경으로 확인되었습니다(그림 1).

트리판 블루의 핵 분리 품질 평가
RPMI 배지에 보관된 조직은 무게를 재고 247.8 mg으로 측정되었습니다. 조직은 다진 후 핵 분리를 위해 미세절점을 사용해 용해 완충제에서 균질화되었습니다(그림 2A-C). 핵 분리와 트리판 블루 염색 후, 우리는 온전한 생존 세포가 없는 독특한 핵 집단을 관찰하여 효과적인 조직 용해를 확인했습니다. 분리된 핵은 현미경 아래에서 조밀하고 둥근 짙은 파란색 물체로 나타나 성공적인 핵 분리를 나타냈다. 또한 현탁액에는 약 4,033개의 ...

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토론

인간 관상동맥 내막 절제 조직에서 핵을 분리하기 위한 최적화된 워크플로우는 현재 프로토콜에 설명되어 있습니다. 여기서 설명한 핵 격리 프로토콜은 진행된 관상동맥 동맥경화성 플라크에서 생존 가능하고 온전한 세포를 얻는 데 있어 중요한 한계를 극복하기 위해 특별히 설계되었습니다. 기존의 scRNA-seq 접근법이 강력한 효소 소화와 기계적 해리에 의존하는 것과 달리, 저희 최적화된 프로토콜은 비이온 세제 함유 용해 버퍼(Nonidet P-40)에서 부드러운 기계적 균질화를 사용하여 핵의 구조적 무결성을 유지하면서 핵을 선택적으로 해방합니다31. 이 접근법은 관상동맥 조직 분석에 여러 가지 주요 장점을 제공합니다. 첫째, 비이온 세제는 핵 외피를 유지하면서 세포막을 효율적으로 파괴하여, 핵을 세포질 성분, 지질 방울, 세포외 잔...

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공개 사항

저자들은 이해 상충을 공개할 필요가 없습니다.

감사의 글

이 연구는 인도 의학 연구 위원회(ICMR)(EM/Dev/SG/34/01106/2024)와 아메다바드 U. N. 메타 심장학 및 연구센터의 협력으로 지원받았습니다. 쿠시 자니는 인도 정부 대학 보조금 위원회(UGC)와 과학산업연구위원회(CSIR)가 공동 CSIR-UGC NET 자격증(NTA 참조 번호: 241620143543)을 수여해 준 것을 인정합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
100 & mu; M 스트레이너밀텐이 바이오텍  130-098-463
30 & mu; M 스트레이너밀텐이 바이오텍  130-098-458
소 혈청 알부민하이미디어TC546-25G
원심분리기MPWNAhttps://mpw.pl/en/offer/mpw-352r
복합 현미경니콘NA 니콘 이클립스 Ts2 역현미경 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ts2)
공초점 현미경  니콘NA니콘 Ti2-E 역방향 공초점 현미경 (https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_AOM/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series)
커버슬립하이미디어BG011C
CRYOCHIL 와이드 마우스 샘플 바이알타손 가족883191
다피시그마D9542-5MG
DPBS깁코 (서모피셔)10010-023
원심분리관 (15 mL)타손 가족546021
유세포계 및 nbsp;BD 생명과학663029BD FACSLyric (3L12C 계기 CEIVD)
혈구계악시비오CCB 100
마이크로 원심분리기 튜브 (1.5 mL)타손 가족500010C
마이크로 원심분리기 튜브 (5 mL)타손 가족500050
MgCl2시그마M1028-100ML
마이크로 공약타손 가족160020
나클시그마S9888-500G
NP-40하이미디어MB143-100ML
뉴클레아제 없는 물깁코 (서모피셔)W4502-1L
RNase 억제제시그마333540201
RPMI 1640깁코 (서모피셔)11875093
슬라이드 리비에라72910135
트리스-HCl시그마T2194-100ML
트리판 블루와 nbsp;시그마302643-25G

참고문헌

  1. Roth, G. A., et al. Global burden of cardiovascular diseases and risk factors- 1990-2019. J. Am. Coll. Cardiol. 76 (25), 2982-3021 (2020).
  2. de Winther, M. P. J., et al. Translational opportunities of single-cell biology in atherosclerosis. Eur. Heart J. 44 (14), 1216-1230 (2023).
  3. Mohebbati, R., Momeni-Moghaddam, M. A. The role of red blood cells in cholesterol accumulation and atherosclerotic plaque instability: a perspective on atherosclerosis. Curr. Cardiol. Rev. 21 (5), (2025).
  4. Ajoolabady, A., et al. Inflammation in atherosclerosis: pathophysiology and mechanisms. Cell Death Dis. 15 (11), 817(2024).
  5. Dawson, L. P., Layland, J. High-risk coronary plaque features: a narrative review. Cardiol. Ther. 11 (3), 319-335 (2022).
  6. Tong, W., et al. Highly sensitive magnetic particle imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with active myeloperoxidase-targeted nanoparticles. Theranostics. 12 (17), 7641-7641 (2022).
  7. Lu, G., et al. Coronary computed tomography angiography assessment of high-risk plaques in predicting acute coronary syndrome. Front. Cardiovasc. Med. 8, (2021).
  8. Kinoshita, D., et al. High-risk plaques on coronary computed tomography angiography. JACC Cardiovasc. Imaging. 17 (4), 382-391 (2024).
  9. Canu, M., et al. Non-invasive multimodality imaging of coronary vulnerable patient. Front. Cardiovasc. Med. 9, (2022).
  10. Liu, X., et al. Assessment of coronary computed tomography angiography-derived plaque features in the diagnosis of optical coherence tomography-defined vulnerable plaques. Quant. Imaging Med. Surg. 15 (3), 2029-2041 (2025).
  11. Chiorescu, R. M., et al. Vulnerable atherosclerotic plaque: is there a molecular signature. Int. J. Mol. Sci. 23 (21), 13638(2022).
  12. The applications of single-cell RNA sequencing in atherosclerotic disease. Front. Cardiovasc. Med. Slenders, L., Tessels, D. E., van der Laan, S. W., Pasterkamp, G., Mokry, M. 9, (2022).
  13. Adam, C. A., et al. Novel biomarkers of atherosclerotic vascular disease-latest insights in the research field. Int. J. Mol. Sci. 23 (9), 4998(2022).
  14. Ye, W., Chen, Z., Xia, Z., Li, D. Single-cell RNA sequencing in human atherosclerotic plaques reveals a novel smooth muscle cell subtype that possesses multi differentiation potential and shapes the microenvironment. Clin. Exp. Med. 25 (1), 251(2025).
  15. Kelly, J. J., et al. Coronary endarterectomy: analysis of the society of thoracic surgeons adult cardiac surgery database. Ann. Thorac. Surg. 114 (3), 667-674 (2022).
  16. Ghatanatti, R. Coronary endarterectomy: recent trends. J. Clin. DIAGNOSTIC Res. , (2017).
  17. Li, Y., et al. Single-cell transcriptome analysis reveals dynamic cell populations and differential gene expression patterns in control and aneurysmal human aortic tissue. Circulation. 142 (14), 1374-1388 (2020).
  18. Alsaigh, T., Evans, D., Frankel, D., Torkamani, A. Decoding the transcriptome of calcified atherosclerotic plaque at single-cell resolution. Commun. Biol. 5 (1), 1084(2022).
  19. Iqbal, F., Lupieri, A., Aikawa, M., Aikawa, E. Harnessing single-cell RNA sequencing to better understand how diseased cells behave the way they do in cardiovascular disease. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 41 (2), 585-600 (2021).
  20. Ahmad, H., et al. Single cell RNA sequencing of haematopoietic cells in fresh and frozen human atheroma tissue. Cardiovasc. Res. 121 (3), 396-404 (2025).
  21. Depuydt, M. A. C., et al. Microanatomy of the human atherosclerotic plaque by single-cell transcriptomics. Circ. Res. 127 (11), 1437-1455 (2020).
  22. Williams, J. W., et al. Single cell RNA sequencing in atherosclerosis research. Circ. Res. 126 (9), 1112-1126 (2020).
  23. Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues. J. Pathol. Transl. Med. 57 (1), 52-59 (2023).
  24. Gruenbaum, Y., Foisner, R. Lamins: Nuclear intermediate filament proteins with fundamental functions in nuclear mechanics and genome regulation. Annu. Rev. Biochem. 84 (1), 131-164 (2015).
  25. Zwerger, M., Ho, C. Y., Lammerding, J. Nuclear mechanics in disease. Annu. Rev. Biomed. Eng. 13 (1), 397-428 (2011).
  26. Dechat, T., et al. Nuclear lamins: major factors in the structural organization and function of the nucleus and chromatin. Genes Dev. 22 (7), 832-853 (2008).
  27. Oh, J. -M., et al. Comparison of cell type distribution between single-cell and single-nucleus RNA sequencing: enrichment of adherent cell types in single-nucleus RNA sequencing. Exp. Mol. Med. 54 (12), 2128-2134 (2022).
  28. Nott, A., Schlachetzki, J. C. M., Fixsen, B. R., Glass, C. K. Nuclei isolation of multiple brain cell types for omics interrogation. Nat. Protoc. 16 (3), 1629-1646 (2021).
  29. Gulko, A., et al. Protocol for flow cytometry-assisted single-nucleus RNA sequencing of human and mouse adipose tissue with sample multiplexing. STAR Protoc. 5 (1), 102893(2024).
  30. Fernandez, D. M., et al. Single-cell immune landscape of human atherosclerotic plaques. Nat. Med. 25 (10), 1576-1588 (2019).
  31. Galvis, A. E., Fisher, H., Camerini, D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (20), (2017).
  32. Wirka, R. C., et al. Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis. Nat. Med. 25 (8), 1280-1289 (2019).
  33. Pan, H., et al. Single-cell genomics reveals a novel cell state during smooth muscle cell phenotypic switching and potential therapeutic targets for atherosclerosis in mouse and human. Circulation. 142 (21), 2060-2075 (2020).
  34. Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).
  35. Litviňuková, M., et al. Cells of the adult human heart. Nature. 588 (7838), 466-472 (2020).
  36. Hu, P., et al. Single-nucleus transcriptomic survey of cell diversity and functional maturation in postnatal mammalian hearts. Genes Dev. 32 (19-20), 1344-1357 (2018).
  37. Rani, U., et al. Evaluation of use of RPMI Medium to preserve cell morphology for pleural/peritoneal fluid cytology. J. Cytol. 39 (1), 26-29 (2022).
  38. Machado, L., Relaix, F., Mourikis, P. Stress relief: emerging methods to mitigate dissociation-induced artefacts. Trends Cell Biol. 31 (11), 888-897 (2021).
  39. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat. Med. 26 (5), 792-802 (2020).
  40. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nat. Protoc. 11 (3), 499-524 (2016).

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