만성 폐쇄성 폐질환에서 부티 화탄 탕의 통합 다체학적 분석

요약

만성 폐쇄성 폐질환에서 부티 화탄 탕(BTHTT)의 다중 오믹스 프로파일링은 IL-1R2/IL-1β-갑상선 호르몬 대사 축을 조절할 수 있는 잠재력을 밝혀냈습니다. 이 연구는 BTHTT의 생리활성 성분에 대한 추가 기전적 검증을 위한 틀을 제공하며, 이 축을 확인하기 위한 향후 인과 개입 연구의 기초를 마련합니다.

초록

본 연구는 다중 체학 및 계산생물학 틀을 활용하여 전통 중의학(TCM) 포뮬러 부티화탄탕(BTHTT)의 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 치료 잠재력을 조사하였습니다. BTHTT 개입 후 쥐 모델에서 유의미한 생리학적 개선이 관찰되었습니다. 조직학적 분석 결과 폐 병리학적 손상이 역전되었고, 생화학적 검사와 전사체학 결과 IL-1β 와 IL-1R2 수치가 정상화됨이 확인되었습니다. 또한 대사 프로파일링 결과 BTHTT가 T3 및 T4 갑상선 호르몬 수치의 교란을 교정하는 것으로 나타났습니다. IL-1β/IL-1R2 축과 이 갑상선 호르몬 사이에 음의 상관관계가 관찰되어 이들의 조절이 이 조제액의 치료 효과와 연관됨을 시사합니다. 직접 측정 외에도, 머신러닝 알고리즘은 임상 데이터베이스에서 10개의 COPD 서명 유전자를 식별했습니다. 경로 풍부 분석은 BTHTT가 사이토카인-사이토카인-수용체 상호작용과 갑상선 호르몬 합성 경로를 통해 작용할 수 있음을 시사합니다. 또한, 283개의 성분이 생 체 내에서 확인되었지만, 탄시논 IIA와 크립토탄시논과 같은 화합물은 현재 후보 활성 물질로 간주됩니다. 이들이 주요 구동체로서의 역할을 하는 것은 IL-1R2에 안정적으로 결합하는 모델에 의해 뒷받침됩니다; 이 추론은 직접적인 실험적 격리보다는 분자 도킹 및 분자 동역학(MD) 시뮬레이션에 기반합니다. 전반적으로 데이터는 BTHTT가 염증과 대사 항상성을 조절하여 COPD에 다중 표적 효과를 발휘한다는 모델을 지지합니다. 이 통합 접근법은 BTHTT의 임상 적용을 위한 정교한 과학적 기반을 제공하며, 향후 실험적 검증을 위한 구체적인 경로를 강조합니다.

서론

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 임상 실무에서 가장 흔한 호흡기 질환 중 하나로, 매우 높은 장애율과 반복되는 급성 악화로 인해 전 세계에서 세 번째로 많은 사망 원인이 되었습니다^. COPD는 인구 내 노동력 감소와 가족 돌봄비 급증을 초래한 중요한 요인이었으며, 사회적·경제적 손실은 대부분의 만성 질환보다 훨씬^컸다. "건강한 중국 이니셔티브 2030"에서 COPD는 예방 및 치료가 필요한 주요 질병으로 지정되었습니다. COPD의 기전이 불완전했기 때문에, 기관지 확장제와 코르티코스테로이드의 병용 사용이 주요 치료로 남아 있었습니다. 이 접근법은 비교적 명확한 증상 완화를 제공했지만, 폐 기능의 점진적 저하를 막을 수는 없습니다. 더욱이, 코르티코스테로이드의 장기 사용은 부작용 발생률을 불가피하게 증가시켜 약물의 장기적 효능과 환자의 내성에 영향을 미칩니다^. 연구에 따르면 삼중 요법을 받았음에도 불구하고 환자의 28%에서 31%는 여전히 급성 악화 또는 증상 악화를 경험합니다. 따라서 효과적인 COPD 약물 개발은 현재 COPD^연구에서 핵심이자 주요 쟁점으로 남아 있습니다.

이러한 요구를 충족하기 위해 부티화탄탕(BTHTT), 성매음, 부비탕과 같은 고전적인 중의학 공식들이 개발되었습니다. 그중 BTHTT는 폐를 긴장시키고 에너지를 증진하며 가래를 해소하여 기침 ^5,6,7,8을 완화하는 데 있어 특히 주목할 만했습니다. BTHTT는 뛰어난 효능과 최소한의 부작용뿐만 아니라 폐 기능의 점진적 저하를 되돌릴 수 있는 잠재력으로도 COPD 임상 치료에 널리 사용되었습니다. 임상 및 사회적 맥락에서 큰 가능성을 지니고 있었으며, 과학적·경제적 가치가 높은 주요 약물로서 '2차 개발' 가능성이 있었다 9,10,11,12. 그러나 체계적이고 장기적인 과학 연구가 부족해 BTHTT에 대한 연구는 대체로 그 구성 요소 기반에 대한 불명확한 이해와 핵심 행동 목표가 확인되지 않은 문제로 어려움을 겪고 있습니다. 근본적으로, 이는 BTHTT의 주요 기전과 잠재적 치료 물질 기초에 대한 연구가 상당한 부족함 때문이었습니다.

이러한 특성에 대응하여, 대사체학, 전사체학 등 여러 옴믹스 기술과 다중 알고리즘 마이닝 방법을 통합하여 특성 핵심 유전자와 신체 미^{세 환경 내} 주요 대사 경로 간의 주요 상관관계에 집중함으로써 치료의 본질을 탐구^{할 뿐만 아니라} 활성 성분들의 시너지 효과도 평가할 수 있습니다. 특히 갑상선 호르몬 축에 초점이 맞춰져 있는데, 최근 연구들은 갑상선 기능 장애가 COPD에서 흔히 동반되는 동반 질환이며, 종종 전신 염증 증가와 호흡 근육 기능 장애와 상관관계가 있음을 보여줍니다. 이 축을 조절하는 것은 폐질환에서 대사 항상성을 회복하는 새로운 경로일 수 있습니다^16,17.

요약하자면, 이 연구는 증후군과 공식 대응 전제에 기반한 다중 오믹스 통합과 계산생물학을 결합한 삼자 접근법을 채택했습니다. 한편으로는 TCM 혈청 약리화학 기법을 활용하여 효과적인 조건에서 BTHTT의 혈액 매개 성분을 규명하였습니다. 반면, COPD의 주요 특징 유전자에 초점을 맞추어 포괄적인 조직 대사체학을 사용하여 내인성 소분자에서 질병 바이오마커를 발견하고 공식의 전반적인 효과를 정밀히 평가했습니다. 한편, 다중 알고리즘 마이닝 및 전사체 식별 분석과 결합하여 효과적인 조건에서 BTHTT가 조절하는 주요 특징 유전자를 확인하고, 주요 특성 유전자와 주요 대사 경로 간의 상관관계 분석을 수행하였습니다. 잠재적 치료제의 기초는 분자 도킹과 분자 역학 분석을 통해 선별되었습니다.

우리의 다중 오믹스 프레임워크와 BTHTT의 약리학적 프로필을 바탕으로, 본 연구는 다음과 같은 검증 가능한 예측을 제안합니다. 항염증 조절: BTHTT 개입은 특히 IL-1β/IL-1R2 발현축을 정상화하여 조직 손상을 완화함으로써 전신 및 폐 염증 지표를 유의미하게 감소시킵니다. 대사 회복: BTHTT는 갑상선 호르몬 합성 경로의 신호를 변화시켜 T3/T4 수치를 측정 가능한 교정시키고 폐 미세환경의 대사 상태를 개선합니다. 대사 회복: BTHTT는 갑상선 호르몬 합성 경로의 신호를 변화시켜 T3/T4 수치를 측정 가능한 교정시키고 폐 미세환경의 대사 상태를 개선합니다.

프로토콜

참고: 이 연구에 사용된 시약과 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

임상 데이터 수집 및 전처리

COPD의 분자 신호를 조사하기 위해 유전자 발현 옴니버스(GEO) 데이터베이스에서 전사체 데이터셋을 검색하였습니다. 총 다섯 개의 데이터셋이 선정되었습니다: GSE11784, GSE12472, GSE16972, GSE38974, GSE222965. 원시 데이터와 플랫폼 주석 파일은 프로브-유전자 매핑을 위해 다운로드되었습니다. 여러 프로브가 단일 유전자를 표적으로 했을 때 최대 발현 값이 유지되었습니다. 결과적으로 생성된 유전자 발현 행렬(행은 유전자, 열은 샘플)은 단일 발견 데이터셋으로 통합되었습니다. 다양한 마이크로어레이 플랫폼과 연구 코호트에 따른 기술적 차이를 고려하기 위해, sva R 패키지의 ComBat 알고리즘을 사용하여 배치 효과 보정이 수행되었습니다. 보정의 효능은 주성분분석(PCA) 플롯을 통해 검증되었습니다. 배치 보정 이후, 병합된 발견 데이터셋이 차분 분석에 활용되었습니다. COPD 환자와 건강한 대조군 간의 차별발현 유전자(DEG)를 limma 패키지를 사용하여 확인하였습니다. 유의성 임계값은 |logFC| ≥ 1과 p ≤ 0.05.

가장 견고한 특성 유전자를 식별하기 위해 세 가지 독립적인 머신러닝 알고리즘이 통합되었습니다. 모델의 신뢰성을 보장하고 데이터 유출을 방지하기 위해, 특징 선택 과정은 해당 경우 교차 검증 루프 내에 중첩되었고, 발견 데이터셋은 독립 검증 세트와 엄격히 분리되었습니다. GLMNET 패키지를 사용하여 DEG에 LASSO 모델을 적용했습니다. 우리는 최적의 페널티 매개변수를 결정하기 위해 10배 교차 검증을 사용했습니다. 최소 교차 검증 오류에 해당하는 최적 페널티 매개변수 값이 핵심 특징 유전자를 식별하는 임계값으로 선택되었습니다. SVM은 유전자의 식별력을 기준으로 순위를 매기는 데 사용되었습니다. 최소 일반화 오차의 지점을 식별하기 위해 10배 교차 검증 전략이 구현되어 특징 유전자의 최적 수를 결정하였습니다. randomForest 패키지는 DEG의 평균 감소 정확도와 지니 지수를 기준으로 순위를 매기는 데 사용되었습니다. 가장 높은 중요도 점수를 가진 유전자가 질병 관련 특징으로 선정되었습니다.

LASSO, SVM, randomForest가 식별한 특징들의 교차점을 최종 핵심 특성 유전자를 정의하는 데 사용되었습니다. 이 유전자들의 진단 성능은 수신자 작동 특성(ROC) 곡선 분석을 통해 평가되었습니다. 곡선 아래 면적(AUC)과 관련된 95% 신뢰구간(CI)은 pROC 패키지를 사용하여 계산되었습니다. AUC가 0.70> 유전자가 진단 가치가 높다고 판단되었습니다. 마지막으로, 이 유전자들의 발현 수준과 진단 정확도는 독립적인 검증 세트에서 추가로 검증되어 발견의 일반화 가능성을 보장하였습니다.

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)과 drugbank(https://go.drugbank.com/)를 사용하여 LABAS, LAMA, SABA, SAMA, Fluticasone propionate, Budesonide, Beclomethasone, Fluticasone, Salmetol, Umeclidinium, Vilanterol, Theophylline 등 총 12가지 특정 약물 프로필을 얻었습니다. 컴파일된 표적들은 Uniprot 데이터베이스(https://www.uniprot.org/)를 사용하여 보정되었으며, 이 과정에서 비인간 유전자를 제거하고 중복된 표적은 삭제하여 표준화된 유전자 이름을 얻었습니다. GeneCards(https://www.genecards.org/), OMIM(https://www.omim.org/), DisGENET(https://www.disgenet.org/) 데이터베이스에 "chronic obstructive pulmonary disease", "COPD"라는 키워드를 입력함으로써 질병 관련 표적을 검색할 수 있었습니다. 세 데이터베이스의 모든 표적은 엑셀 파일에 통합되었고, 중복된 유전자는 제거되었으며, Uniprot 데이터베이스를 사용해 최종 질병 표적 유전자 정보를 얻기 위해 데이터를 보정했습니다.

머신러닝 모델 개발

다중 알고리즘 머신러닝 프레임워크는 glmnet, e1071, randomForest R 패키지를 순차적으로 활용하여 구축되었습니다. 구체적으로, 페널티 기반 차원 감소를 위해 LASSO 회귀가 수행되었고, 표본 그룹화에 기반한 검증 오류를 평가하기 위해 지지 벡터 기계(SVM) 분석을 사용했으며, 랜덤 포레스트를 사용해 중요도 점수에 따라 특징을 필터링하였습니다. 이 과정을 통해 교차 검증 곡선과 유전자 중요성 버블 플롯 등 해당 진단 시각화가 가능해졌습니다. 모델 구축 후, 이 다중 알고리즘으로 식별된 유전자 집합에 대해 벤 다이어그램 분석을 수행하여 겹치는 '교차' 특징 유전자를 추출하여 잠재적 바이오마커의 신뢰성을 높였습니다. 이 교차 유전자들의 발현 행렬을 추출하여 바이올린 플롯을 통해 그룹 간 발현 차이를 시각화하였습니다. 마지막으로, 각 유전자에 대해 반복 루프를 통해 ROC 곡선을 생성하여 곡선 아래 면적(Area Under the Curve, AUC)을 계산하고, 후보 바이오마커로서 진단 가치를 검증했습니다.

동물 모델 유도

실험 프로토콜은 구이저우 의과대학(2303411) 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, ARRIVE 지침과 동물복지 규정을 따랐습니다. 총 72마리의 SPF 등급 수컷 Sprague-Dawley (SD) 쥐(230 ± 20g)를 보유하고 있습니다. 표준 조건(25± 1°C, 습도 50± 5%, 12시간의 밝고 어두운 주기)에서 1주일간 적응 사육을 마친 후, 쥐들은 무작위로 대조군(C 그룹)(n = 24)과 모델 그룹(M 그룹)(n = 48)으로 나누었습니다.

M 그룹은 이중 요인 모델링을 받았다: 간헐적 담배 연기 노출(9주, 주 6일, 연구용 담배 3개비를 하루 2회 세션으로 나누어 30분씩 복용)과 기관내 LPS 주입(주입당 200 μg, 격주로 1회)^18,19. C 그룹은 동등한 양의 생리식염수를 받았다. 성공적인 모델링 후, 그룹은 무작위로 M군(n = 12), 고용량 BTHTT 그룹(H 그룹)(고용량, 임상 용량 1×, n = 12), 저용량 BTHTT 그룹(L그룹)(저용량, 임상 용량 1/2× n=12)으로 나누었으며, 2주간 지속적인 개베지 중재를 받았습니다. C 그룹과 M 그룹은 동시에 증류수를 제공받았다.

체중과 자발적 활동 매개변수는 매주 기록되었습니다. 모델링 및 치료 종료 시점에 폐 조직, 혈청, 혈청 및 기관지 폐포 세척액(BALF)을 채취하였습니다. 키트 설명서에 따라 ELISA를 사용하여 염증 지표(TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, OPN, MCP-1) 수치를 측정하였습니다. 조직 병리학 및 다중 오믹스 분석도 수행되었습니다.

치료 투여

부티 화탄 당(BTHTT)은 아홉 가지 전통 중국 약초인 암수기(Astragalus membranaceus , Fisch.) Bge. (Astragali Radix, 15g), Pseudostellaria heterophylla (Miq.) 팍스(Pseudostellariae Radix, 15g), 시나모뭄 카시아 (L.) J. 프레스(시나모미 코텍스, 15g), 엔젤리카 시넨시스 (올리브.) 디엘스(Angelicae Sinensis Radix, 10g), 살비아 밀티오리자 Bge. (Salviae Miltiorrhizae Radix et Rhizoma, 15g), Perilla frutescens (L.) Britt. (페릴라에 플로리움, 10g), 라파누스 사티버스 L. (라파니 정액, 10 g), 레피디움 아페탈룸 윌드. (Descurainiae Semen, 10g), 그리고 마호니아 포르투니 (Lindl.) 페데(Mahoniae Folium, 10g). 허브 재료는 합산 무게의 10배에 30분간 물에 담갔고, 이후 1시간 동안 분리했습니다. 뺻액을 걸러내고 여과액을 수집하여 경구 투여를 위해 세 개의 동등한 양으로 나누었다.

임상 안전성과 효능에 근거하여, 임상 약물 지침에 따르면 성인 BTHTT의 표준 용량은 1.57g∙^kg-1∙^day-1 이었습니다. 쥐의 용량 변환 계수를 고려하면, 표준 쥐 약물 용량이 인간 표준 용량의 6.3×임을 나타내므로, 해당 H 그룹은 9.9 g∙kg-1∙day-1, L그룹은 이 용량의 절반(4.95 g∙^kg-1∙^day-1)으로 설정되었습니다. BTHTT의 최종 농축 부피가 50 mL인 경우, 쥐에서 H군의 투여량은 약 1.6 mL, L 군의 투여량은 약 0.8 mL였습니다. 이 약물은 경구 개비지를 통해 하루에 한 번 투여되었습니다.

조직 및 BALF 수집

실험 평가 지점(9주차와 11주차)에서는 쥐들에게 5% 펜토바르비탈나트륨(1 mL/100g) 복막 내 주사로 마취를 투여하였다. 문맥에서 혈액을 채취하여 상온에서 30분간 방치한 후, 13,000 × g 에서 4 °C에서 15분간 원심분리했습니다. 상청액은 -80°C에 보관되었습니다. 폐 조직은 액체 질소에 빠르게 냉동되어 -80 °C에 저장되었습니다. BALF는 차가운 PBS를 사용한 세 차례 연속 세척으로 수집되었습니다.

전사체학 분석

총 RNA는 폐 조직에서 추출되었으며, (A₂₆₀/_{A 280} > 1.8) (RIN ≥ 7.0)에 따라 품질 관리가 이루어졌습니다. RNA 시퀀싱 라이브러리가 구축되었는데, mRNA는 올리고(dT)로 농축되어 분해되어 이중 가닥 cDNA를 합성하고, 어댑터 올리고뉴클레오타이드와 결합하여 PCR로 증폭했습니다. 라이브러리는 시퀀싱 전에 정량화되고 품질 검사를 받았습니다. 구성 분포 검사, 각 샘플의 FPKM 밀도 분포 분석, RNA-seq²⁰의 전반적인 품질 평가 분석을 포함합니다.

시퀀싱 플랫폼에서 생성된 원시 전사체학 데이터는 Perl 스크립트를 사용해 어댑터 서열과 저품질 리드(Q 25염기≤ 60% 또는 N 비율 >> 5%를 차지하는 리드)을 제거했습니다. 이 필터링 과정을 거쳐 깨끗한 리드를 얻었습니다. 깨끗한 리드는 HISAT2를 사용해 기준 게놈과 정렬되었고, 유전자 발현 수준을 정량하여 FPKM 값을 산출했습니다. 차별 발현 분석이 수행되었으며(선별 기준은 |log2FC| > 1, p-adj< 0.05였습니다). 전사 인자 주석은 동물 TFDB 또는 Pfam/DBD 데이터베이스를 기반으로 유전자 ID와 단백질 도메인 정보를 일치시켰습니다²¹.

종 간 검증을 위한 방법론적 엄밀성을 보장하기 위해 정통 유전자 매핑 전략이 사용되었습니다. 이 전략은 NCBI HomoloGene 및 Ensembl BioMart 데이터베이스를 이용해 쥐에서 핵심 인간 유전자(예: SRPX2, IL-1R2, TFF3)의 직소 유전자를 추출하는 것을 포함했습니다. 선발은 명확한 '일대일' 매핑 관계와 고단백 서열 동일성을 가진 유전자 쌍으로 제한되었습니다. 여러 후보자가 있을 경우, HGNC에서 인증한 직동동부 쌍이 우선시되었습니다. 높은 검출 정밀도를 위해 확인된 쥐 직조동유전자의 mRNA 서열을 기반으로 특정 RT-qPCR 프라이머를 설계하였습니다. 검증 기준은 발현 방향의 일관성과 기능 검증에 의해 정의되었습니다. 발현 방향의 일관성: 연기 유발 쥐 COPD 모델에서 RT-qPCR은 쥐 폐 조직에서 표적 유전자의 발현 경향이 인간 GEO 임상 데이터셋에서 관찰된 것과 완전히 일치함을 보여주었습니다. 종 간에 동일한 극성을 보이는 유전자는 질병 생물표지로서 보존성을 가진 것으로 간주되었습니다. 병리학적 검증: 발현 일관성이 확인된 후, 이 유전자들이 COPD의 병리적 진화에 관여하는지 확인하기 위해 상관관계분석을 수행하였습니다.

대사체학 워크플로우

폐 조직(20–50 mg)은 미리 냉각된 메탄올-아세토니트릴-물(2:2:1, v/v)에서 균질화한 후 얼음 목욕에서 초음파 검사를 했습니다. 동질액은 13,000 × g 을 4°C에서 20분간 원심분리했습니다. 상원액은 진공 농축되어 아세토니트릴수(1:1, v/v)에 재용해된 후 0.22 μm 막을 통해 여과하여 LC-MS 분석을 수행했다²².

크로마토그래피 분리는 아마이드 기반 UPLC 컬럼(1.7 μm, 2.1 mm × 100 mm)을 사용하여 이루어졌습니다. 기둥 온도는 25°C로 유지되었다. 이동상은 (A) 25 mM 아세트산 암모늄과 25 mM 암모니아를 포함한 물, (B) 아세토니트릴로 구성되었다. 유량은 분당 0.5 mL로 설정되었고, 주입 부피는 2 μL로 설정되었습니다. 경배 용출 프로그램은 다음과 같았습니다: 0–0.5분, 95% B; 0.5–7분, B의 선형 감소가 95%에서 65%로 감소; 7–8분 동안 B의 선형 감소가 65%에서 40%로 감소; 8–9분 동안 B는 40%를 유지했고; 9–9.1분, B의 선형 증가가 40%에서 95%로; 9.1–12분 동안 B는 95% 상태를 유지했습니다. 전체 분석 동안 샘플은 오토샘플러에서 4°C로 보관되었습니다. 시스템 안정성과 실험 데이터의 신뢰성을 보장하기 위해 샘플은 무작위 순서로 분석되었으며, 품질 관리(QC) 샘플은 큐에 삽입되었습니다. 질량분석기는 질량분석기와 결합된 초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC) 시스템을 사용하여 수행되었습니다. 샘플은 양이온 및 음 이온 모드 모두에서 전기분무 이온화(ESI)를 사용하여 이온화되었습니다. ESI 소스 및 MS 설정은 다음과 같았습니다: 네뷸라이저 가스(가스 1)는 50, 보조 가스(가스 2)는 2, 이온 소스 온도는 350 °C, 분사 전압(ISVF)은 양이온 모드에서 3,500 V, 음의 이온 모드에서는 2,800 V로 설정되었습니다. MS1의 질량 범위는 70에서 1,200 Da 사이로 설정되었으며, 해상도는 60,000, 주사 누적 시간은 100 ms였습니다. MS2에서는 단계적 충돌 에너지를 사용하는 데이터 의존 획득(DDA)이 사용되었습니다. MS2의 질량 범위도 70에서 1,200 Da로 설정되었으며, 해상도는 60,000, 주사 축적 시간은 100 ms였습니다. 동적 배제 시간은 4초로 설정되었습니다.

원시 대사체 데이터는 mzXML 형식으로 변환된 후 피크 정렬, 보존 시간 보정, 피크 영역 추출을 위해 처리되었습니다. 데이터 전처리 워크플로우에는 다음과 같은 단계가 포함되었습니다: 먼저, 50%> 빠진 이온 피크를 제거했습니다. 둘째, 나머지 누락값은 KNN 알고리즘을 사용하여 덧입되었습니다. 셋째, 상대 표준편차(RSD)>50%를 가진 대사 특징은 제외하였다. 실험 데이터의 품질은 주성분 분석(PCA)과 QC 샘플의 군집화를 통해 평가되었습니다. 이후 분석에는 단변량 통계(예: t-검정), 다변량 통계(PLS-DA), 차별 대사물 선별(VIP > 1 및 p < 0.05), KEGG 경로 풍부 분석(초기하학적 검정)^23,24가 포함되었습니다.

생체 내 및 시험관 내 구성 요소에 대한 분석 방법 확립

시험 관 내 시험을 위한 BTHTT 샘플 준비: BTHTT는 물에 증빙(2 x 30분)하여 추출한 후 1.1–1.2 g/mL로 농축한 후 동결 건조되었습니다. 분석 전에 600 μL의 동결 건조 분말 용액을 400 μL의 메탄올과 혼합한 후 40% 메탄올에 재용해한 후 원심분리하여 상청액을 수집했습니다.

생 체 내 시험을 위한 BTHTT 샘플 준비: 혈청은 메탄올(1:1)과 혼합하여 −20 °C에서 30분간 침전시키고, 이후 20분간 원심분리하여 탈단백화했습니다. 상청액은 진공 건조 후 40% 메탄올에 재용해하여 최종 샘플을 얻었습니다. 빈 혈청 + BTHTT 샘플을 준비할 때, 적절한 양의 빈 혈청에 시험 관 내 BTHTT 상청액을 첨가한 후 나머지 단계들은 설명대로 수행되었습니다.

샘플은 역상 UPLC 컬럼(2.1 mm × 100 mm, 1.8 μm)이 장착된 UHPLC 시스템을 사용하여 분리되었습니다. 컬럼 온도는 35°C로 유지되었고, 유량은 분당 0.3mL로 설정되었습니다. 이동상은 (A) 물속 0.1% 개미산과 (B) 아세토니트릴에 0.1% 개미산으로 구성되었다. 표 1에 나와 같이 경사 용출 이 수행되었습니다.

질량분석기를 사용하여 MS1과 MS2 스펙트럼 모두를 획득했습니다. 질량분석기는 UHPLC 시스템과 연동되어 양성 및 음수 ESI 모드로 작동했습니다. ESI 매개변수는 다음과 같았습니다: 분사 전압 3,800 V (ESI+) / 3500 V (ESI-), 피복 가스 압력 45 arb, 보조 가스 압력 20 arb, 이온 전달관 온도 320 °C, 증발기 온도 350 °C. 검출 모드는 완전 스캔/데이터 의존 MS2(Full-MS/dd-MS2)로 설정되었으며, MS1은 60,000, MS2는 15,000 해상도였습니다. 상위 10개의 MS1 이온이 MS/MS 파편화에 적합하며, 계단식 정규화 충돌 에너지는 20, 40, 60으로 선정되었습니다. MS1의 질량 범위는 90도자에서 1,300도아로 설정되었습니다.

생 체 내 분석(빈 그룹 샘플, 투여 그룹 샘플, 빈 그룹 + BTHTT 샘플 포함)에서는 각 샘플 6 μL을 정확히 주입하였습니다. BTHTT의 시험관 내 분석을 위해 샘플 2 μL을 주입하였습니다. 빈 및 투여된 그룹 샘플 배치는 한 번씩 주입되었고, 빈 그룹 + BTHTT 샘플은 3중, BTHTT 샘플은 5중으로 주입되었습니다.

mzXML 형식의 데이터가 처리되었고, 지역 상업용 TCM 질량분석법 데이터베이스를 기반으로 화합물이 식별되었습니다. 식별 기준은 다음과 같이 설정되었습니다: MS1은 질량 오차<25 ppm, MS2는 0.7> 일치 점수(이 점수는 조각 이온 유사성을 반영하여 신뢰할 만한 임계값≥0.7)^25,26). 통계 분석에는 화합물 계수 및 분류(예: 플라보노이드, 알칼로이드)가 포함되었으며, 이는 질량분석법 데이터베이스의 주석과 함께 수행되었다²⁷.

분자 도킹 및 MD 시뮬레이션

식별된 특징 단백질과 그 대응하는 리간드 간의 잠재적 결합 모드를 조사하기 위해 실 리코 분자 도킹이 수행되었습니다. 소분자의 3차원 구조는 PubChem 데이터베이스에서 가져와 기하학적 구성이 최적화되었습니다. 표적 단백질의 결정 구조는 RCSB 단백질 데이터 뱅크(PDB)에서 얻었습니다. PyMOL을 사용하여 물 분자와 헤테로원자를 제거하고, 동결화된 리간드를 추출하여 활성 부위 좌표를 정의했습니다. 수소 원자가 추가되었고, 가스타이거 전하가 소프트웨어로 할당되었습니다. 도킹 시뮬레이션이 실행되어 한 번에 15개의 독립적인 구조를 생성했습니다. 결합 에너지가 가장 낮은 구조를 선택하여 추가 분석을 진행하였습니다. 비공유 상호작용을 엄격히 특성화하기 위해 수용체-리간드 복합체는 단백질-리간드 상호작용 프로파일러(PLIP)를 사용해 분석되었습니다. 참고: 이러한 도킹 결과는 잠재적 분자 상호작용에 대한 구조적 지지를 제공하며, 추가 동적 정교화의 기초가 된다는 점을 강조하는 것이 중요합니다; 그러나 이들은 생물학적 효능에 대한 독립적인 증거로 간주되지 않습니다.

생리학적으로 중요한 조건에서 예측된 단백질-리간드 복합체의 안정성과 구조적 진화를 평가하기 위해 GROMACS 소프트웨어 패키지를 사용하여 분자 동역학 시뮬레이션이 수행되었습니다. 단백질과 리간드의 위상 파일이 GROMOS96 43a1 힘장을 기반으로 생성되었습니다. 각 복합체는 십이면체 박스의 중심에 위치하며, 박스 가장자리에서 최소 1.0 nm 거리를 유지하고 SPC 물 모형으로 용해화했습니다. 전기 중립성을 보장하기 위해 필요에 따라 나트륨 또는 염화물 이온이 시스템에 첨가되었습니다. 에너지 최소화는 최대 힘이 1,000.0 kJ∙^mol-1∙^nm-1 미만일 때까지 가장 가파른 하강 알고리즘을 사용해 수행되었다. 시스템은 두 단계로 나누어 평형화되었습니다: 첫째, NVT 앙상블을 사용해 V-리스케일 온도조절기를 사용해 100 ps 동안 300 K로 시스템을 가열했습니다; 둘째, NPT 앙상블을 사용해 Parrinello-Rahman 기압계를 이용해 100 ps 이상 1바의 압력을 안정화했습니다. 생산 시뮬레이션은 총 10 ns 동안 2 fs 시간 간격으로 수행되었습니다. 장거리 정전기 상호작용은 입자 메시 에왈트(PME) 방법으로 계산되었고, 단거리 반데르발스 및 정전기 상호작용은 1.2 nm의 컷오프 반경으로 관리되었습니다. 시뮬레이션의 신뢰성을 보장하기 위해 가능한 경우 세 차례의 독립 실행이 수행되었습니다. 복합체의 안정성은 단백질 골격 원자들의 평균 제곱근 편차(RMSD)와 평균 제곱근 변동(RMSF)을 계산하여 정량적으로 평가되었습니다. RMSD 프로필에서 고점 달성은 시스템 평형 및 구조적 안정성의 주요 기준으로 활용되었습니다.

일반 통계 분석

이 실험에서는 t 검정 또는 분산 일방향 분석(ANOVA)을 사용하여 그룹 계산이 수행되었습니다.

결과

COPD에서 주요 특징 유전자의 예측

여러 마이크로어레이 플랫폼의 임상 데이터를 배치 효과 보정한 후(보충 파일 1–보충 그림 S1), 차별 발현 분석이 수행되었습니다. SRPX2, CLDN10, TFF3를 포함해 34개의 후보 유전자(32개는 상향 조절, 2개는 하향 유전자)가 확인되었습니다(그림 1A).

이 후보들을 견고한 예측 서명으로 정제하기 위해 세 가지 머신러닝 알고리즘이 공동 모델을 형성하는 데 사용되었습니다. LASSO 회귀에서는 최소 교차 검증 오차에 해당하는 λ 값을 사용하여 16개의 특징이 선택되었습니다(그림 1B,C

토론

갑상선 호르몬 수치의 합성과 유지는 COPD 환자에게 중요하며, 단순한 내분비 기능을 훨씬 넘어 질병 진행, 영양 상태, 폐 기능 및 전반적인 예후에 깊은 영향을 미칩니다 31,32,33. 특히 급성 악화 시, COPD 환자는 종종 '저T3 증후군'이라 불리는 갑상선 기능 저하증과 유사한 상태를 나타냈습니다. 갑상선 호르몬 수치 감소는 COPD의 중증도와 양의 상관관계가 있다고 보고되었습니다^34,35. 첫째, T3는 기초 대사율과 단백질 합성을 조절하는 핵심 호르몬이었습니다. T3 수치의 감소는 근육 단백질 합성 감소와 이화작용 증가를 초래했으며, 이는 COPD 환자에서 근육 위축, 체중 감소, 영양...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아세토니트릴(크로마토그래피 등급)	독일 머크	1499230-935
애질런트 4150 바이오분석기	애질런트 테크놀로지스, 미국
아세트산 암모늄	시그마, 독일	SRE0035-20230321
안젤리카 시넨시스 (올리브.) 디엘스(Angelicae Sinensis Radix),	구이저우 산해통자 제약유한회사, 중국	20240807
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