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방법 논문

폐선암세포주에서 종양 오가노이드 배양 생성

299 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70387

⸱

2026년 6월 12일

 ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Genetics and Development of Complex Phenotypes, School of Life Sciences, Fudan University, 2Shanghai Key Laboratory of Lung Inflammation and Injury, Department of Pulmonary Medicine, Zhongshan Hospital, 3National Demonstration Center for Experimental Biology Education, School of Life Sciences, Fudan University

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

여기서는 A549 세포주에서 종양 오가노이드를 신속하고 순수하며 비용 효율적으로 확립하는 방법을 제시하며, 예비 검사 및 교육 목적에 적합합니다.

초록

여기서는 A549 인간 폐선암 세포주에서 세포주 유래 종양 오르가노이드(CDTO)를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 2D 확장된 A549 세포를 Matrigel에 삽입하고 장기 배양을 위해 3D 배양 배지를 유지하는 것을 포함합니다. 권장 시딩 밀도는 일관된 오가노이드 형성을 지원하기 위해 500 cells/μL로 결정되었습니다. 결과적으로 생성된 CDTO는 헤마톡실린과 에오신(H&E) 염색과 면역형광(IF)으로 특징지어졌습니다. 이 오가노이드는 폐선암 표지자인 갑상선 전사인자 1(TTF-1), 부착 단백질 E-카데린(ECAD), 세포골격 단백질 케라틴 7(KRT7)의 높은 발현을 유지했습니다. 또한, 타이트 간 간 단백질인 Zona Occludens 1(ZO-1) 발현은 종양 오가노이드의 극성 조절 이상을 보였습니다. 이 프로토콜은 폐선암 연구를 위한 기술적으로 간단하고 비용 효율적이며 순수 종양 오가노이드 플랫폼을 제공합니다. 그 단순성과 재현성 덕분에 학부 실험실 교육에도 적합하며, 제한된 실험실 일정 내에서 학생들이 기본적인 3D 종양 오가노이드 배양 기술을 습득하는 데 도움을 줍니다.

서론

오가노이드는 시험관 내에서 줄기세포에서 유래한 자기조직 3차원(3D) 구조로, 실제 장기의 생물학적 복잡성을 상당히 재현할 수있습니다. 오가노이드를 구성하는 세포는 유도된 다능성 줄기세포나 조직 유래 세포에서 유래할 수 있으며, 후자는 정상 줄기/전구세포, 분화 세포, 종양 세포를 포함합니다. 전통적인 2차원 배양 시스템과 동물 모델과 비교할 때, 오가노이드는 인체의 생리학적 특성을 더 가깝게 모방할 수 있으면서도 실험적 유연성도 더 높게 제공합니다. 따라서 오가노이드 기술은 신약 개발3, 개인 맞춤 의학4, 질병 모델링5에 널리 적용되어 왔습니다.

수많은 연구에서 대장암6, 전립선7, 췌장암 8, 위암 9, 간암 10, 담도암 11, 유방암12, 신경내분비종양 등 광범위한 암에 대한 오가노이드 모델이 확립되었습니다. 그러나 종양 오가노이드 연구에서 가장 큰 도전 과제 중 하나는 순도를 유지하는 데 있습니다. 예를 들어, 비소세포 폐암에 관한 연구에서는 확립된 오가노이드 중 순수 종양인 경우가 17%에 불과하다는 사실이 밝혀졌는데, 이는 종양 샘플에 정상 세포와 악성 세포가 혼합되어있어 배양 전에 완전히 분리하기 어려운 경우가 많기 때문입니다. 이 불순물 문제는 비종양 세포의 증식으로 인해 종양 세포가 제거되고, 약물 감수성 검사 결과에 방해를 주며, RT-qPCR 또는 웨스턴 블롯과 같이 종양 세포의 RNA와 단백질이 조절 불가능한 오염 세포 비율로 희석되는 부정확한 분자 분석을 초래할 수 있습니다.

이 문제를 해결하기 위해 연구자들은 종양 세포가 특정 성장 인자에 덜 의존하는 점을 활용해 정상 세포 성장을 억제하고 종양 세포 확장을 촉진하는 선택적 배양 배지 설계를 탐구해 왔습니다14. 또한, 세포 분류나 단클론 식별과 같은 전략이 순수 종양 오가노이드를 구축하기 위해 개발되고 있습니다.

이 프로토콜은 A549 인간 폐 선암종 세포주를 이용해 세포주 유래 종양 오르가노이드(CDTO)를 생성하는 과정을 설명합니다. 이 세포주는 암 줄기세포 유사 특성을 부분적으로 보이며, 시험관 내 클로노생성성, 증식 가능성 및 종양 발생성 향상도 보고되었습니다.15. 결과된 CDTO는 계통 특이적 바이오마커인 갑상선 전사 인자 1(TTF-1)16, 부착 단백질 E-카데린(ECAD)17, 세포골격 단백질 케라틴 7(KRT7)16의 발현을 유지했으며, 종양 오가노이드의 생리적 특징을 보였다. 이 모델은 쉽게 구축할 수 있고 명확한 암세포 구성 요소를 포함하고 있어, 종양 오가노이드 분야에 새로 입문하거나 1차 종양 오가노이드 배양에서 종양 정체성 상실로 어려움을 겪는 연구자들에게 적합합니다. 잠재적 응용 분야로는 예비 약물 감수성 검사(18), 종양 미세환경 연구19, 3D 배양 기술 교육 교육이 포함됩니다.

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프로토콜

실험실 내 실온은 22–24 °C이며, 이를 RT라고 합니다. 스윙 버킷 원심분리기 사용이 권장됩니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 1차 A549 오가노이드의 확립

  1. 준비 및 A549 세포 수확
    1. 70% 합류율의 A549 세포를 담은 6cm 접시를 준비합니다. 트라이플레(TrypLE)와 PBS를 37 °C까지 예열합니다. 실험 설계와 표 1에 따라 세포 수와 마트리젤 부피를 계산하세요.
      1. 해동은 최소 두 개의 우물을 최소 60분 이상 얼음 위에 두기 위해 중복 기능이 있는 마트리젤 이리쿼트를 필요로 했습니다. 돔이 반구형으로 유지되도록 폴리스티렌과 TC 처리된 플레이트를 준비하세요.
      2. 갓 준비한 2D 배지(10% 태아 소 혈청 함유 중 Dulbecco's Modified Eagle's Medium)와 3D 배지(인간 폐 선암종 오가노이드 배지)를 사용하세요. 3D 매체는 상업용 키트에서 생성하거나 한스 클레버 연구실의 삭스, N. 외 연구진에 따르면 생성할 수있습니다.
        참고: 6cm 접시 한 개는 소화 후 약 5,000,000개의 세포를 얻을 수 있습니다. 실험 설계를 위한 입력 셀 수를 줄이세요. 유리 바닥을 이용한 공초점 영상용으로 설계된 판은 Matrigel이 적절한 3D 형태를 형성하기에 적합하지 않습니다.
    2. 사용한 2D 배지를 흡인하여 1 mL PBS로 세포를 한 번 세척하여 잔류 혈청을 제거합니다. PBS를 흡입하고, 예열된 TrypLE 1mL를 추가한 뒤, 37°C에서 4분간 배양합니다.
    3. 세포를 현미경으로 관찰하세요. 세포질이 수축되고 세포가 세포 간 연결을 잃으면, 효소 반응을 종료하기 위해 같은 부피(1mL)의 신선한 2D 배지를 추가합니다.
    4. 피펫으로 부드럽게 피펫으로 부착된 세포를 배양 표면에서 분리하고 다시 부유시킵니다. 세포 현탁액을 1.5mL 원심분리관에 옮기고 300 × g에서 3 분간 RT 원심분리하여 세포에 펠릿을 넣습니다.
    5. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 1 mL 2D 배지에 재현탁합니다. 10 μL 세포 현탁액을 100 μL로 희석한 후 혈구계로 세포 수를 세는 것입니다. 1.1.1단계에 따라 필요한 부피를 계산하고, 미리 헹군 팁이 있는 1.5mL 원심분리관에 흡입하세요.
  2. 수확된 세포를 마트리젤에 시딩하기
    1. 얼음을 준비하고 피펫 팁을 -20°C 냉장고에 1분간 미리 냉각시키고, 가능하면 저보존 팁을 사용하세요. 마트리젤 알리코트에 결정이 남아 있지 않고, 팁이 용액에 들어갈 때 기포가 생기지 않도록 하세요.
    2. 채취한 세포가 담긴 튜브를 RT 300× 압력으로 원심분리하여 상원액을 버립니다. 튜브를 얼음 위에 올려놓으세요. 미리 냉각된 피펫 팁을 사용해 필요한 양의 마트리젤을 천천히 흡입한 후 얼음 위에 올려 펠릿에 넣으세요. 피펫의 첫 번째 스톱만 사용해 얼음 위에 천천히 재현탁하세요. 관찰이 필요하다면 얼음을 10초 이상 두지 말아 주세요.
    3. 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하고 혼합물을 얼음 위에 보관하세요. 각 우물 중앙에 혼합물 한 알리코트를 분사합니다. 분배할 때 피펫을 천천히 빼내고, 기포 형성을 방지하기 위해 첫 번째 스톱만 사용하세요.
      참고: 혼합물은 중앙에 돔 모양의 3D 구조를 형성해야 합니다. 다음 우물로 넘어가기 전에 혼합물을 다시 현탁하세요. 가능하다면 가장자리 우물 사용을 피하고 이 우물에 PBS를 추가하세요.
    4. 플레이트를 37°C에서 5% CO₂ 인큐베이터에서 40분간 배양하여 겔 중합을 진행하세요. 마트리젤이 굳어진 후에는 우물 벽을 따라 3D 매체를 조심스럽게 추가하고 37 °C에서 계속 배양합니다.
      참고: 조제 중 기포를 발생시키지 마세요. 기포가 발생하면 그 부분의 혼합물을 사용하지 마세요.
    5. 배양 중에는 3일마다 또는 색상이 변할 때(분홍색에서 노란색으로) 3D 배지를 교체하세요. 매질 변화 시 거꾸로 현미경으로 오가노이드 성장을 관찰하고, 형태를 사진으로 기록하여 구조 발달을 모니터링합니다.
      참고: 오가노이드는 5000 셀/μL로 표시된 것처럼 분해되거나 파편화되기보다는 30 μm 이상의 직경으로 조밀하고 복잡해야 합니다(그림 1D).

2. 오가노이드의 고정, 삽입 및 절단

  1. 6일째에서 9일째에 오가노이드 배양을 준비하세요. 배양 배지를 세포 배양 배지에서 제거하세요. 1mL의 차가운 PBS로 피펫팅하여 오가노이드를 부드럽게 분리하고, 5% BSA로 미리 헹군 1.5mL 튜브로 옮겨 부착을 방지합니다. 얼음 위에 중력으로 오가노이드가 자연스럽게 가라앉도록 한 뒤 상원액을 조심스럽게 제거하세요.
  2. 펠릿을 재현탁하기 위해 1mL 콜드 PBS를 추가하세요. 오가노이드가 중력에 의해 자연스럽게 가라앉도록 최소 5분간 기다린 후 상환액을 조심스럽게 제거하세요. 일부 오가노이드가 침전되지 않으면, 4°C에서 200 × g에서 1분간 원심분리하여 수집합니다. 이 단계는 여러 번 반복되며 '스몰 워시'라고 부릅니다.
  3. 잔여 마트리젤을 제거하기 위해 작은 세척을 두 번 하세요. 잔류 마트리젤이 남아 있다면, 세척 중 차가운 PBS에 최종 10 mM EDTA 농도를 첨가하세요.
    주의: 샘플을 훈기 후드로 옮기세요. 오가노이드를 덮을 수 있을 만큼 충분한 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하고, 연기 후드에서 얼음 위에 1시간 고정합니다. 고정제를 버리고 작은 세척을 두 번 하세요. IF 염색은 4.1단계로 진행하세요.
  4. 오가노이드가 튜브 바닥에 가라앉은 후, 상청액을 버리고 샘플을 70–75 °C 금속 욕조에서 5분간 예열하여 2.7단계 중 급속한 아가로스 응고를 방지합니다.
  5. 3% (w/v) 아가로스를 1× PBS에 준비한 후, 전자레인지 물에 넣어 완전히 녹고 투명해질 때까지 가열합니다. 부피 손실이나 아가로스 농도 변화를 막기 위해 끓이는 것을 피하세요.
  6. 고정된 오가노이드를 3% 아가로스 30–50 μL에 빠르게 재현탁하여 고르게 분포시키고, 기포 발생을 피할 때까지 얼음 위에서 20–30분간 냉각합니다.
  7. 아가로스-오가노이드 혼합물이 굳어지면, 바늘로 아가로스 블록을 튜브에서 조심스럽게 제거하여 라벨이 붙은 조직 임베딩 카세트로 옮깁니다.
  8. 아가로스 블록이 담긴 카세트를 등급 에탄올 용액(30%, 50%, 70% [4°C에서 하룻밤 보관 가능], 탈수 시 80%, 90%, 95%, 100%, 100%에 순차적으로 담그십시오. 각 단계를 20rpm의 흔들리는 플랫폼에서 30분간 인큐베이팅하세요.
  9. 파라핀 왁스 블록은 65°C에서 오븐에 미리 녹여 사용하세요. 탈수 아가로스 함재 오가노이드를 자일렌으로 옮겨 정화합니다. 잔여 에탄올을 제거하기 위해 각각 15분에서 20분 동안 두 번 담가세요.
  10. 조직 카세트를 차례로 파라핀 욕조 1에 45분간 옮기고, 그 다음 파라핀 욕조 2에 45분간 옮깁니다.
  11. 조직 카세트와 금속 몰드를 임베딩 스테이션의 용융 파라핀 챔버에 넣습니다. 오가노이드 또는 조직 샘플을 카세트에서 꺼내 금속 몰드 중앙에 위치시킵니다. 몰드를 콜드 플레이트 위에 올려 샘플 방향을 고정하세요.
  12. 조직 카세트를 금속 몰드 위에 올려놓고, 추가로 용융된 파라핀을 채운 후 최소 60분간 냉각판 위에 둡니다. 파라핀 블록이 완전히 굳어지면 금속 몰드를 제거하고, 파라핀이 포함된 오가노이드 블록을 4°C에서 보관하여 절단할 때까지 보관합니다.
  13. 미세토임을 이용해 파라핀 함유 오가노이드 블록을 절개합니다. 각 단면의 두께가 균일하게 유지되도록 하여 이후 염색과 이미징을 용이하게 하세요.
  14. 절단된 부분을 40°C로 유지한 수조에 띄워 파라핀 리본이 완전히 팽창할 수 있도록 하세요. 각 구획이 하나의 주름 없는 층으로 펼쳐지도록 하세요; 접히거나 겹치는 부분은 버리세요.
  15. 확장된 절편을 접착식 현미경 슬라이드에 부착하는데, 슬라이드를 절면 아래에 약간 각도를 두고 수직으로 들어 올려 조직을 포착합니다. 이후 처리 시 샘플 식별을 유지하기 위해 연필로 슬라이드에 라벨을 붙이세요.

3. 헤마톡실린 및 이오신(H&E) 염색

  1. 조직 또는 오가노이드 단편이 포함된 슬라이드는 60°C 오븐에서 1–2시간 구워 적절한 접착을 보장하고 잔여 파라핀을 제거합니다.
  2. 절편을 차례로 자일렌 I에 15분, 자일렌 II에 15분간 담근 후, 100%, 100%, 95%, 90%, 80%, 70%의 등급별 에탄올 시리즈를 통해 각각 5분씩 수화합니다. 그 후 슬라이드를 이중 증류수(ddH₂O)에 두 번, 각각 5분씩 씻어냅니다.
  3. 절편을 헤마톡실린으로 5분간 염색하고, 흐르는 수돗물에 1–2분간 헹군 후 1% 산성 알코올로 2초간 분별합니다. 다시 수돗물에 1–2분간 세척한 후, 핵을 1% 암모니아 물에 5초간 표백한 뒤, 마지막으로 수돗물에 1–2분간 세척합니다.
  4. 절편을 70%, 80%, 90%, 95%의 등급별 에탄올 시리즈로 각각 3분간 탈수한 후, 알코올 기반 에오신 용액에 에오신으로 10분간 대염색합니다.
  5. 절반을 절대 에탄올로 두 번, 각각 5분씩 세척하세요.
    참고: 알코올 기반 에오신의 경우 염색 전에 최대 95% 에탄올까지 탈수 상태를 유지하세요. 수용성 에오신은 탈수 전에 염색을 하세요.
  6. 섹션을 자일렌에 각각 5분씩 두 번 담가서 클리어하고, 부착할 때까지 자일렌에 보관하세요.
  7. 자일렌에서 제거한 직후 중성 수지 마운팅 매체를 사용해 슬라이드를 즉시 장착하며, 공기 방울을 주의 깊게 피하세요.
  8. 장착된 슬라이드를 RT에서 30–60분 자연 건조한 후 광학 현미경으로 관찰합니다.
    참고: 자일렌 클리어링 직후 즉시 장착하면 산화를 방지하고 광학 선도를 보장합니다.

4. 전면 면역형광 염색

  1. 2.4단계부터 계속하세요. 펠릿에 1mL의 차단 및 투과액(5% BSA + 0.3% Triton X-100)을 추가하고, RT에서 60분 또는 4°C에서 1–2일간 배양합니다.
  2. 차단 및 투과화 용액에서 제조업체가 권장하는 비율에 따라 1차 및 2차 항체를 희석합니다. 한 번 소량으로 세척한 후 200 μL 희석된 1차 항체를 펠릿에 첨가합니다. 4°C에서 하룻밤 배양하세요.
  3. 소량 세척을 3회 수행하고 200 μL 희석된 2차 항체를 펠릿에 첨가합니다. RT에서 60분간 부화하세요.
  4. 다음으로, 작은 세척을 3번 하세요. 15 μL 마운팅 매체를 추가해 펠릿을 재현탁시키고, 오가노이드가 포함된 매체를 유리 슬라이드에 떨어뜨립니다. 천천히 커버슬립을 매체에 바르고 매니큐어로 밀봉하세요. 커버 슬립을 수동으로 압축하지 말고 표면 장력에 의해 장착 매체가 퍼지도록 하십시오.

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결과

이 프로토콜의 일반적인 과정에는 2D A549 세포를 지수적 단계로 확장시키고(보조 그림 1A), 3D 매트리젤로 통과하여 오가노이드를 형성하는 과정이 포함됩니다(그림 1A). 마트리젤에 캡슐화되면 세포가 증식하여 자기조립하여 주로 단클론 오가노이드를 형성했습니다(그림 1B). 그 빽빽하고 복잡한 형태는 통로 전체적으로 균일했습니다(보충 그림 1C). 반면, 이들 구조물은 대부분 구형이며 문화가 계속될수록 크기가 커졌다; 일부 조각이 처음부터 판 바닥에 부착되어 2D 클론이 형성되었다(그림 1C). 이러한 부착 형태는 10% FBS를 보충한 DMEM으로 배양한 고혈청 상태에서 더 자주 관찰되었습니다(보완 그림 1B). 50–5000 세포/μL 사이의 시딩 밀도 구배를 수행하여 군락...

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토론

이 프로토콜은 기술적 단순성, 재현성, 교육적 활용에 최적화된 A549 폐선암 세포주 유래 종양 오르가노이드를 생성하는 방법을 설명합니다. 성공을 결정하는 세 가지 매개변수는 초기 세포 상태, 배지 제형, 그리고 기질 조성입니다. 또한, 배양 기간은 14일을 초과하는 것이 권장되지 않습니다. 아래에는 주요 매개변수와 문제 해결 방법이 나열되어 있습니다.

초기 셀 상태
세포들은 유전적 부패와 클론 선택을 최소화하기 위해 낮은 통과 수(<20 통과)로 유지되었습니다. 세포는 로그 성장 단계(70%–80% 합류)에 채취하여 최적의 오가노이드 형성 능력을 확보했습니다. 세포 계수 과정에서 채취된 세포들은 단일 세포 현탁액에 있는 것으로 확인되었는데, ��집이 하류 분석에서 정량에 영향을 미쳤기 때문이다. 다만 일반적으로 콜로니 형성에는 방해가 되지 않았다; 지속적인 덩어리는 40 μm 셀 스...

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공개 사항

저자들은 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 복단교수학습우수실행프로그램, 국가교재연구소, 기초학과 인재양성(제J1210012호), 그리고 교육부의 기초학과 우수 학생 양성 프로그램(제20211021호)의 지원을 받았습니다. 그림 1A 는 BioRender에서 작성되었습니다 (Joe, Z. (2026) https://BioRender.com/0qi2gmd).

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재료

```html
이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
1.5 mL Micro Centrifuge tubeBiofilCFT003015
A549 [A-549]인간 비소세포 폐암 세포ZQXZbioZQ0003STR: Amelogenin: X,Y; CSF1PO: 10,12; D13S317: 11; D16S539: 11,12; D5S818: 11; D7S820: 8,11; TH01: 8,9.3; TPOX: 8,11; vWA: 14. 구입 시 마이코플라스마는 부정이었고 2주마다 테스트했습니다. 구입한 배치의 P1 알리쿼트에서 10회 통과 내에서 사용되었습니다.
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Anti-E Cadherin antibodyAbcam ab231303
Anti-Fade Mounting MediumYEASEN 36307ES08
Anti-HIF-1 alpha antibodyAbcam ab51608
Biological Safety CabinetNuaire LABGARDNU-540
Biological Tissue Embedding MachineKEDEEKD-BM
BSASigma A1933
Cell-Grade BSASigma A1933-100G
CentrifugeEppendorfCentrifuge 5702 RSwing bucket; Mild to low speed.
Centrifuge tubeBiofilCFT920150
Citrate Antigen Retrieval Solution (pH 6.0)ZSGB-BIO ZLI-9065
CryostageKEDEEKD-BL
Cytation 5 Cell Imaging Multimode
 Reader		BiotekCytation 5
Cytokeratin 7 (KRT7) Rabbit mAbAbclonal A4357
DMEMGibco11965092
DMSOSolarbio D8371
Donkey SerumSolarbioSL050
Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965118
Eclipse Ts2 Inverted MicroscopeNikon Eclipse Ts2
Eosin Staining Solution (Alcohol-Soluble)Servicebio G1001
FBSNobimpexB118-500
Forma Steri-Cycle i160 CO2 IncubatorThermo Scientifici60
Hematoxylin Bluing SolutionServicebio G1040
Hematoxylin Differentiation SolutionServicebio G1040
Hematoxylin Staining SolutionServicebio G1004
HemocytometerSolarbioYA0810
Human Lung Adenocarcinoma Organoid Medium (3D medium)PMO Bio HC1001
Immunohistochemistry (IHC) PenZSGB-BIO ZLI-93054℃에서 보관
Laser Confocal Microscope  FV3000OlympusFV3000일반적인 파라미터 범위: PMT 전압: 500 ± 200 V; 레이저 투과율: 5 ± 3%; 오프셋: 3 %
Manual Rotary MicrotomeLeicaRM2235
Metal BathALLSHENGMK-3000
Microwave OvenGalanz
Nail PolishLete
Neutral Balsam (Mounting Medium for Microscopy)BeyotimeC0173
Organoid-Specific Extracellular Matrix GelPMO Bio BM1001
PBSWISENT 311-010-CL
Peroxidase Blocking SolutionBeyotime P0100A
PipettesEppendorf312300063/312300020/312400083
Pipettes tipsAxygen14-222-692/14-222-723/14-222-869가능하다면 저 유지 팁을 사용하는 것을 고려하십시오.
Three-Dimensional ShakerSCILOGEXSK-D3309-Pro저속.
Tissue Flotation Water BathKEDEEKD-P
Triton X-100VWR92046-34-9
Trypan BlueGibco 15250061
TryPLEGibco12605028
TTF1 Recombinant Monoclonal AntibodyHUABIO HA720067
```

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