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방법 논문

재조합 인간 SLFN14 리보뉴클레아제의 신속 생성 및 질량 광도계를 통한 화학양론 분석

961 조회수

⸱

DOI:

10.3791/70393

⸱

2026년 2월 20일

 ,  , 
1Department of Structural Biology, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, University at Buffalo, SUNY, 2Verna and Marrs McLean Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, Baylor College of Medicine, 3Therapeutic Innovation Center (THINC), Baylor College of Medicine

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 재조합 인간 SLFN14 리보뉴클레아제의 생성과 질량 광도계를 통한 화학양론 분석을 설명합니다.

초록

리보뉴클레아제는 RNA 절단을 촉매하고 유전자 조절을 포함한 다양한 생물학적 과정에 기여하는 특수한 RNA 결합 단백질 계열입니다. 그럼에도 불구하고, 많은 인간 리보뉴클레아제의 구조, 기능 및 조절은 재조합 단백질 생산의 어려움으로 인해 여전히 제대로 규명되지 않고 있습니다. 이 방법은 인간 슐라펜 14(SLFN14) 리보뉴클레아제의 일시적 발현, 정제 및 화학양론적 분석을 위한 효율적인 접근법을 설명합니다. 재조합 플래그 태그 SLFN14는 HEK293 현탁 세포에서 발현되어, 안티-플래그 친화성 크로마토그래피와 저해상도 크기 배제 크로마토그래피로 구성된 신속 2단계 정제 워크플로우를 통해 분리되었습니다. 민감한 단일 분자 기법인 질량 광도계는 생리적 염분 조건에서 SLFN14가 세포 RNA에 결합한 안정적인 호모다이머를 형성하는 반면, 고염은 호모다이머 배열을 유지하면서 RNA 해리를 촉진한다는 사실을 밝혀냈다. 결과적으로 생성된 재조합 인간 SLFN14 단백질은 하위 구조 연구와 정성적 생화학적 분석에 적합합니다. 이러한 재조합 인간 단백질 분리 및 샘플 특성화에 대한 신속한 접근법은 생물물리적·생화학적 특성 분석을 목적으로 하는 다른 포유류 리보뉴클레아제와 RNA 결합 단백질 생산에도 널리 적용 가능합니다.

서론

슐라펜 14(SLFN14)는 연구가 부족한 리보뉴클레아제이자 포유류 숙주 제한인자 1,2,3입니다. 인간 SLFN14 단백질은 6명으로 구성된 SLFN 유전자 조절자 계열에 속하며, 면역, 항바이러스 활성, 화학감수성 및 세포 분화에 관여하는역할을 합니다 4,5,6,7,8. SLFN 유전자 조절자의 역할에 대한 기전적 통찰은 아직 불완전하며; 그러나 많은 구성원들은 번역 조절에 필수적인 리보뉴클레아제 활성을 가지고 있습니다 7,9. SLFN 리보뉴클레아제는 단백질 호모디머화로 활성화되어 기질 절단에 능숙한 복합 RNA 결합 분할을 형성합니다10,11. 세포가 가짜 RNA 절단을 방지하기 위해 대부분의 SLFN 리보뉴클레아제는 주로 단량체 형태로 존재하며, 각 가족 구성원 5,7,11,12에 특이적인 분자 신호에 의해 활성화될 때까지 기다립니다.

인간 SLFN14의 재조합 생성은 이전에 연구가 부족했던 이 리보뉴클레아제에 대한 포괄적인 분자 연구를 가능하게 하여, 그 기능과 조절에 대한 새로운 통찰을 제공했습니다. 2,13,14. 정제된 재조합 SLFN14 단백질은 in vitro RNA 절단 분석법을 이용해 구조 의존적 전달 RNA 절단 활성의 특성 규격을 가속화했습니다 2,14. 정제된 SLFN14 단백질에 대한 냉동 전자현미경(cryoEM) 연구도 SLFN14 동조이머 배열을 보여주며, 이중으로 RNA가 중심 틈 2,13,14에 적중되어 있습니다. SLFN14의 고차 조립은 분자 질량을 측정하는 단일 분자 기법인 질량 광도계로 추가로 특징지어졌다. 예상치 못하게도, 이 민감한 기술은 SLFN14가 주로 염 저항성 호모디머를 형성하지만, 기능 미상의 염 민감성 호모테트라머(2,13,14)도 형성할 수 있음을 보여줍니다. 전체적으로 정제된 인간 SLFN14 단백질을 얻을 수 있는 능력은 SLFN14 매개 번역 조절에 관한 흥미로운 새로운 연구 단계를 촉진할 초기 분자 통찰을 가능하게 하는 중요한 이정표였습니다.

재조합 SLFN14 리보뉴클레아제는 역사적으로 표준 단백질 생산 전략으로는 획득이 어려웠습니다. SLFN14의 효소 활성을 설명한 원래 보고서에서는 수율이 낮고 안정성이 낮으며 용해도가 낮다고 언급했습니다. 인간 SLFN14 단백질은 긴 폴리펩타이드 사슬, 뚜렷한 소수성, 그리고 리보뉴클레아제 의존성 세포독성을 특징으로 하며, 이들은 기존 박테리아 발현 시스템 1,13,14의 사용을 크게 방해합니다. 그러나 정교한 진핵 번역 및 샤페론 기구는 전장 인간 SLFN14 단백질을 효율적으로 생산하는 강력한 대안을제공합니다. 바큘로바이러스-곤충 및 포유류 발현 시스템을 모두 이용해 냉동전자기동 연구와 생화학적 분석법 2,13,14를 위해 전장 인간 SLFN14 단백질을 얻었습니다. 그러나 일부 경우에는 곤충 유래 SLFN14 단백질이 샘플 응집을 방지하기 위해 안정화 돌연변이가 필요했다. 바큘로바이러스 매개 유전자 전달은 상당한 노력과 긴 리드 타임이 연구 진행 지연과 관련이 있습니다15,16. 반면, 포유류 발현 숙주에서 분리된 재조합 SLFN14 단백질은 속도의 이점을 제공하고, 샘플 최적화를 위한 단백질 공학의 필요성을 피할 수 있습니다.

이 방법은 하위 분자 연구에 적합한 재조합형 야생형 SLFN14 단백질을 비교적 빠르고 적은 노력으로 생산하도록 설계되었습니다. 포유류 세포의 사용은 SLFN14 단백질 공학 없이도 적절한 단백질 접힘을 보존할 수 있는 거의 토착 환경을제공합니다. 바이러스 벡터 전략과 달리 화학물질 기반 유전자 전달 방법은 생산 시간을 몇 달에서15일째로 단축합니다. 포유류 세포 배양의 상대적으로 높은 비용을 상쇄하기 위해, 이 방법은 비용 효율적인 폴리에틸레니민(PEI) 형질전환 시약과 형질전환 효율적인 인간 배아 신장 293(HEK293) 세포를 현탁 상태로 배양합니다17,18. 샘플 처리 중 단백질 손실을 최소화하기 위해, 이 절차는 SLFN14 단백질 정제와 화학양론적 분석을 위한 저샘플 소비 전략을 활용하여 샘플 품질 관리를 수행합니다. 이 4일간의 프로토콜은 1) HEK293 세포에서 일시적 유전자 발현, 2) 스핀 컬럼을 이용한 2단계 크로마토그래피 워크플로우, 3) 질량 광도계를 통한 단백질 화학양론 결정에 대한 구체적인 세부 사항을 제공합니다. 이 절차의 최종 산물은 쌍방향 C-말단 Myc-Flag 태그(SLFN14Myc-Flag)를 가진 야생형 인간 SLFN14 단백질로, 이는 하위 냉동 전자기동 연구와 정성적 생화학적 특성 분석에 활용될 수 있습니다13. 이 다재다능한 접근법은 특히 이종 발현계에서 과발현이 어려운 크고 세포독성이 강한 리보뉴클레아제 유전자를 분리하고 특성화하는 데 적용될 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 인간 프로테옴의 포괄적인 분자 특성 분석의 장벽을 낮춥니다.

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프로토콜

HEK293 세포 배양 실험은 승인된 기관 생물안전 프로토콜에 따라 생물안전성 레벨 2(BSL-2) 조건 하에서 수행되어야 합니다.

1. 포유류 세포에서 SLFN14Myc-Flag 의 일시적 발현

  1. 포유류 HEK293 현탁 세포를 0.5 x 106 세포/mL 크기의 미리 가열한 무혈청 배양지에 넣어 최종 부피 320 mL, 통풍식 배플 1L 플라스크에 넣습니다.
  2. 세포를 37°C, 125rpm,CO2 8%, 습도 75-80%에서 24-32시간 배양합니다.
  3. 트리판 블루 염색과 세포 계수기19를 사용해 세포 수가 1.2-1.8 x 10 x6 cells/mL이고 생존율이 90% 이상임을 확인하세요.
  4. 40mL의 배양물을 8개의 원뿔형 튜브에 디캔트합니다.
  5. 세포를 400 x g에서 20-25 °C에서 5분간 원심분리하여 채취합니다.
  6. 성장 매체는 버리세요.
  7. 각 세포 펠릿을 38mL의 미리 예열된 혈청 무첨가 형질염질 배지에 부드럽게 재현탁하여 최종 부피 304mL를 만듭니다.
    참고: 1.1단계에서 설명한 원래 배양 부피의 나머지 16mL는 1.12단계에서 설명한 형질전환 혼합물로 공급됩니다.
  8. 셀을 새로 배플링된 1L 플라스크로 옮기세요.
  9. 원뿔형 튜브에 재조합 SLFN14Myc-Flag 유전자를 암호화하는 정제 플라스미드 DNA 320 μg을 8mL의 혈청 무첨가 형질염화 배양지에 첨가하고 20-25 °C에서 5분간 배양합니다.
    참고: 플라스미드 농도는 일반적으로 최종 부피 640 μL에서 500 ng/μL입니다.
  10. 1.9단계와 동시에 0.22 μm 여과기 멸균된 PEI 960 μg를 8 mL의 혈청 무첨가 형질염화 배지에 첨가하고 20-25 °C에서 5분간 배양합니다.
    참고: 작업 재고는 일반적으로 최종 부피 960 μL에서 1 mg/mL입니다.
  11. PEI 혼합물을 천천히 재조합 플라스미드 DNA 용액에 점하 방향으로 첨가하고(1.9단계 참조), 20-25 °C에서 15분간 배양합니다.
  12. 1.8단계에서 준비한 세포에 DNA/PEI 혼합물을 천천히 16mL를 점차 첨가합니다.
  13. 세포를 37°C, 125rpm, 8%CO2, 75-80% 습도에서 48시간 배양합니다.
  14. 40mL의 형질전환 세포를 8개의 원뿔형 튜브에 디캔트합니다.
  15. 형질전환 세포를 400 x g에서 20-25 °C에서 5분간 원심분리하여 채취합니다.
  16. 상원액을 디캔트하고 8개의 세포 펠릿을 -80 °C에 보관합니다.

2. 2단계 재조합 SLFN14Myc-Flag 정제

  1. 안티 플래그 친화성 크로마토그래피.
    각 준비물에 1.16단계의 4개 세포 펠릿을 사용하여 반-플래그 친화성 크로마토그래피 프로토콜을 두 번에 수행하세요.
    1. 수지 준비.
      1. 20-25°C에서 15분간 평형 안티플래그 아가로스 수지를 투여합니다.
      2. 50% 수지 슬러리 40 μL를 2mL 마이크로 원심분리관에 옮기기 직전에 병을 뒤집어 부드럽게 재현탁하세요.
        참고: 점성 슬러리를 쉽게 수집하려면 피펫 끝을 잘라야 합니다.
      3. 수지를 1 mL의 고염 워시 버퍼(50 mM Tris pH 7.4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM β-ME, 0.1% Tween-20)에 재현탁합니다.
      4. 4°C에서 45분간 배양하세요.
      5. 수지 슬러리를 8,000 x g에서 4 °C에서 2분간 원심분리합니다.
      6. 고염 워시 버퍼는 흡입 후 버리면서 수지를 손상시키지 않도록 주의하세요.
    2. 세포 용해액 명확화.
      1. 각 트랜스펙션 세포 펠릿을 225 μL 냉각 재현탁 버퍼(50 mM Tris pH 7.4, 600 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM β-ME, 0.5% Triton-X-100, 1 mM PMSF, 5 μg/mL Leupeptin, 1 mM 벤자미딘, 0.7 μg/mL 펩스타틴 A, 0.25 U/mL Genius Nuclease)를 재현탁하여 총 부피 900 μL, 4개 세포 펠릿에 걸쳐 투여합니다.
      2. 세포를 얼음 위에 미리 냉각된 2mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
      3. 마이크로 원심분리관을 4 °C에서 누테이터 위에 수평으로 30분간 배양하세요.
        참고: 단백질 발현 수준이 낮을 경우 문제 해결을 위해 총 해액 20 μL 알리코트를 -20 °C에 보관하세요.
      4. 세포 용해액을 21,300 x g에서 4 °C에서 20분간 원심분리하여 정제합니다.
    3. 단백질 친화성 포획 및 세척.
      1. 정액화된 용해액(2.1.2.4 단계 참조)과 평형화된 안티-플래그 수지(2.1.1.6 단계 참조)를 결합합니다.
      2. 용해액-수지 혼합물을 4°C에서 수평으로 배치한 미세원심분리관에서 60분간 배양합니다.
      3. 용해체-수지 혼합물을 8,000 x g에서 4 °C에서 2분간 원심분리하여 수지 펠릿을 만듭니다.
      4. 약 700 μL의 상청액을 버리면서 수지 펠릿을 손상시키지 않도록 주의합니다.
        참고: 수지 결합 후 -20 °C에 20 μL 상정액을 저장하여 포집 효율이 저하될 경우 문제 해결을 위해 보관하세요.
      5. 남은 수지-상정액 혼합물을 재현탁하고, 빈 800 μL 용량의 스핀 컬럼으로 용액을 옮기고, 빈 2 mL 마이크로 원심분리기 튜브에 삽입합니다.
      6. 스핀 컬럼을 1,000 x g에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 흐름 컬럼을 버립니다.
      7. 2.1.3.5단계의 빈 마이크로 원심분리기 튜브를 500 μL 고염 세척 버퍼로 헹구고 용액을 스핀 컬럼으로 옮깁니다.
        참고: 이 단계는 마이크로 원심분리기 튜브 내에 남아 있는 잔류 수지를 회수하는 데 도움을 줍니다.
      8. 스핀 컬럼을 1,000 x g에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 흐름 컬럼을 버립니다.
      9. 스핀 컬럼에 고염 세척 버퍼 500 μL를 추가합니다. 스핀 컬럼을 1,000 x g에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 흐름 컬럼을 버립니다. 이 과정을 반복해서 총 네 번의 고염분 세척을 합니다.
      10. 스핀 컬럼에 저염 세척 완충제(50 mM 트리스 pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM β-ME, 0.1% 트윈-20)를 추가합니다. 스핀 컬럼을 1,000 x g에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 흐름 컬럼을 버립니다. 이 과정을 반복해서 총 두 번의 저염 세척을 합니다.
      11. 500 μL ATP 워시 버퍼(50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM β-ME, 0.1% 트윈-20, 10 mM ATP)을 스핀 컬럼에 추가합니다. 스핀 컬럼 하단을 막고 4 °C에서 5분간 배양합니다. 스핀 컬럼과 원심분리기를 1,000 x g에서 4 °C에서 2분간 분리한 후 흐름 가스를 버립니다. 이 과정을 반복하여 총 4번의 ATP 세척을 합니다.
      12. 최종 세척은 스핀 컬럼에 500 μL 저염 세척 버퍼를 첨가하여 수행합니다. 스핀 컬럼을 1,000 x g에서 4 °C에서 2분간 원심분리한 후 흐름 컬럼을 버립니다.
    4. 3xFlag 펩타이드에 의한 단백질 용출.
      1. 스핀 컬럼 하단을 저보풀 물티슈로 닦아 과도한 액체를 제거하고 스핀 컬럼 하단을 막으세요.
      2. 3xFlag 용출 버퍼 55 μL (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.5 mM β-ME, 0.1% Tween-20, 300 μg/mL 3xFlag 펩타이드)을 레진 위에 직접 첨가합니다.
      3. 스핀 컬럼 입구를 파라필름으로 밀봉하고 1.7mL 마이크로 원심분리기 튜브에 컬럼을 넣습니다.
      4. 스핀 컬럼을 4°C에서 누테이터 위에서 수직으로 60분간 배큐합니다.
        참고: 스핀 컬럼을 수직으로 유지하려면 고무줄로 마이크로 원심분리기 튜브 랙을 뉴테이터에 장착하세요.
      5. 파라필름과 스핀 컬럼 플러그를 제거하세요. 녹출된 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질을 깨끗한 1.7 mL 마이크로 원심분리관에서 1,000 x g 4 °C에서 2분간 원심분리하여 수집합니다.
      6. 이후 크기 배제 크로마토그래피를 위해 50 μL 안티-플래그 수지 용출액을, SDS-PAGE 분석을 위해 5 μL를 보관합니다.
  2. 크기 배제 크로마토그래피.
    표준 SLFN14Myc-Flag 단백질 분석에는 저염 탈염 버퍼(150 mM NaCl)를, apo SLFN14Myc-Flag 특성 분석에는 고염 탈염 버퍼(500 mM NaCl)를 사용하여 크기 배제 크로마토그래피 프로토콜을 수행합니다.
    1. 2.1.4.6단계에서 50 μL 안티-플래그 수지 두 개를 혼합하여 총 100 μL 샘플을 만듭니다.
    2. 캡을 풀고 하단 폐쇄를 제거한 뒤, 2mL 마이크로 원심분리관에 컬럼을 삽입하여 분자량 40 kDa의 컷오프를 가진 0.5 mL 스핀 탈염 컬럼을 준비합니다.
    3. 스핀 탈염 컬럼을 700 x g 온도에서 4 °C에서 1분간 원심분리하여 컬럼 저장 용액을 제거합니다. 플로우 스루를 버리세요.
    4. 스핀 탈염 컬럼에 저염 또는 고염 제거 버퍼(20 mM Tris pH 7.4, 150/500 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM TCEP)를 추가합니다. 스핀 컬럼을 700 x g에서 4 °C에서 1-2분간 원심분리한 후 흐름 컬럼을 버립니다. 이 단계를 세 번 반복하여 컬럼을 완전히 평형으로 만듭니다.
    5. 스핀 탈염 기둥 바닥을 저보린 물티슈로 닦아내세요.
    6. 스핀 탈염 컬럼을 깨끗한 1.7mL 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
    7. 수지를 손상시키지 않고 컬럼 베드 중앙에 100 μL 혼합 안티-플래그 수지 용출액(2.2.1 참조)을 첨가합니다.
    8. 700 x g 압력에서 4 °C에서 2분간 원심분리하여 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질을 용출합니다.
    9. 분자 특성 분석용으로 회수된 재조합 단백질 95 μL, SDS-PAGE 분석을 위해 5 μL을 보유합니다.
  3. 정제된 재조합 SLFN14Myc-플래그 단백질 샘플을 특성화합니다.
    1. 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(SDS-PAGE)을 수행합니다.
      1. 정제 프로토콜의 여러 단계에서 5μL 샘플을 채취한 2x Laemmli 샘플 버퍼 5 μL 알리코트를 결합합니다.
      2. 95°C에서 5분간 가열 샘플을 사용하세요.
      3. 광범위 단백질 사다리와 10 μL 샘플-라엠블리 버퍼 혼합물을 200V에서 4-15% SDS-PAGE로 30분 동안 분해합니다.
      4. 젤을 Coomassie G-250 염색액으로 오비탈 셰이커에서 30분간 염색한 후, 오비탈 셰이커에서 탈이온수로 젤을 염색하여 배경이 맑아질 때까지 시각화하세요.
      5. 결과 단백질 밴드를 검사하여 2.2.9 단계에서 회수된 샘플이 SLFN14Myc-Flag 이론적 분자량 107.5킬로달톤(kDa)과 일치하는 단일 단백질 밴드인지 확인하세요.
    2. 자외선/가시광도측정법으로 단백질과 핵산을 정량화합니다.
      1. 단백질 저장 버퍼와 일치하는 2μL 저염 또는 고염 탈염 버퍼를 마이크로부피 분광광도계에 배치합니다.
      2. 미세부적 분광광도계를 사용해 회수된 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질 2μL에서 260 nm와 280 nm 흡광도를 측정합니다(2.2.9 단계 참조).
      3. 280 nm에서 기록된 흡수율과 소멸계수(93330 M-1 cm-1)를 사용하여 Beer-Lambert 법칙20을 사용하여 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질 농도를 계산합니다.
      4. 샘플 흡광도비 A260/280을 260nm에서 기록된 흡광도값을 280nm에서 측정한 흡수도값으로 나누어 핵산이 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질과 공정제하는지 판단합니다.
        참고: A260/280 비율이 0.7 이상이면 핵산21의 존재를 나타낼 가능성이 높습니다.
    3. 형광측정법으로 세포 RNA를 정량화합니다.
      1. 2.2.9단계에서 회수한 1-3 μL 재조합 단백질을 사용해 고감도 RNA 특이적 형광 염료를 사용하여 RNA 함량을 정량합니다.

3. 질량 광도계를 이용한 SLFN14Myc-Flag 분자 질량 분석

  1. 질량 광도계 기기 설치.
    1. 질량 광도계 전자 박스 뒤쪽에 있는 스위치를 이용해 레이저를 켭니다.
    2. 격리 덱을 켜고 "격리" 버튼을 눌러 악기 진동을 최소화하세요.
    3. AcquireMP 소프트웨어를 열어보세요.
    4. 기기가 열 평형에 도달할 때까지 1시간을 기다립니다.
  2. 커버 슬라이드 준비.
    1. 부드러운 핀셋으로 유리 커버 슬라이드를 수직으로 잡으세요.
    2. 유리 커버 슬라이드 양면을 Type I 초순수수로 헹구고 이소프로필 알코올을 사용하세요. 이 과정을 총 세 번 반복합니다.
    3. 유리 커버 슬라이드의 양쪽을 타입 I 초순수수로 마지막으로 45초간 세척하세요.
    4. 진공 라인에 연결된 깨끗한 피펫 팁을 이용해 흡입하여 유리 커버 슬라이드의 과도한 물방울을 부드럽게 제거합니다.
    5. 깨끗한 유리 커버 슬라이드는 렌즈 종이로 안감된 플라스틱 상자에 보관하여 질량 광도계로 옮기세요.
  3. 커버 슬라이드를 악기에 장착하세요.
    1. 6웰 실리콘 가스켓을 부드러운 핀셋으로 금속 정렬 도구에 끼워 넣으세요.
    2. 3.2.5단계의 깨끗한 유리 커버 슬라이드를 실리콘 개스킷 위에 올려놓고, 부드러운 핀셋으로 실리콘 개스킷 주변을 살짝 눌러주세요.
      참고: 샘플 웰 위에 압력을 가하지 마십시오.
    3. 질량 광도계의 오큘러스에 침수 오일 한 방울을 떨어뜨립니다.
    4. 유리 커버 슬라이드를 뒤집어 실리콘 가스켓이 위쪽을 향하게 하고, 부드러운 핀셋으로 유리 커버 슬라이드를 Oculus 위에 조심스럽게 올려놓으세요.
    5. 유리 커버 슬라이드의 왼쪽 위와 오른쪽 아래 모서리를 자석으로 고정하세요.
    6. 측면 제어 모드에서 AcquireMP 소프트웨어에서 왼쪽 상단 웰을 선택하여 레이저를 웰 중심에 정렬하세요.
  4. 광범위 단백질 표준을 분석하세요.
    1. 500x 구경 용액 1 μL를 9 μL 1x 인산염 완충 식염수로 희석하여 50x 광범위 캘리브런트 용액(90 kDa에서 1 MDa)을 준비합니다.
    2. 3.4.1단계의 50배 광범위 캘리브랜트 용액 2 μL을 18 μL 1x 인산 완충 식염수에 혼합하여 5배 구경 작업 스톡을 준비합니다.
    3. 빈 우물에 0.22 μm 여과된 저염 또는 고염 탈염 버퍼 10 μL을 추가합니다.
      참고: 이 단계에서 필터링된 버퍼와 2.2.9단계에서 SLFN14Myc-Flag 샘플을 준비하는 버퍼를 대조하는 것이 중요합니다.
    4. 뚜껑 닫아.
    5. 초점 찾기 항목에서 AcquireMP 소프트웨어에서 "droplet dilution"을 클릭하여 샘플 웰의 올바른 초점을 확인하세요.
    6. 5x 캘리브런트 작업 스톡 10 μL을 버퍼 방울에 넣고(3.4.3 단계 참조), 부드럽게 피펫을 위아래로 움직여 용액을 혼합합니다.
    7. 뚜껑 닫아.
    8. 운동, 신호, 채도, 선명도 값이 안정적이고 최적인지 기기 설정을 점검하세요.
      참고: 최적 값은 파란색으로 표시되고, 이상치는 주황색으로 표시됩니다.
    9. AcquireMP 소프트웨어에서 "녹화"를 클릭하여 60초 영상을 녹화하세요.
    10. 결과 파일(.mpr)에 설명적인 제목과 타임스탬프를 저장하세요.
  5. 보정 곡선을 만드세요.
    1. DiscoverMP 소프트웨어를 열어보세요.
    2. 측정 항목에서 "+ 열기" 버튼을 클릭하고 3.4.10 단계의 캘리브랜트 결과 파일로 이동합니다.
    3. 나열된 단백질 표준 파일을 더블 클릭하면 결과를 볼 수 있습니다.
    4. 플롯 구성에서 대비 경계를 각각 0.0000과 -0.03000으로 조정합니다.
    5. 각 개별 피크를 가로지르며 커서를 드래그하여 처음 네 개의 단백질 표준 피크에 대해 가우시안 곡선을 수동으로 정의합니다.
    6. "만들기"를 클릭하고 "질량 보정"을 선택하세요.
    7. 캘리브런트 헤더 아래, 3.5.5단계의 각 적합한 캘리브런트 피크를 각각 알려진 분자 질량인 86, 172, 258, 344 kDa로 할당합니다.
    8. 보정 곡선의 R2 가 1.0에 가깝고 최대 질량 오차(MME)가 2% 미만인지 확인하세요.
    9. "calibration confirm"을 클릭하고 calibration curve 파일(.mc)을 저장하세요.
      참고: 질량 광도계는 매시간 재보정되어야 합니다.
  6. 저염도 및 고염분 조건에서 재조합 SLFN14Myc-플래그 단백질을 분석합니다.
    1. 50 nM 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질 50 μL 용액(2.2.9 단계 참조)을 준비하며, 생리적 염 조건 하에서 표준 샘플 분석에는 저염 탈염 버퍼를 사용하고, APO 단백질 샘플 특성 분석에는 고염 탈염 버퍼를 사용합니다.
    2. 50 nM 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질 혼합물을 21,300 x g에서 20-25 °C에서 10분간 원심분리하여 잠재적인 단백질 응집체와 먼지를 제거합니다.
    3. 수평 제어 상태에서 AcquireMP 소프트웨어에서 "next well"을 클릭하세요.
    4. 0.22 μm 여과된 저염 또는 고염 탈염 버퍼 10 μL 용량을 우물에 주입하고 뚜껑을 닫습니다.
      참고: 이 단계에서 필터링된 버퍼와 3.6.1단계에서 SLFN14Myc-Flag 샘플 희석을 준비하는 버퍼와 일치하는 것이 중요합니다.
    5. 초점 찾기 항목에서 "물방울 희석"을 클릭하여 새 샘플 우물의 올바른 초점을 확인하세요.
    6. 3.6.2단계에서 50 nM 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질 용액 10 μL을 완충 방울에 적재한 후 부드럽게 피펫으로 샘플을 혼합합니다.
    7. 뚜껑을 닫고 3.4.8단계에서 설명한 최적의 기기 설정이 있는지 확인하세요.
    8. AcquireMP 소프트웨어에서 "녹화"를 클릭하여 60초 영상을 녹화하세요.
      참고: 최적의 질량 해상도는 약 1,000-4,000개의 총 카운트를 가진 60초 영상에서 달성됩니다.
    9. 결과 파일(.mpr)에 설명적인 제목과 타임스탬프를 저장하세요.
  7. 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질의 분자량과 화학양론을 계산합니다.
    1. DiscoverMP 소프트웨어 내 측정 항목에서 "+ 열기" 버튼을 클릭하여 3.6.9 단계의 결과 파일을 선택하세요.
    2. 보정 항목에서 3.5.9단계에서 생성된 보정 곡선 파일을 더블 클릭하여 보정을 적용하세요.
    3. 각 관측된 SLFN14Myc-Flag 종에 대해 각 봉우리를 가로질러 커서를 드래그하여 계산된 분자 질량값을 수동으로 정의합니다.
    4. 각 올리고머 종의 평균 분자 질량을 세 가지 독립적인 측정값과 해당 표준편차를 계산합니다.
    5. SLFN14Myc-Flag 단백질의 이론적 질량값을 정수로 계산한 평균 분자 질량을 평가하여 재조합 SLFN14Myc-Flag 단백질의 화학양론을 결정합니다.
      참고: SLFN14Myc-Flag 단량체의 이론적 질량은 107.5 kDa, 다이머는 215 kDa, 삼합체는 322.5 kDa, 테트라머는 430 kDa입니다.

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결과

전체 길이 재조합 인간 SLFN14Myc-Flag 단백질의 일시적 유전자 발현을 위해 설계된 포유류 벡터가 그림 1에 나타났다. 2단계 정제 워크플로우는 HEK293 세포에서 SLFN14Myc-Flag 단백질을 분리하는 과정을 보여줍니다(그림 2A). 정제된 SLFN14Myc-Flag 단백질의 성공적인 대표 변성 겔은 그림 2B에 나와 있습니다. 친화력 크로마토그래피 단계는 SLFN14 C-말단 플래그 태그와 항-플래그 항체 결합 수지 간의 선택적이고 높은 친화도 상호작용에 의존하여 대부분의 샘플 정화를 수행합니다. 이후 크기 배제 크로마토그래피 단계에서는 SLFN14Myc-Flag 단백질을 용출하는 데 사용되는 과도한 3xFlag ...

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토론

이 단백질 생산 프로토콜의 성능과 다재다능성을 강조하는 여러 중요한 단계들이 있습니다. 재조합 단백질 수율을 극대화하기 위해, 우리는 외래 플라스미드 DNA의 흡수가 높고 현탁 배양하여 배양질 전반에 걸쳐 세포 밀도를 극대화할 수 있는 HEK293 세포를사용합니다. PEI 형질전환 시약은 다른 인기 시약에 비해 비교적 낮은 비용으로 높은 형질전환 효율을 달성할 수 있기 때문에 이 대규모 형질전환 전달 프로토콜에 사용됩니다17. 형질전환된 세포는 재조합 단백질의 과발현을 허용하는 동시에 뉴클레아제에 내재된 세포독성 효과를 제한하기 위해 짧은 시간 동안 배양됩니다. 과발현된 재조합 유전자가 극심한 세포독성이나 심지어 세포 사멸을 유발하는 경우, 형질전환 후 잠복 시간을 48시간에서 24시간으로 줄이는 것이 유익할 수 있습니다. 프로테아제 억제제 존재 하에서 빠른 세포 용해, 용해액 정화,...

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공개 사항

저자들은 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

필론 연구실 구성원들이 이 원고를 비판적으로 읽어주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(NIH) 외부 연구 프로그램, 국립일반의학과학연구소(NIGMS)의 지원을 받았습니다. R35GM147123 to M.C.P.) 베일러 의과대학에 발급된 후 뉴욕주립대학교 버팔로 캠퍼스로 전학되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-머캅토에탄올 (b-Me)시그마M3148-500ML14.3 M 해법 톡
MP 2024 R2 인수레페인/데이터 수집 소프트웨어
아데노신-5'-삼인산이나트륨 소금 삼수화물 (ATP)켐-임펙스 인터내셔널00015-100GpH 7.0으로 용액을 조정합니다
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벤자미딘 하이드로클로라이드 하이드레이트시그마B6506-25G프로테아제 억제제
광범위 단백질 표준(10-250 kDa)바이오-래드P7719S전염 단백질 표준성
백작부인 3인비트로젠A49862자동 셀 카운터
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제바 40K 데소틴 컬럼써모피셔 사이언티브A57759크기 배제 크로마토그래피

참고문헌

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