간 섬유증 마우스 모델에서 간 별형 세포 형태 매핑

요약

이 프로토콜은 간별 세포 형태를 온전한 간 조직에서 시각화하고 모델링하기 위한 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전학을 이용한 형광 표 지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다.

초록

조직 내 섬유아세포는 조직 전반에 걸친 섬유화의 세포 동인입니다. 간 내에서는 고유한 '별 모양' 형태를 가진 간성 별세포(HSCs)가 손상 시 섬유성 근섬유아세포로 활성화되어 간 흉터를 만듭니다. 수십 년간의 연구가 HSC 활성화의 주요 신호 전달 경로를 밝혀냈지만, 이들의 독특한 수상돌기 형태의 기능적 중요성은 영상 및 분석의 기술적 한계로 인해 여전히 불분명하다. 이 프로토콜은 온전한 간 조직에서 HSC 형태를 시각화하고 모델링할 수 있는 포괄적인 영상 파이프라인을 제공합니다. 이 접근법은 마우스 유전 학을 이용 한 HSCs의 형광 표지, 현장 간 관류 기반 조직 준비, 그리고 수센티미터 두께의 조직 표본에서 광학 투명성을 달성하기 위해 수정된 iDISCO 조직 클리어링 방법을 결합합니다. 제거된 샘플은 최적화된 공초점 현미경 플랫폼을 통해 영상화되며, 이미지 데이터셋은 개별 HSC의 3차원 재구성을 위한 맞춤형 분석 워크플로우를 통해 단일 세포 해상도로 처리됩니다. 이 파이프라인은 복잡한 간 미세환경 내에서 수지상 돌기와 인접 세포와의 공간적 관계를 포함한 HSC 형태의 재현 가능한 지도화를 가능하게 합니다. 간 외에도, 이 작업 흐름은 폐, 신장, 장, 심장 등 다른 장기의 섬유아세포에도 적응할 수 있으며, 이들 장기에서는 상주 중간엽 세포가 유사한 섬유구성 역할을 병에 관여합니다. 따라서 제안된 틀은 섬유아세포 구조-기능 관계 및 섬유화 질환에서의 치료적 취약성을 탐구하기 위한 비교 장기 간 연구의 방법론적 토대를 마련합니다.

서론

섬유증, 즉 조직의 병리적 흉터는 거의 모든 만성 장기 질환의 마지막 공통 경로이며, 산업화된 국가에서 사망자의 약 40%에 기여^합니다. 간에서는 섬유화가 바이러스성 간염, 음주, 그리고 점점 더 증가하는 대사 기능 장애 관련 고관절성 간질환(MASLD)과 같은 만성 손상에서 발생하며, MASLD는 현재 미국 성인의 30-40%에 영향을 받고 있습니다. 간에 대한 만성 손상과 그에 따른 진행성 섬유화는 간경변증, 간부전, 간세포암과 같은 말기 간 질환의 위험을 크게 증가시킵니다^{. 3, 4, 5}.

간성 세포(HSCs)는 간 항상성과 섬유 형성에 중심적인 역할을 합니다. 건강한 간에서는 HSC가 조용한 비타민 A 저장 상태에 존재하며, 간세포와 전체 간 전체의 항상성에 기여^합니다. 이는 건강한 간에서 거의 모든 HSC를 제거하면 간 질량이 감소하고 간 재생을 심각하게 제한하는 HSC 고갈 연구에서 명확히 입증됩니다 ^7,8. 손상 시 HSC는 근섬유아세포 유사 세포로 활성화되어 증식하고 손상된 부위로 이동하며 과도한 세포외기질(ECM)을 생성하여 섬유화 흉터를 형성합니다. 섬유화된 간 내 활성화된 HSC는 암 관련 섬유아세포의 근원이기도 하며, 간세포암 9,10,11,12에서 종양 촉진 역할을 합니다. 정지 HSC는 독특한 신경세포 유사 형태를 가지며, 작은 세포체에서 장거리 투사가 뻗어 나갑니다. 섬유증¹³에서 활성화되면 HSC는 평평하고 시트 같은 근섬유아세포 형태로 이동합니다. 수십 년간의 연구가 HSC의 ECM 생성을 조절하는 신호 전달 경로를 밝혀냈지만, 이들의 독특한 신경 형태의 기능적 중요성, 조절 방식, HSC 생태적 지적 내 상호작용을 촉진할 수 있는지, 그리고 HSC 섬유성 및 질병에 기여하는지는 여전히 명확하지 않습니다^14,15.

현재 HSC의 형태를 시각화하는 방법은 시험 관 내 배양 세포나 생체 내 조직 절편의 2차원(2D) 이미지에 한정되어 있으며, 여러 세포체 길이에 걸쳐 돌출부가 모든 방향으로 확장되는 HSC 형태학 전체를 포착하는 경우는 드뭅니다. 더불어, 가장 널리 사용되는 HSC 마커인 데스민은 면역형광 염색에서 HSCs의 독특한 뉴런 유사 형태를 완전히 포착하지 못하는데, 데스민은 세포골격 단백질로서^HSC16 내 중간 필라멘트만 표지하기 때문입니다. 이러한 방법론적 도전은 지금까지 HSC 형태와 그 세포 상호작용을 3차원(3D) 방식으로 단일 세포 해상도로 자연스러운 맥락에서 완전히 포착하는 능력을 저해했습니다. 그 결과, HSC 형태가 기능 상태 및 인접 세포 유형과의 상호작용과 어떻게 관련되는지에 관한 근본적인 질문들이 해결되지 않은 상태로 남아 있습니다.

이 글은 온전한 간 조직에서 HSC 형태를 시각화하고 모델링하기 위한 혁신적이고 포괄적인 영상 및 분석 파이프라인을 제시합니다. 이 방법은 여러 핵심 혁신을 통합합니다: (1) 유전 리포터 마우스 모델을 이용한 HSC의 형광 표지, (2) 조직 구조와 세포 관계를 보존하기 위한 현장 간 관류 및 고정 최적화, (3) 광학 투명성을 달성하기 위한 수정된 iDISCO 기반 조직 클리어^{프로토콜, (}4) 심부 조직 이미지 캡처를 위한 고해상도 공초점 현미경, (5) 3D 이미지 재구성 및 정량을 위한 맞춤형 계산 워크플로우 개별 HSC 분석. 프로토콜은 조직 크기와 시간 투자에 대해 일정한 제약을 요구하여 반드시 고려해야 합니다. 이 프로토콜은 HSC의 복잡한 3D 구조를 포착하고, 인접한 혈관세포, 면역세포, 실질세포와의 공간적 관계를 매핑하는 견고하고 재현 가능한 프레임워크를 제공합니다. 여기서 제시된 간을 위한 전략과 파이프라인은 다른 장기에도 쉽게 적용할 수 있습니다.^{17, 18, 19}.

프로토콜

이 연구에 사용된 모든 쥐 실험은 마운트 시나이 아이칸 의과대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다. 시약과 사용된 장비는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. tdTomato(TdT) 표지된 HSCs를 가진 쥐 생성

1. Tg(lox-stop-lox-TdTomato) x Tg(Lrat:Cre) 육종기를 구축합니다 (잭슨 연구소 균주 #007914²⁰ 과 돌연변이 마우스 자원 및 연구 센터(MMRRC) 균주 #069595^21-JAX).
   참고: 3주 후에 모래가 나올 것으로 예상하세요. 수컷 생식계에서 일부 Cre 발현이 검출된 적이 있으므로, 번식용으로 LratCre 암컷을 사용하세요.
2. 꼬리와 F1 유전자형 낙엽을 채취하여 Tg(Lrat:Cre)를 식별합니다; Tg(LSL-TdT) 쥐는 간성 별형 세포에서 TdTomato 형광체를 선택적으로 발현합니다.

2. 현장 간 관류 및 고정

1. 수술 전 준비
   1. 쥐 마취용 케타민/자일라진 혼합물을 케타민 2mL, 자일라진 1mL, 물 7mL를 혼합하여 준비하세요.
      참고: 케타민은 규제 물질이며 실험실 사용에 대해 적절한 허가와 규제가 필요합니다.
   2. 4% 파라포름알데히드(PFA) 관류 용액을 1x 인산 완충 생리식염수(PBS)에 준비합니다.
   3. 1개의 PBS를 튜브를 통해 흐르게 하여 연동 펌프를 설치하고, 유량을 분당 2mL로 설정하세요.
      참고: 튜브 안에 기포가 없는지 확인하세요.
2. 쥐의 무게를 재서 주입할 케타민/자일라진 혼합액의 양을 확인하세요.
3. 케타민/자일라진 혼합물을 복강 내 쥐에 주입하세요.
   참고: 마우스 무게 20g당 200μL의 혼합물을 주입하세요.
4. 쥐를 뚜껑이 있는 용기에 넣고 완전히 마취될 때까지 약 20분간 기다리세요.
   참고: 반사 신경이 없는지 확인하기 위해 마우스 발가락을 꼬집어 보세요. 관류가 시작될 때 쥐가 아직 살아 있는지 확인하세요.
5. 쥐를 유리 용기에서 수술 플랫폼으로 누운 상태로 옮깁니다.
   주의: PFA는 독성이 있고 휘발성이 큽니다; 따라서 화학 후드에서 관류 절차를 수행하세요. 기관 생물안전 지침에 따라 PFA 흐름 처리물을 적절히 수집하고 폐기하십시오.
6. 쥐의 발바닥을 겸자로 꼬집어 반사나 경련 움직임이 없도록 하세요.
7. 손바닥 4개에 바늘을 꽂아 쥐의 복부를 벌리세요.
8. 복부에 70% 에탄올을 뿌려 털을 적셔주세요.
9. 겸자를 사용해 복부 중앙의 피부를 집어 뒷다리와 정렬한 뒤, 양쪽 피부를 절단해 복부를 드러내세요.
10. PBS 습식 면봉을 사용해 장과 다른 장기를 옆으로 옮기고 왼쪽 엽을 들어 올립니다.
11. 왼쪽 엽과 꼬리엽 사이에 붙은 막을 조심스럽게 잘라내세요.
12. 왼쪽 엽 윗부분 기부를 봉합하는 봉합사를 사용하세요.
13. 봉합 매듭 아래의 왼쪽 엽을 잘라내고, 왼쪽 엽은 실험적 필요에 따라 조직 샘플 채취 및 처리를 위해 따로 둡니다(예: 액체 질소에 직접 스냅 얼리기, 광학 절정 온도(OCT) 화합물에 삽입, 포르말린 고정 등).
14. PBS 습식 면봉으로 간을 움직여 문맥을 드러내세요.
15. 문맥 길이의 중간쯤에서 카테터 바늘을 조심스럽게 삽입하세요.
    참고: 카테터 삽입을 돕기 위해 쥐 몸통을 들어 올려 몸 아래에 겸자를 넣어 표면이 평평해지도록 하세요. 삽입 전에 카테터 바늘을 문맥과 최대한 평행하게 정렬하세요.
16. 카테터 바늘을 제거하세요.
    참고: 성공적인 삽입을 알리기 위해 카테터를 통해 혈액이 역류하도록 하세요.
17. 분당 2mL의 유량으로 관류 펌프를 시작하고, 관을 카테터와 연결한 뒤 간에 1x PBS 20mL를 관류하세요.
    참고: 카테터가 혈액으로 완전히 채워졌고, 관류가 관류 완충제로 완전히 채워졌는지 확인한 후 연결 후 공기 방울이 시스템에 전혀 유입되지 않도록 하세요.
18. 간 위에 폐동맥을 고정기로 고정하여 1x PBS가 심장을 통과하지 못하게 막으세요.
19. 하대정맥을 절단해 압력 축적을 풀어주세요.
20. 펌프 속도를 분당 5mL로 조절하세요.
    참고: 관류가 끝날 때까지 약 15분을 기다려 주세요.
21. 펌프를 멈추고 저장소를 4% PFA로 바꾸세요.
    참고: 펌프를 멈추면 튜브 안에 기포가 생기지 않도록 주의하세요.
22. 간에 4% PFA 25mL를 관류하세요.
23. 관류가 끝나면, 연결된 조직을 절단하여 간을 주변 장기에서 분리합니다.
24. 간을 50mL 원뿔형 튜브에 넣고, 4% PFA 25mL를 채웁니다.
25. 튜브를 실온에서 1.5rpm 동안 벤치 로킹 플랫폼 위에 수평으로 올려 1시간 동안 용액 이동을 보장하세요.
26. 간을 1x PBS로 3회 세척하며, 실온에서 1.5rpm, 실온에서 30분씩 세척하세요.
27. 간은 4°C에서 0.02% NaN₃ 를 함유한 20mL 1x PBS에 보관합니다.
    참고: 이 단계에서 간은 최소 1년까지 장기 보관하세요.

3. iDISCO+ 기반 조직 정화

참고: iDISCO+ 프로토콜의 원본 설명은 ¹⁷에서 확인할 수 있습니다

1일차: 샘플 탈수

1. 간 샘플을 약 0.5-1^{cm 크기}의 조각으로 잘라내세요.
   참고: 영상 단계에서 더 쉽게 검출할 수 있도록 다양한 샘플을 다양한 모양으로 절단하세요.
2. 20%(부피/부피), 40%, 60%, 80% 메탄올 희석물을 각각 유리병에 담아 준비하세요.
3. 간 샘플을 나사 뚜껑이 있는 유리 바이알(예: 4-7 mL)에 넣습니다.
   참고: 7mL 유리병 한 개에 최대 6개의 간 샘플을 넣으세요.
4. 샘플을 H₂O 시리즈의 메탄올 희석액으로 탈수하며, 각 20%(볼륨/볼륨), 40%, 60%, 80%를 실온에서 휠 로테이터에서 8rpm으로 1시간 동안 각각 1시간 동안 원심분리 없이 건조합니다.
5. 샘플을 휠 로테이터 위에서 100% 메탄올로 8rpm으로 세척하며, 실온에서 1시간 동안 원심분리가 일어나지 않습니다.
6. 샘플을 4 °C에서 30분에서 1시간 정도 냉각합니다.
7. 유리병에 66%(부대/부피) DCM 희석액을 메탄올에 담아 준비합니다.
   참고: 매번 새로운 희석액을 준비하세요. 용액을 준비할 때는 DCM이 플라스틱(예: 폴리스티렌)을 녹일 수 있으므로 유리 실린더를 사용하세요.
8. 실온에서 8rpm 속도로 66% DCM/메탄올 용액에 샘플을 배양하며, 원심분리는 하지 않습니다.
   참고: 용액을 넣으면 샘플이 위로 떠오르는 현상에 주의하세요.

2일차: 샘플 표백

9. 시료를 휠 로테이터에 8rpm으로 100% 메탄올로 두 번 세척하며, 실온에서 각각 1시간 동안 원심분리가 일어나지 않습니다.
10. 샘플을 4 °C에서 30분에서 1시간 정도 냉각합니다.
11. 샘플을 차가운 5% H₂O₂ 메탄올(1부피 30% H₂O₂ 에서 5 부피의 메탄올)에 표백하고, 원심분리 없이 8rpm, 4 °C에서 하룻밤 동안 표백합니다.
    참고: 매번 새로운 해결책을 준비하세요.

3-5일차: 샘플 투과화

12. 메탄올/H₂O 시리즈로 재수화: 80%, 60%, 40%, 20%, 실온에서 8rpm의 휠 로테이터에서 1시간 동안 1회 PBS 1회 세척, 원심분리 없이 진행.
13. 샘플을 PTx.2(표 1)에서 실온에서 휠 로테이터 위에서 각각 1시간씩 8rpm으로 세척하며, 원심분리는 이루어지지 않습니다.
14. 샘플을 투과화 용액(표 1)에서 37°C에서 2일간 배양합니다.

5일차부터 17일차까지: 면역 표지 부착

15. 샘플을 블로킹 솔루션(표 1)에 37 °C에서 2일간 차단합니다.
    참고: 당나귀 세럼의 불안정성 때문에 매번 신선한 차단액을 준비하세요. 남은 블로킹 용액은 최대 ^{1개월간 4°C에서 보관하세요.}
16. 샘플을 PTwH(표 1)에 희석한 1차 항체에 5% DMSO와 3% 당키 혈청을 37°C에서 5rpm 바퀴 회전기에서 배양하고, 4일간 원심분리 없이 보관합니다.
    참고: 1:500 1차 항체 희석부터 시작하세요.
17. 시료를 PTwH로 4-5회 각각 1시간씩 실온에서 휠 로테이터에서 8rpm으로 세척하며, 원심분리는 하지 않습니다.
    참고: 선택적으로 샘플을 하룻밤 동안 세척하도록 두세요.
18. 샘플을 2차 항체와 PTwH에 희석된 프로피듐 요오화물과 3% 당나귀 혈청을 37°C에서 휠 로테이터에 5 rpm으로 배양하고, 원심분리 없이 4일간 배양합니다.
    참고: 1:500 2차 항체 희석부터 시작하세요. 5 mg/mL 프로피듐 요오다이드 정액에서 1:250 프로피듐 요오화물 희석액을 사용하세요.
19. 시료를 PTwH로 4-5회 각각 1시간씩 실온에서 휠 로테이터에서 8rpm으로 세척하며, 원심분리는 하지 않습니다.
20. 샘플 세척은 원심분리 없이 실온에서 8rpm의 휠 로테이터 위에서 PTwH에 하룻밤 두세요.

18일차: 정리

21. H₂O 시리즈의 메탄올 희석액을 사용해 20%(볼륨/볼륨), 40%, 60%, 80%를 실온에서 휠 로테이터에서 8rpm으로 각각 1시간 동안 탈수하며, 원심분리는 하지 않습니다.
22. 샘플을 100% 메탄올로 2회 세척하고 휠 로테이터를 8rpm 회전으로 실온에서 1시간 동안 세척하며, 원심분리는 하지 않습니다.
23. 샘플을 66%(부피/부피) DCM 희석액으로 메탄올에 넣어 실온에서 8rpm의 휠 로테이터에서 3시간 동안 배양하며, 원심분리는 하지 않습니다.
24. 샘플을 실온에서 휠 로테이터 위에서 8rpm으로 15분간 100% DCM으로 두 번 세척하며, 원심분리는 하지 않습니다.
25. 샘플을 상온에서 하룻밤 동안 DBE에서 배양한 후 영상 촬영을 합니다.
26. 샘플을 DBE에 장기간 보관하면 최대 1년까지 염색 신호에 영향을 주지 않습니다.

4. 공초점 현미경 영상

1. 투명한 샘플을 35mm 유리 바닥 접시에 #1.5 유리 바닥을 넣습니다.
2. 접시에 에틸 계피를 채워 샘플을 완전히 잠깁니다.
3. 접시를 공초점 렌즈에 올려놓고 초점을 조정하여 가장 밝은 신호를 주는 최적의 평면을 찾아보세요.
4. 가장 밝은 평면에서 타일 이미지를 얻어 샘플의 넓은 영역을 포착하며, 1024 x 1024 형식과 속도 600을 사용합니다.
   참고: 타일 이미지에는 촬영 시간과 파일 크기를 줄이기 위해 낮은 대물렌즈(10배 또는 20배)를 사용하세요.
5. 타일 이미지를 바탕으로 관심 영역을 선택하여 더 높은 해상도의 z-스캔을 수집합니다.
6. 1024 x 1024 포맷과 속도 600을 사용해 조직 전체 깊이를 현미경의 최고 해상도로 통과시키는 z-스캔을 포착합니다.
   참고: HSC에 가장 좋은 해상도를 얻기 위해 오일 침수에서는 40배 대물렌즈를 사용하세요.
7. 이미지 파일을 LIF 형식으로 저장하고 Fiji 또는 ImarisViewer 11.0.0을 사용해 파일을 확인하세요.

5. 3D 재구성을 위한 이미지 분석 및 개별 HSC의 정량적 분석

1. ImarisFileConverter 10.2.0을 사용하여 이미지 파일을 IMS 형식으로 변환할 수 있습니다.
2. Imaris 10.2.0의 Surface 모델을 사용해 이미지 속 객체를 감지하세요.
3. Create 마법사를 사용해 관심 있는 3D 영역에 대해 분석을 수행한 후 전체 이미지에 적용하세요.
   참고: 분석 과정을 빠르게 진행하기 위해 이 자료를 활용하세요.
4. 소스 채널, 절대 강도를 선택한 후, 전체 이미지의 강도 임계값을 정의하는 부드러운 버튼 체크를 해제하세요.
5. 임계값을 수정하여 이미지 내 모든 객체를 포착하세요.
6. 복셀 수를 이용해 잔해 객체를 걸러내세요.
7. 마법사를 마무리한 후 통계 버튼을 눌러 모든 통계 측정값을 얻으세요.

결과

쥐 간의 성공적인 관류 및 고정은 간 표면이 균일한 연한 베이지-노란색으로 나타나며, 이는 혈액 제거와 고정제의 침투를 반영합니다(그림 1A,B). 부적절한 관류는 혈전의 진한 붉은색 또는 갈색 영역을 만들어 광학 선명도를 떨어뜨리고 이 샘플 영역에서 높은 배경 신호를 유발합니다(그림 1C).

조직 정리 과정에서 조직 샘플은 관류부터 2차 항체 배양까지 창백하고 베이지색 상태를 유지합니다. 조직 샘플은 2차 항체 배양 후 이전 단계보다 더 흰색으로 변합니다. 샘플을 DBE에서 인큐베이팅하면 완전한 광학 투명성이 달성됩니다(그림 2). 조직은 투명해 보이며, 단단하고 유리 같은 질감을 가지고 있어 고해상도 심부 조직 영상 촬영을 위해...

토론

이 프로토콜은 온전한 간 조직에서 HSC 형태의 3차원 시각화 및 정량 분석을 가능하게 하는 재현 가능하고 적응 가능한 샘플 준비 파이프라인을 설명합니다. 유전적 형광 세포 표지, 현장 간 관류, 수정된 iDISCO+ 클리어링 기법의 통합을 통해 간 미세환경의 공간적 구조를 보존하면서 단일 세포 해상도로 대용량 조직 이미징을 가능하게 합니다.

이 방법의 성공을 위한 중요한 단계는 효율적인 간 관류입니다. 불완전한 관류는 혈액과 지질을 포착하여 혈액 배출 부진과 자가형광 증가로 이어질 수 있습니다 23,24,25. 카테터가 성공적으로 삽입되면 혈액이 역류할 수 있습니다(그림 1A). 혈류...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항RFP 항체, 토끼, 사전 흡착	록랜드	600-401-379
4챔버 35mm 유리 바닥 접시에 20mm 마이크로웰, #1.5 커버 유리	셀비스	D35C4201.5N
AnaSed 주사 (자일라진 주사)	아콘, 주식회사	NDC 593990110-20	20 mg/mL
원뿔형 원심분리관: 50ml	팔콘	352098
면봉	메드라인	MDS202000
곡선 잠금장치  지혈기	피셔 사이언티브	16-100-117
Cy3 결합 AffiniPure Donkey 항쥐 IgG (H+L)	잭슨 면역연구소	712-165-153
섬세한 작동 가위 4.75" 곡선형 날카운/둔트	로보즈 외과 기기	<브레르/> 728501
디벤질 에테르(DBE), 98%	시그마 올드리치	108014
디클로로메탄(DCM) & nbsp; ≥ 99.8%	시그마 올드리치	270997
디메틸 설폭사이드(DMSO), 그리고 99.9%	시그마 올드리치	D8418
Donkey 항 토끼 IgG (H+L) 고도로 교차흡착된 2차 항체, Alexa Fluor 647	서모피셔 사이언티픽	A31573
당나귀 혈청	EMD 밀리포어	S30
에틸 시나메이트, 99%	시그마 올드리치	112372
초고미세 미세 해부 가위; 24 mm 블레이드	피셔 사이언티브	NC9232515
F4/80 단일클론 항체 쥐	서모피셔 사이언티픽	14-4801-82
피지	NIH
겸자	피셔 사이언티브	NC9214139
글리신	바이오-래드	1610718
헤파린 나트륨 소금	켐-임펙스	29984
하이바이드 하이브리드화 오븐	트라이애드 사이언티픽	맥시 14
과산화수소, 30%	시그마 올드리치	31642
Imaris 10.2.0 소프트웨어	옥스퍼드 인스트루먼츠
ImarisFileConverter 10.2.0 소프트웨어	옥스퍼드 인스트루먼츠
ImarisViewer 11.0.0	옥스퍼드 인스트루먼츠
정맥 카테터	엑셀 인터내셔널 주식회사	EXE 26751
케타민, 염산염 주사	데크라	B8U4	100 mg/mL
LAS X 4.4.0.24861 소프트웨어	라이카
라이카 스텔라리스 8 정초점 현미경	라이카
메탄올, HPLC 등급	피셔	A452-2
다목적 회전기	사이언티픽 인더스트리즈, Inc.	모델 151
바늘 (27G x 1/2'')	BD	305109
파라포마데힐드, 분말, 95%	시그마 올드리치	158127
페리스탈틱 펌프	길슨	모델 미니펄스 3
페리스탈틱 펌프 튜브, 마스터플렉스	써모 사이언티픽	96400-16	3.1mm 내경 x 7.6m L/S 과산화물 경화 실리콘 정밀 펌프 튜빙, 크기 L/S 16, 1/8인치 호스 바브
인산염 완충 식염수(PBS)	시티바	SH30256.01	멸균, pH 7.0 - 7.2, 칼슘과 마그네슘 없음
프로피디움 요오다이드 & ge; 94.0% (HPLC)	시그마 올드리치	P4170
면도날	아메리칸 라인	66-0362
흔들기 플랫폼	VWR	모델 200
아지드 나트륨, 그리고 ge; 99.5%	시그마 올드리치	S2002
봉합사	에티콘	J109T
주사기 (1 mL)	BD	309628
트라이톤X-100	시그마	T9284
트윈-20	써모 사이언티픽	J20605-AP
바이알, 나사식 뚜껑에 알루미늄 라이너가 있는 단단한 캡, 미리 조립된 제품입니다	시그마 올드리치	27470-U	용량 7 mL, 호박색 유리 바이알, 과다복용 및 시간; H 17 mm & 횟수; 60mm, 나사산 15-425