Aβ1-42 마우스 모델에서 트립톨라이드가 해마 게피린, 콜리비스틴, 자가포식에 미치는 영향 평가

요약

이 프로토콜은 Aβ1-42 유도 알츠하이머병 유사 마우스 모델을 집계하여 구축하고, 트립톨라이드가 해마 억제성 시냅스 관련 단백질, PI3K/Akt/GSK-3β 신호전달, 자가포식 관련 마커에 미치는 효과를 평가합니다.

초록

알츠하이머병은 시냅스 기능 장애와 관련이 있으나, 후보 개입 후 Aβ 유도 병리가 억제성 시냅스 관련 단백질과 자가포식 관련 신호전달에 미치는 영향을 평가하는 표준화된 절차는 제한적입니다. 이 프로토콜은 Aβ1-42 유도 알츠하이머병 유사 마우스 모델을 구축하고 트립톨라이드가 해마 게피린, 콜리비스틴, PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달 및 자가포식 관련 마커에 미치는 영향을 평가하는 워크플로우를 설명합니다. 성체 C57BL/6J 마우스는 집단 유도 조건에서 준비된 Aβ1-42의 양측 뇌실내주사를 받고, 이후 PI3K 억제제 LY294002 유무에 관계없이 매일 복막 내 트립톨라이드 투여를 합니다. 공간 학습과 기억은 모리스 워터 미로 테스트를 통해 평가됩니다. 해마 신경 손상과 Aβ 침착은 헤마톡실린과 에오신 염색과 Aβ 면역조직화학으로 평가되며, 해마 용해액은 웨스턴 블롯팅을 통해 게피린, 인산화 게피린, 콜리비스틴, PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달 단백질, LC3-II/I, p62를 정량화합니다. 주요 절차적 고려사항으로는 표준화된 Aβ1-42 준비, 정확한 입체주사, 일관된 행동 검사 조건, 눈가리적 관심 영역 선택, 표준화된 영상 및 밀도 측정 분석이 포함됩니다. 이 워크플로우를 사용하여 Aβ1-42 투여는 공간 학습 및 기억 결손, 해마 신경 손상, Aβ 침착, 게피린 및 콜리비스틴 발현 감소, PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달 변화, LC3-II/I 및 p62 축적 증가를 초래했습니다. 트립톨라이드는 이러한 행동, 조직학, 분자 변화를 부분적으로 되돌렸고, LY294002 그 효과를 완화시켰다. 이 프로토콜은 Aβ 유도 해마 분자 변화와 후보 개입을 평가하는 데 사용될 수 있으며, 이 모델이 인간 알츠하이머병의 만성적이고 다요인적인 진행을 재현하지 않는다는 점을 인식합니다.

서론

알츠하이머병(AD)은 인지 저하, 기억력 저하, 행동 장애를 특징으로 하는 진행성 신경퇴행성 장애로, 노인 치매의 주요 원인 중 하나입니다. 아밀로이드-β(Aβ) 침착, 타우 병리, 시냅스 기능 장애, 신경염증, 단백질 항상성 장애가 AD 병인에 널리 연관되어 있지만, Aβ 관련 독성과 억제성 시냅스 단백질 교란을 연결하는 분자 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았습니다 1,2,3,4 . 억제성 시냅스 기능 장애는 신경 회로에서 흥분과 억제의 균형을 깨뜨려 네트워크 불안정성과 인지 장애에 기여할 수 있습니다. 그러나 Aβ 유도 AD와 유사한 병리학적 조건에서 억제성 시냅스 관련 스캐폴딩 단백질을 조절하는 세포 내 신호 전달 사건에 대해서는 추가 설명이 필요합니다^.

게피린은 시냅스 후 6부위 6에서 글리신 수용체와 γ-아미노부티르산 A형 수용체를 포함한 억제성 신경전달물질 수용체를 고정하고 안정화하는 주요 시냅스 후 스캐폴딩 단백질^입니다. ARHGEF9에 의해 암호화된 콜리비스틴은 게피린과 상호작용하여 억제성 시냅스 성분의 군집화 및 막 위치 조절을 촉진하는 구아닌 뉴클레오타이드 교환 인자입니다⁷. 따라서 게피린과 콜리비스틴 간의 기능적 상호작용은 억제성 시냅스의 조직, 유지 및 가소성에 필수적입니다. 이 단백질 복합체의 교란은 억제성 신경전달을 저해하고 인지 장애에 기여할 수 있습니다. 특히, 게피린 안정성과 시냅스 군집화는 인산화 의존적 메커니즘에 의해 조절될 수 있습니다. Aβ 올리고머 관련 신호전달은 글리코겐 합성효소 키나아제-3β(GSK-3β)와 같은 키나아제에 영향을 미치는 것으로 보고되었으며, 이는 세린 270에서 게피린 인산화를 촉진하여 게피린의 군집 형성과 분해에 영향을 미칠 수 있습니다. 이러한 발견은 키나아제 매개 게피린 조절이 Aβ 관련 병리와 억제성 시냅스 기능 장애 사이의 중요한 분자적 연관성을 나타낼 수 있음을 시사합니다 ^8,9.

PI3K/Akt 경로는 신경세포 생존, 시냅스 가소성, 단백질 항상성, 자가포식 조절에 관여하는 핵심 세포 내 신호 전달 경로입니다. Akt 활성은 억제성 인산화를 통해 GSK-3β를 억제하여 신경 기능과 시냅스 안정성에 관여하는 하위 기질을 조절할 수 있습니다. PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달 조절 이상은 AD와 관련된 신경 손상과 관련이 있으며, 시냅스 장애와 비정상적인 단백질 분해에 기여할 수 있습니다^10,11. 동시에 자가포식은 손상된 소기관과 잘못 접힌 단백질을 제거하는 필수적인 세포 내 분해 경로입니다. 자가포식-리소좀 기능 장애는 AD¹²에서 Aβ 축적, 타우 병리, 신경 손상과 밀접한 관련이 있습니다. 그러나 LC3-II/I 변화만으로는 자가포식체 형성 증가와 자가포식 분해 저하를 구분할 수 없습니다; 따라서 자가포식 관련 플럭스 변화를 더 잘 평가하기 위해 P62와 같은 추가 마커가 필요합니다. 이러한 관찰들은 동일한 실험 틀 내에서 PI3K/Akt의 활성, GSK-3β 매개 게피린 조절, 자가포식 관련 마커를 검토할 필요성을 뒷받침합니다.

트리프톨라이드는 트리프테리기움 윌포디에서 분리된 생리활성 디테르펜 트리에폭사이드로, 항염증, 면역조절, 신경보호 효과를 발휘하는 것으로 보고되었습니다¹³. 이전 연구들은 트립톨라이드가 AD 유사 모델에서 인지 능력을 향상시키고 억제성 시냅스 관련 단백질을 보존할 수 있음을 시사했습니다. 그럼에도 불구하고, 트립톨라이드 처리, PI3K/Akt 경로 활성화, GSK-3β 매개 게피린 인산화, 콜리비스틴 발현, 자가포식 관련 단백질 변화 간의 기전적 관계는 완전히 정의되지 않았습니다. 트립톨라이드가 Aβ1-42 유도 AD와 유사 마우스 모델에서 PI3K/Akt/GSK-3β 연관 기전을 통해 해마 게피린과 콜리비스틴 발현을 조절하는지는 아직 명확하지 않습니다^14,15.

APP/PS1 또는 5xFAD 마우스와 같은 만성 형질전환 AD 모델과 타우오파시 기반 모델과 비교할 때, 집집된 Aβ1-42의 뇌실내 주사는 Aβ 관련 해마 손상 및 인지 장애를 유도하는 비교적 빠르고 기술적으로 접근 가능한 접근법을 제공합니다. 이 프로토콜은 단기 Aβ 유발 신경독성, 해마 분자 변화, 그리고 중재 관련 영향이 정의된 신호 전달 경로에 미치는 효과를 평가하는 데 적합하다. 그러나 이 모델은 인간 AD의 만성 아밀로이드 생성, 타우 병리, 혈관 변화, 신경면역 복잡성, 연령 의존적 진행을 재현하지 못합니다. 따라서 이 프로토콜을 통해 얻은 결과는 Aβ 유도 AD와 유사한 병리로 해석되어야 하며, 이상적으로는 만성 형질전환 모델, 타우 관련 모델, 또는 인간 유래 신경 시스템에서 검증되어야 합니다. Aβ 병리, PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달, 억제성 시냅스 관련 단백질, 자가포식 관련 이상이 AD와 AD와 연관된 기존 증거에도 불구하고, 행동 검사, 해마 조직학 평가, Aβ 면역조직화학, 억제성 시냅스 관련 단백질 분석, 키나제 신호 전달 평가, 자가포식 관련 마커 검출을 단일 Aβ1-42 유도 중재 모델 내에서 통합하는 프로토콜은 드물다. 이러한 방법론적 격차는 후보 화합물이 정의된 세포 내 신호 전달 경로를 통해 억제성 시냅스 관련 단백질의 변화를 조절하는지 재현 가능한 평가를 제한합니다.

이 프로토콜의 목적은 PI3K 억제제 LY294002 유무에 관계없이 트립톨라이드로 처리된 Aβ1-42 유도 AD유사 마우스 모델에서 해마 게피린과 콜리비스틴 발현 및 관련 조절 기전을 재현 가능한 워크플로우로 평가하는 것입니다. 이 연구의 원초적 기여는 입체주성 Aβ1-42 투여, 신호전달 경로의 약리학적 조절, 모리스 수중 미로 검사, 조직학 및 면역조직화학적 평가, 억제성 시냅스 관련 단백질, PI3K/Akt/GSK-3β 신호전달, 자가포식 관련 마커의 웨스턴 블롯 분석의 통합입니다. 작업 가설은 Aβ1-42에 의해 유도된 AD와 유사 병리가 PI3K/Akt의 신호 저하, GSK-3β 관련 게피린 인산화 변화, 해마 게피린 및 콜리비스틴 발현 감소, 자가포식 관련 단백질의 비정상적 축적과 연관되어 있으며, 트립톨라이드 치료는 이러한 행동 및 분자 이상을 부분적으로 역전시킬 것이라는 것이었습니다.

프로토콜

모든 동물 시술은 후베이 의과대학 의학윤리위원회의 승인을 받았으며, 동물 관리 및 사용에 관한 기관 지침에 따라 수행되었습니다(번호: SYXK2019-0031.). 동물, Aβ1-42, 트립톨라이드, LY294002, 파라포름알데히드, 자일렌, 에탄올, 화학발광 시약을 포함한 모든 시술은 실험실 코트, 장갑, 보호 안경 등 적절한 개인 보호 장비를 착용하여 시행해야 합니다. 동물 사체, 뇌 조직, Aβ 오염 소모품, 파라포름알데히드 폐기물, 자일렌 폐기물, ECL 오염 물질은 기관의 생물안전 및 화학 폐기물 처리 규정에 따라 별도로 수집하여 폐기해야 합니다. 이미지 분석은 ImageJ를 사용하여 수행되었습니다. 면역조직화학적 분석을 위해 이미지를 8비트 그레이스케일로 변환하거나 색상 디컨볼루션을 거쳐 DAB 양성 염색을 분리했습니다. 동일한 임계값이 동일한 실험 내 모든 이미지에 적용되었습니다. 양성 염색 면적, 전체 관심 영역, 통합 밀도를 측정하였습니다. 웨스턴 블롯팅의 경우, 배경 감산 후 젤 분석 도구를 사용해 밴드 강도를 측정하였습니다. 표적 단백질 농도는 β-액틴으로 정규화되었고, 인산화된 단백질은 해당 총 단백질 농도로 정규화되었습니다.

이 연구에 사용된 시약과 장비는 제품명, 제조사, 카탈로그 또는 모델 번호, 일반 설명을 포함하여 재료표에 나열되어 있습니다.

동물과 실험적 그룹화
후베이 의과대학 동물실험센터에서 10-12주 생후 22-28g 크기의 성체 C57BL/6J 마우스 48마리(수컷 24마리, 암컷 24마리)를 구입했습니다. 쥐들은 22± 2°C의 특정 병원체가 없는 환경에서 오토클레이드 물과 표준 설치류 사료를 자유롭게 섭취하였습니다. 적응 후 1주일 후, 쥐들은 무작위로 네 그룹에 배정되었습니다: 대조군, Aβ1-42 유도 AD와 유사 모델군, 트립톨라이드 처리군, 그리고 LY294002 플러스플립토라이드 공동 치료군(그룹당 12마리). 수컷과 암컷 쥐는 가능한 한 균등하게 그룹에 걸쳐 균형을 이루었습니다.

Aβ1-42 펩타이드는 멸균 생리식염수에 최종 농도 10 μg/μL로 용해되었다. 응집 유도 조건에서 Aβ1-42를 준비하기 위해, 용액은 37°C에서 순환하는 물욕에서 7일간 배양하고, 사용 전에 부드럽게 혼합한 후 주입 시 얼음 위에 보관했습니다. 이 준비 조건은 이전에 발표된 Aβ42 응집 절차를 차용한 것입니다. 본 연구에서는 정확히 주입된 Aβ1-42 배치의 응집 상태가 티오플라빈 T 형광, SDS-PAGE/웨스턴 블로팅, 투과 전자현미경으로 독립적으로 특성화되지 않았습니다. 따라서 이 프로토콜에서 "집집된 Aβ1-42"라는 용어는 응집 유도 배양 조건에서 조제된 Aβ1-42를 의미합니다.

모델 구축을 위해 쥐들은 0.04 mL/10 체중 용량의 복막 내 주사 10% 펜토바르비탈 나트륨을 투여했다. 발 철수와 각막 반사가 없음으로 적절한 마취가 확인되었습니다. 각 쥐는 입체 조절 장치에 고정되었고, 두피는 면도된 후 아이오도포르(75% 에탄올)로 소독되었다. 두개골을 노출시키기 위해 중앙선 절개를 했고, 입체현미경으로 브레그마가 확인되었습니다. 두개골은 브레그마와 람다가 같은 수평면에 위치하도록 조정되었다.

양측 측심실 주사는 브레그마에 대한 다음 좌표를 사용하여 시행되었습니다: 전후측, −0.50 mm; 중측 ±1.00 mm; 그리고 배복부는 두개골 표면에서 −3.00 mm 떨어져 있습니다. 총 2 μL 응집된 Aβ1-42 용액을 마이크로 주사기를 사용해 각 측심실에 천천히(분당 2 μL) 주입하였습니다. 주사는 조직 손상과 역류를 줄이기 위해 일정한 저속으로 시행되었습니다. 주사 후 바늘은 약 5분간 그대로 두었다가 천천히 빼냈습니다. 대조군 마우스는 동일한 좌표와 동일한 수술 절차를 사용하여 동일한 양의 멸균 생리식염수를 투여했습니다. 주사 후에는 봉합사나 상처 클립으로 두피 절개부를 봉합하고, 쥐들은 의식을 회복할 때까지 따뜻한 회복 케이지에 넣어졌습니다. 수술 후 회복, 체중, 상처 치유, 미용 행동, 운동 활동, 통증 또는 고통의 징후를 매일 모니터링하였습니다.

약물 개입은 모델이 안정된 것으로 판단된 후 입체주사 2주 후에 시작되었습니다. 트립톨라이드는 프로필렌글리콜 4%가 함유된 생리식염수에 용해되어 30일 연속 복막 내 투여를 하였다. 트립톨라이드 치료 그룹은 매일 0.2 mg/kg의 트립톨라이드를, LY294002 및 트립톨라이드 공동 치료군은 30일 연속 0.3 mg/kg LY294002 30일 연속 0.3 mg/kg 트립톨라이드를 투여했습니다. 대조군과 Aβ1-42 유도 AD유사 모델 그룹은 동일한 주입 일정을 사용하여 동일한 양의 차량 용액을 받았습니다¹⁶.

모리스 워터 미로 테스트
공간 학습과 기억은 마지막 약물 투여 후 24시간 후에 모리스 워터 미로를 사용해 평가되었습니다. 이 물 미로는 원형 수영장에 22°C± 1°C로 유지되는 물이 채워져 있었습니다. 시각적 단서는 수영장 주변에 배치되었고 실험 내내 변함없이 유지되었습니다. 위치 항법 단계에서는 숨겨진 플랫폼이 목표 사분면에 고정되었습니다. 매일 검사 전에 쥐들은 약 30분간 검사실에 적응하도록 했습니다.

위치 항법 테스트는 6일 연속으로 수행되었습니다. 각 시험에서 쥐는 시작 구역 중 하나에서 수영장 벽을 향해 조심스럽게 물속에 넣고, 최대 60초까지 숨겨진 플랫폼을 찾을 수 있게 했습니다. 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾으면 15초 동안 플랫폼에 머물 수 있었습니다. 만약 마우스가 60초 이내에 플랫폼을 찾지 못하면, 플랫폼으로 안내되어 공간 기억 통합을 위해 20초 동안 머물도록 허용했습니다. 각 쥐는 하루에 4번의 시도를 받았으며, 탈출 지연, 수영 거리, 수영 속도는 자동 비디오 추적 시스템을 통해 기록되었습니다.

7일째에는 탐침 시험을 위해 플랫폼이 제거되었습니다. 쥐는 원래 플랫폼 맞은편 사분면에서 물에 넣어 60초 동안 자유롭게 헤엄칠 수 있게 했습니다. 플랫폼 통과 횟수와 목표 사분면에서 머문 시간의 비율이 기록되었습니다. 각 실험 후에는 쥐를 말린 뒤 저체온증을 막기 위해 따뜻한 우리에 다시 넣었다^17,18.

조직 채취
행동 검사 후, 쥐들은 0.04 mL/10 체중 용량의 복강내 펜토바르비탈 나트륨 10% 주사로 깊은 마취를 받았습니다. 각 그룹에서 무작위로 8마리의 쥐가 해마 단백질 추출을 위해 선정되었습니다. 그들의 뇌는 얼음 위에 신속히 제거되었고, 양측 해마 조직은 얼음처럼 차가운 표면 위에 해부되었다. 해마 샘플은 사전 표지된 크라이오비얼에 넣어 액체 질소에 급동한 후 단백질 추출 전까지 −80 °C에서 보관했습니다.

각 그룹의 나머지 네 마리는 조직학적 및 면역조직화학적 분석에 사용되었습니다. 심마취 하에서 쥐들은 인산염 완충 식염수를 경심 관통해 간이 창백해질 때까지 주입한 후 4% 파라포름알데히드를 투여했다. 뇌는 조심스럽게 제거되어 4% 파라포름알데히드, 4°C에 24시간 후 고정되었습니다. 고정 후 뇌 조직은 병리 실험 플랫폼에 제출되어 파라핀 삽입과 이후 절절 절단이 이루어졌습니다. 파라포름알데히드는 화학 훈기 후드에서 처리되었으며, 파라포름알데히드 함유 폐기물은 기관의 화학 폐기물 처리 요구사항에 따라 별도로 수집되었습니다.

헤마톡실린과 에오신 염색
파라핀이 내장된 뇌 조직을 4μm 관상 절단으로 절단하여 해마를 포함하게 했습니다. 섹션들은 60°C에서 1시간 동안 구워졌고, 각각 10분씩 자일렌에 두 번 탈파라핀되었으며, 등급별 에탄올 용액(100%, 95%, 85%, 75%)으로 재수화한 뒤 증류수(각 단계마다 5분씩)를 사용했습니다. 재수화 후, 절편을 헤마톡실린으로 10분간 염색하고, 흐르는 수돗물에 헹군 후 필요할 때 산성 알코올(2초)으로 잠시 분별하고, 흐르는 수돗물에 청색 처리했습니다. 그 후 5분간 에오신으로 교환 염색을 하고, 등급 에탄올로 탈수했으며, 각각 5분씩 자일렌으로 두 번 투명화한 후 중성 수지로 마운트했습니다.

해마 형태는 광학 현미경으로 관찰되었습니다. 모든 그룹에서 동일한 해마 하위 영역에서 20× 배율과 영상 파라미터를 사용하여 이미지를 촬영하였습니다. 신경 손상은 그룹 할당에 눈이 먼 연구자가 영상 분석 소프트웨어를 사용해 신경 밀도, 핵 피크시스, 무질서한 배열을 기반으로 평가하였다¹⁹.

Aβ 면역조직화학
Aβ 면역조직화학에서는 파라핀 절편을 헤마톡실린 및 에오신 염색에 따라 탈파라핀 및 재수화하였습니다. 항원 회재는 pH 8.0의 EDTA 항원 회출 완충 내에서 전자레인지에 고출력 전자레인지에서 3분간 두 번 가열하여 수행되었습니다. 각 부분은 실온까지 식힌 후 PBS로 각각 5분씩 세 번 세척했습니다. 내인성 과산화효소 활성은 3% 과산화수소로 상온에서 15분간 차단한 후, PBS 세척을 3차례 각각 5분씩 했습니다. 비특이적 결합은 5% 정상 염소 혈청으로 실온에서 30분간 차단하였다. 절편들은 4°C에서 1:200 희석된 Aβ 1차 항체를 PBS에서 하룻밤 배양하였습니다. 인큐베이션 후, 절편을 PBS로 각각 5분씩 세 번 세척한 후, HRP 결합된 2차 항체로 실온에서 60분간 인큐베이션했습니다. PBS로 세척한 후 DAB 기판을 적용하고 현미경으로 색 현상을 모니터링했습니다. 갈색 양성 염색이 나타나자 증류수로 반응을 멈추게 되었습니다. 절편은 헤마톡실린으로 염색하고, 등급 에탄올로 탈수되며, 자일렌으로 투명화한 후 중성 수지로 부착되었습니다. 동일한 해마 하위 영역에서 동일한 현미경 설정과 20× 배율로 촬영하였습니다. Aβ 면역염색은 영상 분석 소프트웨어를 사용해 정량화하였다. 양성 염색 임계값은 모든 이미지에서 일관성을 유지했으며, Aβ 침착은 양성 염색 면적을 각 미세경 영역의 총 세포 수로 나눈 값으로 계산하였다.

해마 단백질 추출 및 서부 블롯 분석
냉동 해마 조직은 얼음 위에 보관한 후 프로테아제와 인산효소 억제제가 포함된 얼음 냉각 RIPA 용해 완충제에 균질화되었습니다. 동질체는 얼음 위에서 30분간 배양한 후 충분한 용해를 위해 간헐적으로 소용돌이 반응을 일으켰다. 그 후 용해액은 12,000 × g 에서 4°C에서 15분간 원심분리한 후, 상원액을 채취하여 단백질 분석을 수행했습니다. 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용해 측정되었습니다. 간단히 말해, BSA 표준과 단백질 샘플을 복제하여 BCA 작동 시약과 혼합하여 37°C에서 30분간 배양하고, 마이크로플레이트 리더기를 사용해 562nm에서 측정했습니다. 단백질 농도는 표준 곡선에 따라 계산되었고, 모든 샘플은 전기영동²⁰ 전에 동일한 최종 농도로 조정되었습니다.

각 해마 샘플에서 총 단백질 20 μg를 12% SDS-PAG로 분리하여 PVDF 막에 옮겼습니다. 전기영동은 스택을 위해 80V, 분리를 위해 120V로 수행되었다. 단백질은 100V 습식 전달을 4°C에서 90분간 사용하여 메탄올에서 활성화된 PVDF 막으로 전달되었습니다. 이식 후 5% BSA로 상온에서 1시간 동안 막을 막았습니다. 막은 이후 4°C에서 1차 항체와 함께 하룻밤 배양하였으며, 게피린(1:1000 희석), 인산화 게피린(1:500 희석), 콜리비스틴(1:1000 희석), PI3K(1:1000 희석), Akt(1:1000 희석), GSK-3β(1:1000 희석), LC3(1:1000 희석), p62(1:1000 희석), β-actin(1:5000 희석)에 대한 1차 항체가 투여되었습니다. TBST로 세척한 후, 막을 HRP 결합 2차 항체와 1시간 동안 실온(1:5000 희석)에서 배양하였다. 단백질 밴드는 ECL 화학발광 기질을 사용하여 시각화하고 화학발광 이미징 시스템으로 포획하였습니다. 영상 분석 소프트웨어를 사용해 밴드 강도를 정량화하였다. 총 단백질 발현 수준은 β-악틴으로 정상화되었습니다. 보자료에는 고해상도 자르지 않은 서부 블롯 이미지가 포함되어 있었습니다.

통계 자료
통계 분석은 통계 분석과 그래프 생성 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 데이터는 도표 전례에 표시된 SD 평균± 표현되었습니다. 행동 검사와 이미지 정량화는 그룹 할당에 눈이 먼 조사관에 의해 수행되었습니다. 모리스 워터 미로 훈련 단계 동안의 탈출 잠복 시간은 그룹과 훈련일을 고려한 양측 반복 지표 ANOVA를 사용해 분석하였다. 프로브 시험 데이터, 조직학적 정량, 면역조직화학적 정량, 웨스턴 블롯 덴시토메트리는 일방향 ANOVA 검정을 사용해 분석하였다. 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었습니다. 표준 유의율 표기법은 다음과 같이 사용되었습니다: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 정확한 표본 크기는 해당 그림 전례에 보고되었습니다. 수컷과 암컷 쥐는 실험군에 고르게 분포했다. 그러나 연구가 성별 특이적 효과를 감지하도록 설계되거나 검증되지 않았기 때문에 성별 계층별 통계 분석은 수행되지 않았습니다. 이 제한은 토론 섹션에서 명시되어 있습니다.

결과

Aβ1-42 유도 AD와 유사 쥐에서 학습 및 기억력 저하 및 트립톨라이드 치료 후 부분적 개선

Aβ1-42 유도 AD와 유사한 마우스 모델을 구축하기 위해, 집집된 Aβ1-42를 C57BL/6J 마우스의 양측 측 뇌실에 입체형적으로 주입하였습니다. 모델 확립 후, 쥐는 차량, 트립톨라이드 또는 PI3K 억제제 LY294002과 함께 트립톨라이드를 투여했습니다. 공간 학습과 기억은 모리스 워터 미로를 사용해 평가되었습니다.

6일간의 장소 탐색 단계 동안, 모든 그룹에서 탈출 지연이 점차 감소했으며, 이는 쥐들이 반복적인 훈련을 통해 공간 학습 과제를 습득했음을 나타낸다(그림 1A). 그러나 Aβ1-42 유도 AD와 유사한 쥐는 특히 훈련 후반일에 대조군 쥐보다 일관되게 긴 탈출 지연을 보였으며, 이는 공간 학습 장애를 시사합니다. 트립톨라이드 처리는 Aβ1-42 유도 AD와 유사 모델군에 비해 탈출 잠복기를 단축시켰으나, LY294002 병용 치료는 이 개선을 약화시켰다. 이 결과는 트립톨라이드가 Aβ1-42로 인한 공간 학습 장애를 부분적으로 개선했으며, PI3K 억제에 의해 이 효과가 완화되었음을 시사합니다.

대표적인 수영 트랙은 이러한 행동 변화를 더욱 뒷받침했습니다(그림 1B). 대조군 쥐는 플랫폼 위치 주변에서 보다 직접적이고 표적 지향적인 탐색 패턴을 보인 반면, Aβ1-42 유도 AD형 쥐는 흩어지고 비효율적인 수영 경로를 보였습니다. 트립톨라이드 처리된 쥐는 탐색 행동이 개선되었고, 궤적은 목표 부위 주변에 더 집중되었습니다. 반면, LY294002와 트립톨라이드 치료를 받은 쥐는 트립톨라이드 단독 투여 그룹보다 탐색 효율이 떨어졌습니다. 플랫폼 제거 후 수행된 탐침 시험에서, Aβ1-42 유도 AD유사 쥐는 대조군 마우스보다 원래 플랫폼 위치를 통과하는 횟수가 적어 공간 기억 유지가 손상되었음을 나타냈다(그림 1C). 트립톨라이드 처리는 플랫폼 교차 횟수를 증가시켰고, LY294002 공동 처리는 이 효과를 줄였다. 마찬가지로, Aβ1-42 유도 AD와 유사 마우스는 대조군 마우스에 비해 표적 사분면에 머무는 시간 비율이 감소했고, 트립톨라이드 처리 후에는 증가했으며, LY294002 공동 처리 후에는 다시 감소했습니다(그림 1D).

이 행동 결과들은 양측 뇌실내 Aβ1-42 집집이 주입될 경우 생쥐에서 공간 학습 및 기억 결손을 유발함을 보여줍니다. 트립톨라이드는 이러한 행동 장애를 부분적으로 역전시키는 반면, LY294002 트립톨라이드의 보호 효과를 약화시켜 PI3K/Akt가 이 모델에서 관찰된 행동 효과에 기여할 수 있음을 시사한다.

Aβ1-42 주사는 해마 신경 손상과 Aβ 침착을 유발했으며, 이는 트립톨라이드에 의해 완화되었습니다

Aβ1-42에 의해 유도된 AD와 유사 병리학적 변화의 확립을 추가로 검증하고 트립톨라이드가 해마 손상에 미치는 영향을 평가하기 위해, 각 그룹의 뇌 절편에서 헤마톡실린과 에오신 염색 및 Aβ 면역조직화학적 검사가 수행되었습니다.

HE 염색 검사는 대조군의 뉴런이 조밀하고 규칙적으로 배열되어 있으며, 비교적 명확한 세포 형태와 핵 구조를 보였음을 보여주었다(그림 2A). 반면, Aβ1-42 유도된 AD와 유사한 쥐는 세포 배열의 무질서, 신경 밀도 감소, 핵 응축 증가가 특징인 명백한 해마 신경 손상을 보였다. 트립톨라이드 처리는 Aβ1-42 유도 모델군에 비해 해마 신경 형태를 부분적으로 개선했으며, 세포 배열이 더 보존되고 핵 피크노시스가 덜 뚜렷하게 드러났습니다. 그러나 LY294002 병행 치료군에 비해 트립톨라이드의 보호 효과가 약화되어 신경 조직 이상과 손상이 더 뚜렷하게 나타났습니다.

이후 해마 내 Aβ 침착을 평가하기 위해 Aβ 면역조직화학을 수행하였습니다(그림 2B). 대조군에서는 Aβ 양성 염색이 최소한으로 관찰된 반면, Aβ1-42 유도 AD와 유사한 모델 그룹에서는 갈색 Aβ 양성 신호가 현저히 증가했습니다. 트리프톨라이드 처리는 모델 그룹에 비해 Aβ 양성 염색을 감소시켜, 트립톨라이드가 이 모델에서 Aβ 침착을 완화함을 나타냅니다. 반면, LY294002 및 트립톨라이드 투여 마우스는 트리플톨라이드 단독 투여 마우스에 비해 Aβ 양성 염색이 증가하였습니다. 정량적 분석은 이러한 조직학적 관찰을 더욱 확인시켜 주었습니다. Aβ1-42 유도 AD와 유사 모델군은 대조군에 비해 각 미세한 영역의 총 세포 수에 대해 정규화되었고, 트립톨라이드 처리 후에는 감소했으며, LY294002 공동 치료 후에는 부분적으로 다시 증가했습니다(그림 2B).

이 결과는 Aβ1-42 주사가 해마 신경 손상과 Aβ 축적을 유발하는 반면, 트립톨라이드는 이러한 병리학적 변화를 부분적으로 완화했음을 시사한다. LY294002 공동 치료 후 관찰된 역전은 PI3K/Akt가 트립톨라이드의 보호 효과에 기여할 수 있음을 시사합니다.

트립톨라이드는 해마의 게피린과 콜리비스틴 발현을 복원하고 PI3K/Akt/GSK-3β 신호를 조절했습니다

행동 및 조직학적 변화가 억제성 시냅스 관련 단백질과 그 상류 조절 신호의 변화와 동반되는지 확인하기 위해, 각 그룹의 해마 용해액을 웨스턴 블롯팅으로 분석하였다. 대조군과 비교했을 때, Aβ1-42 유도된 ADS 유사 마우스는 해마 게피린 발현이 현저히 감소한 반면, 인산화된 게피린 수치는 증가했습니다(그림 3A). 트리프톨라이드 처리는 총 게피린 발현을 부분적으로 회복시키고 인산화된 게피린 수치를 감소시켰습니다. 반면, LY294002 공동 처리는 트립톨라이드의 효과를 약화시켰는데, 이는 트립톨라이드 처리군에 비해 게피린 발현이 감소하고 인산화된 게피린이 증가하는 것으로 나타났습니다. 이 결과는 Aβ1-42에 의한 병리가 해마 게피린 풍부도 감소뿐만 아니라 게피린 인산화 증가와도 연관되어 있으며, 트립톨라이드는 이러한 변화를 부분적으로 되돌렸음을 시사합니다.

콜리비스틴은 총 게피린과 유사한 발현 패턴을 보였습니다. Aβ1-42 유도 AD와 유사한 쥐는 대조군에 비해 해마 콜리비스틴 발현이 감소한 반면, 트립톨라이드 처리는 콜리비스틴 발현을 회복시켰습니다. LY294002 공동 치료는 이 효과를 부분적으로 되돌렸습니다(그림 3B). 이 발견들은 트립톨라이드가 해마 내 억제성 시냅스 관련 스캐폴딩 단백질의 발현을 보존했으며, 이 효과는 PI3K 억제에 의해 약화되었음을 시사한다. 이후 PI3K/Akt/GSK-3β 신호전달 경로를 조사하여 게피린 인산화의 분자 변화를 더욱 밝히기 위해 연구하였습니다. Aβ1-42 유도 AD와 유사 모델군에서는 PI3K 발현과 p-Akt 비율이 대조군에 비해 감소하여 PI3K/Akt의 신호 전달 활동 저하를 나타냈다(그림 3B). 모델군에서는 p-GSK-3β/GSK-3β 비율도 감소하였습니다. 억제 부위의 GSK-3β 인산화는 GSK-3β 활성 억제를 반영하므로, 이 감소는 Aβ1-42 유도 AD와 유사한 해마에서 GSK-3β 활성이 상대적으로 증가함을 시사합니다. 트리프톨라이드 처리는 PI3K 발현을 증가시키고, p-Akt 비율을 회복했으며, p-GSK-3β/GSK-3β 비율을 상승시켰습니다. 이러한 효과는 LY294002 공동 치료로 약화되었습니다.

이 결과들은 Aβ1-42에 의해 유도된 AD와 유사한 병리가 해마 게피린 및 콜리비스틴 발현 감소, 게피린 인산화 증가, 그리고 PI3K/Akt 매개 GSK-3β 억제성 인산화 장애와 관련이 있음을 시사한다. 트립톨라이드는 이러한 분자 변화를 부분적으로 역전시키는 반면, LY294002 트립톨라이드의 효과를 약화시켜 이 모델에서 해마 게피린과 콜리비스틴 조절에 PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달이 관여함을 지지했습니다.

트립톨라이드는 Aβ1-42 유도 AD와 유사한 쥐의 해마에서 자가포식 관련 단백질 이상을 완화시켰습니다

Aβ1-42에 의해 유도된 AD와 트립톨라이드 치료가 자가포식 관련 단백질 변화와 연관되는지 확인하기 위해, 해마 용해액에서 서부 블롯팅을 통해 LC3와 p62 발현을 조사하였다. 대조군과 비교했을 때, Aβ1-42 유도된 AD와 유사 마우스는 LC3-II/I 비율이 증가하여 자가포식체와 관련된 LC3-II 축적이 증가함을 나타냈다. 동시에 모델군에서도 p62 발현이 상승하여 해마 내 자가포식 관련 기질의 축적을 시사합니다. 트리프톨라이드 처리는 Aβ1-42 유도 AD와 유사 모델 그룹에 비해 LC3-II/I 비율과 p62 발현을 모두 감소시켰습니다. 이 결과는 트립톨라이드가 Aβ1-42에 의해 유도된 자가포식 관련 단백질의 비정상적인 축적을 완화했음을 나타냅니다. 반면, LY294002 공동 처리는 트립톨라이드 단독 치료에 비해 LC3-II/I 비율과 p62 발현을 증가시켜, PI3K 억제가 자가포식 관련 단백질 변화에 대한 트립톨라이드의 효과를 완화시킨 것으로 나타났다(그림 4).

전반적으로 대조군은 기저 행동, 조직학, 분자 프로필을 제공했으며, Aβ1-42 유도 AD와 유사 모델 그룹은 뇌실내 Aβ1-42 투여가 인지 장애, 해마 신경 손상, Aβ 침착, 억제성 시냅스 관련 단백질 감소, PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달 변화, 자가포식 관련 단백질 축적을 유발함을 확인하였습니다. Aβ1-42 유도 모델군과 트립톨라이드 처리 그룹의 비교 결과, 트립톨라이드는 이러한 이상을 부분적으로 되돌렸습니다. 트립톨라이드 처리군과 LY294002 및 트립톨라이드 공동 치료군 간의 비교에서는 PI3K 억제가 트립톨라이드의 효과를 완화한다는 점이 추가로 밝혀졌습니다. 이 결과들은 트립톨라이드가 PI3K/Akt/GSK-3β 관련 기전을 통해 Aβ1-42 유도 AD와 유사 모델에서 해마 게피린, 콜리비스틴 및 자가포식 관련 단백질의 변화를 조절한다는 작업 가설을 뒷받침합니다.

데이터 가용성:

이 연구 결과를 재현하는 데 필요한 모든 원시 데이터는 보충 파일 1 과 보충 파일 2로 제공됩니다. 여기에는 원본 서부 블롯 및 젤 이미지, 자르지 않은 블롯 데이터, 통계 분석에 사용된 원시 수치값, 그리고 생성된 그래프가 포함됩니다. (보조 파일 1 및 보조 파일 2) 이 파일들은 그림 1–4에 보고된 정량적 결과를 뒷받침하는 원시 데이터를 제공합니다.

그림 1: Triptolide는 Aβ1-42 유도 AD와 유사한 쥐에서 공간 학습 및 기억 결핍을 부분적으로 개선했습니다. (A) 모리스 워터 미로의 6일간 위치 내비게이션 단계 동안 탈출 지연. (B) 탐사 시험 중 대표적인 수영 궤적. (C) 승강장 철거 후 원래 승강장 위치 위의 건널목 수. (D) 탐사 시험 중 목표 사분면에서 머무는 시간의 비율. 데이터는 SD 평균± 제시됩니다. 탈출 지연은 양측 반복 측정 ANOVA로 분석되었고, 탐침 시험 데이터는 일방향 ANOVA 검정으로 분석되었습니다. 대조군; AD, Aβ1-42 유도 AD와 유사한 모델 그룹; TP, 트립톨라이드 처리 그룹; LY, LY294002 플립톨라이드 공동 치료군. n = 그룹당 6개. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 2: Aβ1-42 유도 AD와 유사 마우스에서 트립톨라이드가 해마 신경 손상과 Aβ 침착을 완화시켰다. (A) 각 그룹의 해마 절편에 대한 대표적인 헤마톡실린 및 에오신 염색 이미지. 스케일 바 = 50μm. (B) 해마 내 Aβ 양성 침착의 대표적인 Aβ 면역조직화학적 염색 이미지 및 정량적 분석. 스케일 바 = 50μm. 데이터는 평균 ± SD로 제시되었으며, 통계 분석은 일원 ANOVA 검정을 사용하여 수행되었습니다. 대조군; AD, Aβ1-42 유도 AD와 유사한 모델 그룹; TP, 트립톨라이드 처리 그룹; LY, LY294002 플립톨라이드 공동 치료군. n = 그룹당 3개. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 3: Triptolide는 Aβ1-42 유도 AD와 유사 마우스에서 해마 게피린과 콜리비스틴 발현을 복원하고 PI3K/Akt/GSK-3β 관련 신호 전달을 조절했습니다. (A) 각 그룹의 해마 용해액에서 총 게피린 및 인산화된 게피린 발현의 대표성 서부 블롯 이미지 및 정량 분석. (B) 해마 용해체에서 콜리비스틴, PI3K, Akt, 인산화 Akt, GSK-3β, 인산화된 GSK-3β의 대표적인 웨스턴 블롯 이미지 및 정량 분석. 콜리비스틴과 PI3K는 β-액틴으로 정규화되었다. 인산화된 Akt와 인산화된 GSK-3β는 각각 p-Akt/Akt와 p-GSK-3β/GSK-3β 비율로 정량되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 제시되었으며, 통계 분석은 일원 ANOVA 검정을 사용하여 수행되었습니다. 대조군; AD, Aβ1-42 유도 AD와 유사한 모델 그룹; TP, 트립톨라이드 처리 그룹; LY, LY294002 플립톨라이드 공동 치료군. n = 그룹당 3개. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

그림 4: Triptolide는 Aβ1-42 유도 AD와 유사한 마우스의 해마에서 자가포식 관련 단백질 이상을 완화시켰다. 각 그룹의 해마 용해액에서 LC3-I/II 및 p62 발현의 대표성 웨스턴 블롯 이미지와 정량적 분석. LC3-II/I 비율은 LC3-II 밴드 강도를 LC3-I 밴드 강도로 나누어 계산했으며, p62 발현은 β-액틴으로 정규화되었습니다. 데이터는 평균 ± SD로 제시되었으며, 통계 분석은 일원 ANOVA 검정을 사용하여 수행되었습니다. 대조군; AD, Aβ1-42 유도 AD와 유사한 모델 그룹; TP, 트립톨라이드 처리 그룹; LY, LY294002 플립톨라이드 공동 치료군. n = 그룹당 3개. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 1: 자르지 않은 서부 얼룩 이미지. 정량에 사용되는 밴드가 표시되어 있으며, 분자량 마커가 가능한 경우 표시됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

보조 파일 2: 이 문서에서 통계 분석에 사용되는 원시 수치값. 이 파일에는 그림 1–4의 정량 그래프 생성에 사용된 원시 수치 데이터셋이 포함되어 있으며, 여기에는 모리스 워터 미로 행동 측정, Aβ 면역조직화학 정량화, 웨스턴 블롯 덴시토메트리 값이 포함됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭해 주세요.

토론

본 연구의 중심 기전적 제안은 Aβ1-42가 유도하는 병리가 PI3K/Akt 신호를 억제하고, GSK-3β의 억제성 인산화를 감소시키며, Gephyrin 인산화를 촉진하고, 해마의 Gephyrin과 Collybistin 발현을 감소시키며, 자가포식 관련 단백질의 축적에 기여하는 반면, triptolide는 PI3K/Akt/GSK-3β 관련 경로를 통해 이러한 변화를 부분적으로 상쇄한다는 것입니다. 이 연구는 Aβ1-42에 의해 유도된 ADS 유사 병리가 공간 학습 및 기억 장애, 해마 신경 손상, Aβ 침착 증가, 게피린 및 콜리비스틴 발현 감소, 게피린 인산화 증가, PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달 변화, 자가포식 관련 단백질 축적을 동반함을 보여준다. 트립톨라이드는 이러한 행동적, 조직학적, 분자적 이상을 부분적으로 역전시키는 반면, LY294002 효과는 약화되었습니다. 이 발견들은 트립톨라이드가 PI3K/Akt/GSK-3β 매개 게피린 인산화 조절과 자가포식 관련 단백질 변화를 통해 해마 억제성 시냅스 관련 단백질을 적어도 부분적으로 보호한다는 모델을 뒷받침합니다. Aβ1-42 뇌실내주사 모델은 주로 Aβ 유발 신경독성과 AD와 유사 병리를 반영하며, 인간 AD²¹의 완전한 만성 다인성 진행과는 아니다.

게피린과 콜리비스틴은 억제성 시냅스 조직의 핵심 구성 요소입니다. 게피린은 억제성 신경전달물질 수용체를 시냅스 후 부위에 고정시키는 반면, 콜리비스틴은 게피린의 군집화와 막 위치화를 촉진합니다. 따라서 이들 단백질의 발현 감소는 억제성 시냅스 안정성을 방해하고 해마 네트워크 기능 장애에 기여할 수 있습니다⁸. 이 연구에서 Aβ1-42는 해마의 게피린과 콜리비스틴 발현을 감소시켰고, 트립톨라이드는 두 단백질 모두를 회복시켰습니다. 인산화된 게피린의 증가는 Gephyrin 손실의 그럴듯한 메커니즘을 제공하며, Ser270에서의 인산화가 Gephyrin 확산, 군집 감소, 단백질 불안정화와 연관되어 있습니다. GSK-3β의 PI3K 발현, Akt 인산화, 억제성 인산화의 병행 감소는 Aβ1-42가 PI3K/Akt 신호를 약화시키고 GSK-3β 활성을 증가시킬 수 있음을 시사하며, 이는 Gephyrin 인산화 증진과 일치합니다. 반면, 트립톨라이드는 Akt 인산화를 회복시키고 GSK-3β의 억제성 인산화를 증가시키며, 게피린 인산화를 감소시켰으나, LY294002 이 효과들을 약화시켰습니다. 이 결과는 트립톨라이드가 PI3K/Akt/GSK-3β 관련 게피린 인산화 조절을 통해 게피린과 콜리비스틴 발현을 보존할 수 있음을 시사합니다. 그러나 전체 해마 용해액이 사용되었기 때문에, 이러한 결과는 시냅스 위치 결정의 직접적인 증거보다는 해마 단백질 풍부도와 인산화의 변화를 반영한다^22,23.

자가포식 관련 이상도 이 모델에서 관찰되는 분자 변화에 기여할 수 있습니다. 자가포식은 신경세포 단백질 정상성에 중요하지만, AD에서 자가포식 저하가 발생하면 자가포식체와 병리적 단백질 기질이 축적될 수 있다^24,25. 본 연구에서 Aβ1-42는 LC3-II/I 비율과 p62 발현을 모두 증가시켜, 자가포식체 관련 LC3-II 및 자가포식 관련 기질의 축적을 시사하였다. 트립톨라이드는 두 마커 모두를 감소시켰고, LY294002 이 효과를 부분적으로 역전시켜, 트립톨라이드는 PI3K/Akt 의존적 기전을 통해 자가포식 관련 단백질 축적을 완화할 수 있음을 시사합니다. 게피린, 콜리비스틴, PI3K/Akt/GSK-3β 신호 전달의 변화와 함께, 이러한 발견은 트립톨라이드의 신경보호 효과에 대한 이해를 항염증 또는 일반적인 신경 보호 작용을 넘어 확장시켜, 트립톨라이드가 억제성 시냅스 관련 스캐폴딩 단백질, 키나제 신호전달, 단백질 정상성 관련 경로에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다²⁶.

이 프로토콜의 성공과 재현성을 결정하는 여러 중요한 단계가 있습니다. 첫째, Aβ1-42의 응집 상태는 주사 전에 신중히 조절하고 확인해야 하는데, 펩타이드 준비는 병리학적 결과에 강한 영향을 미칠 수 있기 때문입니다. 둘째, 측심실에 정확한 입체 주입이 필수적입니다; 역류, 잘못된 바늘 삽입, 과도한 주사 속도는 변동성 있는 Aβ 노출과 일관성 없는 행동 또는 조직학적 결과를 초래할 수 있습니다. 셋째, 모리스 수중 미로 테스트는 운동 장애를 교란 요인으로 배제하기 위해 안정적인 시각적 단서, 일정한 수온 수온, 수영 속도 모니터링이 필요합니다. 넷째, 조직학적 및 면역조직화학적 정량화는 미리 정의된 관심 해마 영역과 맹인 분석을 사용하여 수행되어야 합니다. 마지막으로, Western 블롯 결과는 균등한 단백질 로딩, 적절한 겔 농도, 효율적인 전송, 그리고 밴드 특이성을 확인하기 위한 자르지 않은 블롯 이미지 사용에 의존합니다.

몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 첫째, Aβ1-42 주사 모델은 인간 AD의 만성 진행, 타우 병리, 혈관 변화, 신경면역 복잡성을 재현하지 못합니다. 둘째, 수컷과 암컷 쥐가 그룹 간에 균등하게 분포했음에도 불구하고, 이 연구는 성별 층별 분석에 대해 근원도를 제공하지 않았습니다²⁷. 셋째, 전체 해마 용해액은 게피린과 콜리비스틴의 변화가 억제성 시냅스에서 특정적으로 일어나는지 여부를 결정할 수 없습니다. 넷째, 제안된 PI3K/Akt/GSK-3β–게피린 메커니즘은 GSK-3β 활성과 Gephyrin Ser270 인산화가 직접적으로 조작되지 않아 연합성으로 남아 있습니다. 마지막으로, LC3-II/I와 p62는 정적인 웨스턴 블롯 판독값으로, 동적 자가포식 플럭스를 완전히 정의할 수 없습니다. 향후 연구에서는 시냅스좀 분획, 억제성 시냅스 후 표지자와의 면역형광 공동 위치, GSK-3β 기능 증가 또는 상실 접근법, Gephyrin Ser270 돌연변이 구조체, 그리고 리소좀 억제제 기반 플럭스 분석법을 사용해야 합니다. 만성 형질전환 AD(알츠병) 모델, 타우 관련 모델, 인간 유래 신경 시스템 등에서의 검증도 이 경로가 AD 병리학과 널리 관련이 있는지 여부를 판단할 필요가 있습니다¹⁴. 또 다른 한계는 입체주입에 사용되는 정확한 Aβ1-42 준비물의 집적 상태가 티오프플라빈 T 형광, SDS-PAGE/웨스턴 블롯팅, 투과 전자현미경으로 독립적으로 검증되지 않았다는 점입니다. 펩타이드는 Aβ1-42 응집을 촉진하는 데 일반적으로 사용되는 37°C 장시간 배양 절차를 통해 제조되었으나, 배치마다 응집 상태의 차이가 병리학적 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 향후 연구에서는 만성 형질전환 AD(트랜스유니얼 AD) 모델, 타우 관련 모델, 인간 유래 신경 시스템에서 이러한 워크플로우를 검증할 것으로 기대됩니다. 추가 실험에는 Aβ1-42 응집 상태 직접 검증, 염료 또는 해부학적 검증을 이용한 입체주입 정확도 평가, 시냅스체분획, 억제성 시냅스 후 표지자와의 면역형광 공동 위치, GSK-3β 기능 증가 또는 상실 접근법, Gephyrin Ser270 돌연변이 실험, 그리고 리소좀 억제제 기반 자가포식 플럭스 분석이 포함되어야 합니다. 트립톨라이드의 용량-반응 및 안전성 연구도 중개 적용을 고려하기 전에 필요합니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Anti-Gephyrin 항체	12681	Peoteintech	전체 Gephyrin의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-phosphorylated-Gephyrin  항체	147011	Synaptic Systems	인산화된 Gephyrin의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-Collybistin 항체	ab316963	abcam	Collybistin의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-PI3K 항체	27921	Peoteintech	PI3K의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-Akt 항체	9272	Cell Signaling Technology	전체 Akt의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-phosphorylated Akt 항체	4060	Cell Signaling Technology	인산화된 Akt의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-GSK-3β 항체	12456	Cell Signaling Technology	전체 GSK-3β의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-phosphorylated GSK-3β 항체	5558	Cell Signaling Technology	인산화된 GSK-3β의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-β actin 항체	66009	Peoteintech	웨스턴 블롯 정규화를 위한 로딩 컨트롤 항체.
Anti-LC3 항체	11972	Cell Signaling Technology	LC3-I 및 LC3-II의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-p62 항체	5114	Cell Signaling Technology	p62/SQSTM1의 웨스턴 블롯 검출을 위한 일차 항체.
Anti-Aβ1-42 항체	ab150155	abcam	Aβ1-42를 검출하기 위한 일차 항체.
HRP-conjugated 보조 항체 (anti-mouse IgG)	7076S	Cell Signaling Technology	웨스턴 블로팅에서 마우스 일차 항체용 보조 항체.
HRP-conjugated 보조 항체 (anti-rabbit IgG)	7074S	Cell Signaling Technology	웨스턴 블로팅에서 토끼 일차 항체용 보조 항체.
Anti-Aβ 항체	GT622,	Invitrogen,	Aβ 면역조직화학을 위한 일차 항체.
Aβ1-42	9001	상해 두마 테크놀로지 유한공사	집합체 유도 주사 용액을 준비하는 데 사용되는 아밀로이드-β 펩타이드.
triptolide	BD9097	상해 바이드 제약.	복강 내 투여되는 시험 화합물.
LY294002	ab120243	abcam	공동 치료군에 사용된 PI3K 억제제.
파라포르말데히드	P0099	Beyotime	경흉 관내 순환 및 조직 후 고정을 위한 고정제.
자일렌	108298	Merck	탈지 및 조직 청결 시약.
에탄올	100983	Merck	파라핀 절편의 재수화 및 탈수 시약.
프로필렌글리콜	294004	Merck	약물 용액 준비를 위한 베히클 구성 요소.
단백질 및 인산화효소 억제제	P1045	Beyotime	단백질 및 인산화 상태를 보존하기 위해 사용되는 용해 버퍼 첨가제.
RIPA 용해 버퍼	P0013	Beyotime	해마 조직에서 전체 단백질을 추출하기 위한 용해 버퍼.
EDTA 항원 회수 버퍼	ab93680	abcam	면역조직화학을 위한 열 매개 항원 회수 버퍼.
펜토바르비탈 나트륨	P3761	Sigma	수술 및 조직 수집에 사용되는 마취제.
염소 혈청	ZLI-9056	ZSGB-BIO	면역조직화학을 위한 차단제.
PVDF 멤브레인	ISEQ00010	Merck Millipore	웨스턴 블롯 전달에 사용되는 멤브레인.
모리스 수상 미로	VX80	상해 신루안 정보 기술 유한공사	공간 학습 및 기억 평가를 위한 행동 장치 및 비디오 추적 시스템.
화학 발광 이미징 시스템	Doc™ XR+ 1708195	Bio-rad	화학 발광 웨스턴 블롯 신호 획