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방법 논문

생체 내 쥐의 사회적 행동 이해를 위한 시상하부 내 소형 현미경으로 칼슘 영상 촬영

992 조회수

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DOI:

10.3791/70401

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2026년 3월 20일

 ,  ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 사회적 상태 조작(사회적 고립 및 사회적 재결합) 중 마우스의 소형화된 현미경(미니스코프)을 이용한 시상하부 신경세포의 생체 내 칼슘 이미징을 상세히 다룹니다. 이 방법은 사회적 욕구와 사회적 포만을 나타내는 시상하부 활동을 단일 뉴런 해상도로 영상화할 수 있게 하여 사회적 항상성의 기전적 연구를 가능하게 합니다.

초록

척추동물의 사회적 행동은 시상하부 회로를 통해 엄격히 조절됩니다. 분자적으로 정의된 시상하부 신경세포 유형이 최근 항상성 방식으로 사회적 필요를 암호화하는 것으로 확인되었습니다. 여기서는 자유롭게 행동하는 쥐를 대상으로 헤드 마운트형 미니어처 현미경(미니스코프)을 사용하여 시상하부 내측 전시핵(MPN)에서 생 체 내 칼슘 이미징을 수행하는 단계별 프로토콜을 설명합니다. 이 방법은 사회적 고립과 재결합 기간 동안 신경세포 집단 역학을 종단적으로 기록할 수 있게 하여, 단일 뉴런 해상도에서 사회적 필요와 사회적 포만감을 기전적으로 연구할 수 있게 합니다. 구체적으로, 성체 쥐는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)의 입체 주입을 받은 후, 경배 지수(GRIN) 수정체와 미니스코프 베이스플레이트를 이식합니다. 회복 후 쥐는 미니스코프 영상 환경에 익숙해지고, 정기적인 사회적 격리와 재회를 통해 신경 활동을 영상화합니다. 칼슘 신호는 동물 행동과 동기화되어 추가 분석에 사용됩니다. 이 프로토콜은 사회적 행동 중 마우스 시상하부에서 미니스코프를 이용한 생 체 내 칼슘 영상 촬영에 대한 포괄적인 지침을 제공합니다. 다른 심부 뇌 영역과 다양한 행동 맥락에서 영상 촬영에 쉽게 적응할 수 있습니다. 이 접근법은 세포 수준의 신경 활동과 사회적 행동을 연결하여, 자유롭게 움직이는 동물의 복잡한 행동에 대한 신경 기초에 대한 이해를 진전시킵니다.

서론

사회적 유대를 유지하는 능력은 동물 생존에 근본적이다 1,2,3. 장기간의 사회적 고립은 불안, 인지 장애, 대사 변화를 유발하는 반면, 재회는 사회적 참여와 사회적 욕구를 회복시킵니다 4,5,6. 단기 사회적 고립 후 사회적 행동의 반등은 항상성 메커니즘7의 존재를 시사하며, 이는 배고픔 8,9 또는 갈증 10,11,12의 조절과 유사하다. 그러나 사회적 항상성을 매개하는 신경 기질은 아직 잘 이해되지 않고 있습니다.

최근 연구는 서로 다른 시상하부 신경 집단이 각각 사회적 필요와 사회적 포만을 암호화한다는 사실을 밝혀냈습니다7. 생체 내 칼슘 영상 검사에 따르면, 내측 전시핵(MPN) 내 유전적으로 정의된 글루타마이트 뉴런 집단은 격리 중에 활성화되는 반면(MPN분리 뉴런), 다른 GABA 신경성 뉴런 집단은 재결합 시 활성화됩니다(MPN재결합 뉴런). MPN분리 뉴런의 광유전학적 활성화는 사회적 고립 상태를 모방하며, MPN재결합 뉴런의 광유전학적 활성화는 사회적 반동을 약화시켜 사회적 욕구 조절에서 상반되는 역할을 시사합니다. 이 집단들은 상호작용하며 뇌 전체의 신경 회로와 연결되어, 사회적 욕구를 동적으로 조절하는 피드백 루프를 형성합니다.

여기서는 연구자들이 사회적 고립과 재회와 같은 윤리학적으로 중요한 사회적 행동 중 자유롭게 움직이는 쥐에서 단일 뉴런 해상도로 심부 뇌 칼슘 역학을 기록할 수 있도록 하는 상세한 프로토콜을 제시합니다13. 이 영상 기법과 동물행동학적으로 관련된 사회 패러다임의 결합은 서로 다른 사회 상태의 신경 표상을 조사할 수 있는 전례 없는 기회를 제공합니다. 이 적응된 방법을 개발한 근거는 사회적 욕구와 포만감이 MPN과 같은 심부 뇌 구조에서 어떻게 역동적으로 표현되는지 시각화할 필요가 있기 때문입니다. 미니스코프 사용은 이전에 14,15,16에서 설명되었지만, 특히 격리와 재회 사이의 전환이 포함된 자유로운 사회적 상호작용 시 광학 안정성을 유지하고 움직임 아티팩트를 최소화하며 자연스러운 행동 표현을 보장하기 위해 특정 기술적·행동적 적응이 필요합니다.

섬유 광도계와 비교할 때, 미니스코프 기반 접근법은 세포 해상도를 제공하여 동일 영역 내에서 서로 다른 기능적 뉴런 유형을 구별할 수 있게 합니다. 이 기술은 자유롭게 상호작용하는 동물들의 장기 기록을 가능하게 하여, 사회적 신경 역학을 연구하는 데 필수적입니다. 이전에 단일 광자 미세내시경을 사용한 연구들은 주로 공간적 또는 감각 작업 중 피질이나 등쪽 해마에 초점을 맞췄습니다14, 15, 16. 우리 프로토콜은 이러한 진보를 복잡한 사회적 행동 중 더 깊은 피질 하부 영역으로 확장하여, 자연적 조건에서 정서 상태 회로를 조사할 수 있는 템플릿을 제공합니다.

이 프로토콜은 GRIN 렌즈 이식과 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용하여 최대 ~5mm 깊이의 뇌 영역에 최적화되어 있습니다. 주요 고려 사항은 수술의 정밀도, 렌즈 배치, 행동 패러다임 설계 및 관련 데이터 분석입니다. 이 방법은 다른 심부 뇌 영역과 행동 맥락에도 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 수술 준비, 바이러스 전달, 수정체 이식, 행동 설계, 미니스코프 부착, 영상 검사, 데이터 분석 등 모든 중요한 단계를 안내합니다(그림 1A-E). 이 접근하기 쉽고 상세한 워크플로우가 광범위한 자연주의적 행동 전반에 걸쳐 심뇌 신경 집단을 연구하는 데 힘을 실어줄 것으로 기대합니다.

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프로토콜

모든 절차는 웨스트레이크 대학교 동물 윤리 위원회의 동물 프로토콜 #25-076-LD-9로 승인되었습니다. 모든 실험은 웨스트레이크 대학교 실험동물자원 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜에서 사용되는 모든 장비와 재료 는 재료표에 나열되어 있습니다.

1. 바이러스 주사 수술

  1. 쥐를 2-3% 이소플루란이 섞인 마취 유도 챔버에 넣습니다.
    참고: 마취 유도의 성공은 발가락 꼬집는 반사가 없고 안정적이고 깊은 호흡이 있어야 합니다.
  2. 2-3분 후, 또는 교정 반사가 사라진 후 동물을 신속히 입체 측정 기구로 옮깁니다. 코를 마취 코 콘에 고정하고 수술 기간 동안 1-1.5% 이소플루란으로 마취를 유지하세요(그림 1B). 산소 유량은 일반적으로 0.8-1.2 L/분 사이로 설정됩니다.
    참고: 동물의 호흡 수와 기타 생리적 징후를 모니터링하세요. 동물의 호흡수가 증가하고 수염이 나거나 다른 깨어나는 징후가 보인다면, 이소플루란 농도를 2-3%로 늘려야 합니다.
  3. 입체 탐지 기기의 앞니 막대를 통해 쥐의 앞니 이빨을 고정하세요. 머리를 고정하려면 노즈 클램프를 조이세요.
  4. 외청관에 두 개의 귀바를 조심스럽게 삽입하여 안정적이고 단단한 머리 고정을 보장합니다(그림 1B).
    참고: (1) 목 조직을 압박하는 부적절한 위치는 호흡 곤란이나 불안정한 고정을 유발할 수 있습니다. (2) 동물이 고정 시 호흡이 힘들거나 저항하는 징후가 보이면, 즉시 귀 봉을 놓고 재위치시키는데, 이는 기도 압박 가능성을 시사합니다. (3) 양쪽 귀 바가 같은 높이에 있도록 하세요. 이는 이후 두개골의 정밀 평탄화에 필수적입니다.
  5. 쥐의 양쪽 눈에 안과 연고를 바르면 눈이 건조해지는 것을 막으세요.
  6. 제모 크림을 사용해 머리 털을 제거하세요. 75% 에탄올 물티슈로 해당 부위를 꼼꼼히 닦아 잔여 크림과 머리카락을 제거하세요.
  7. 노출된 피부는 75% 에탄올 물티슈와 베타딘으로 소독하세요. 가위 가위로 두피를 가로지르는 중앙선 시상석 절개를 합니다. 피부를 당겨 두개골이 목표 뇌 부위에 완전히 노출되도록 하세요. 면봉으로 두개골 표면을 부드럽게 닦아 골막을 제거하세요.
    참고: 치아 시멘트의 견고한 고정점을 제공해 임플란트의 장기적인 안정성을 보장하기 위해 두개골의 충분히 넓은 면적을 노출하는 것이 필요합니다.
  8. 유리 피펫을 입체 피펫에 장착해 두개골 표면 측정을 하세요. 입체 현미경 아래에서 피펫 팁을 브레그마(시상선과 관상선의 교차점)에 위치시키고 원점으로 설정합니다(X = 0, Y = 0, Z = 0, 그림 1C).
  9. 피펫 팁을 브레그마에서 측면 ±2mm 위치로 옮기고, 두개골 높이를 두 지점 사이의 높이 차이가 ±0.03 mm 이내로 맞출 때까지 조절하세요.
  10. 그 후 피펫을 램다(시상선과 램도이드 봉합선의 교차점)로 옮기고, 전후면 기울기를 브레그마와 람다 사이의 높이 차이가 ±0.03 mm 이내로 맞출 때까지 조정합니다(그림 1C).
    참고: (1) 두개골의 사전 시각적 평가와 조정은 미세한 평탄화 과정을 크게 간소화할 수 있습니다. (2) 평탄화 전에 압축 공기로 두개골 표면을 건조하면 두개골 봉합선의 가시성이 향상됩니다.
  11. 0.8mm 드릴 헤드가 달린 휴대용 드릴을 사용해 목표 뇌 부위에 두개골 절개술을 하세요(예: C57BL6/J 마우스). 좌표는 전후(AP) 0 mm, 내측-외측(ML) 0.3 mm, 등복부(DV) -4.8 mm에 위치하여 MPN 영역을 목표로 합니다; FVB/NJ 마우스의 경우, 두개골 절개술은 AP +0.4 mm-+0.5 mm, ML 0.3 mm, DV -4.8 mm에서 이루어집니다(그림 1C).
    참고: 출혈 시 일시적으로 이소플루란 농도를 2-2.5%로 증가시키세요. 멸균용 면 팁이나 지혈 스펀지를 사용해 혈액을 흡수한 후 즉시 멸균 식염수를 바르세요. 지혈 후 이소플루란을 유지 수준(1-1.5%)으로 되돌리고 과도한 체액을 제거하세요.
  12. 두개골 절개 수술 후, 표적 뇌 영역에 칼슘 지표를 발현하는 바이러스를 입체주사합니다.
  13. 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 뉴런에서 발현하고 칼슘 신호를 통한 신경 활동 영상화를 가능하게 하는 아데노 관련 바이러스인 AAV-hSyn-jGCaMP7f를 최종 약 5 × 10¹² 바이러스 게놈/밀리리터 수준의 최종 역가로 희석하여 주입합니다.
  14. 먼저 유리 피펫에 미네랄 오일을 채운 뒤, 바이러스 용액을 채워 공기 방울이 없도록 하세요. 피펫을 두개골 표면의 목표 좌표에 위치시키고 천천히 목표 깊이까지 내립니다.
  15. 바이러스를 느리고 일정한 속도(예: 분당 30 nL)로 단방으로 주입하여 총 부피 400 nL7로 투여하여 MPN 영역에 충분한 뉴런을 감염시키도록 합니다. 이 양은 뇌 영역의 특정 크기와 Cre-loxP 시스템과 같은 추가 제약 조건 존재 여부에 따라 조정할 수 있습니다.
  16. 완료 후에는 피펫을 10-15분간 그대로 두어 바이러스가 충분히 확산되고 주사 경로를 따라 역류를 최소화한 후 천천히 빼내세요.
    참고: (1) 적절하고 일관된 역가를 가진 바이러스 알리코트는 동물 간 발현에 매우 중요합니다. 지나치게 높은 역가는 신경독성을 유발할 수 있으며, 부족하면 발현이 약해지고 영상 촬영에서 신호 대 잡음비가 낮아집니다. (2) 느린 주입 속도와 피펫 추출 전 충분한 대기 시간이 조직 손상을 최소화하고 바이러스 역류를 예방하여 표적 부위에 정확하고 견고한 바이러스 발현을 보장하는 데 매우 중요합니다.
  17. 바이러스 주사 후에는 두개골 위 피부를 흡수성 봉합사로 꿰매세요.
  18. 수술 직후 즉시 카프로펜(5 mg/kg)을 피하 주사하여 진통을 시행하고, 이후 3일간 계속 모니터링하고 필요에 따라 추가 투여를 합니다.
  19. 바이러스 주사 수술 후 최소 2-3주간 개별적으로 보관하여 충분한 동물 회복과 바이러스 발현을 돕습니다.
    참고: GRIN 렌즈 이식(섹션 2)은 바이러스 주사 당일 또는 바이러스 주사 후 2-3주 후에 시행할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 실험자가 GRIN 렌즈 이식 중 바이러스 발현을 평가할 수 있는 2단계 방법에 대해 설명합니다.

2. GRIN 렌즈 이식

  1. 두개절술을 다시 열기 위해 1.1-1.10 단계를 반복하세요. 2.8단계에서 치아 시멘트를 더 잘 잡기 위해 메스로 두개골 표면을 긁어보세요. 새로운 개골 절개술에서는 GRIN 렌즈보다 직경이 약간 더 커야 하며(보통 ~1mm 정도) 원활한 착상이 가능합니다. 드릴링 후에는 뼈 잔해를 꼼꼼히 제거하세요.
  2. GRIN 렌즈 이식 시 조직 압박을 완화하기 위해 유리 피펫을 목표 뇌 부위에 삽입하고 천천히 중간 측면으로 움직여 절개를 만듭니다. 이 마이크로 컷은 길이 ~1mm로 GRIN 렌즈 이식 공간을 만듭니다(그림 2A).
    참고: 이 단계는 전체 프로토콜의 성공에 매우 중요합니다.
  3. GRIN 렌즈를 삽입하기 전에 75% 에탄올로 렌즈를 소독한 후 멸균 생리식염수로 세척한 후 렌즈 조직으로 부드럽게 닦아주세요.
  4. GRIN 렌즈를 렌즈 홀더로 잡고 미니스코프를 렌즈 상단에 부착하세요.
  5. 전체 조립체를 브레그마에 위치시키고 모든 좌표를 0으로 설정합니다(즉, X = 0, Y = 0, Z = 0). 그 다음, 두개골 절개술 위 목표 X-Y 좌표에 위치시킵니다.
  6. 두개골 표면을 멸균 식염수로 적셔주세요. GRIN 렌즈를 약 분당 100 μm의 속도로 매우 천천히 뇌 조직 안으로 내리면서 목표물에 도달합니다(그림 2B).
    참고: (1) 바이러스 주입 후 2-3주 후에 GRIN 렌즈 삽입이 이루어질 경우, 삽입 시 미니스코프를 켜서 실시간 형광 변화를 관찰하세요. 렌즈가 목표 영역에 가까워질수록 시야 내 전체 형광 신호가 밝아지며, 이 변화는 영상 소프트웨어를 통해 신호 히스토그램에서 실시간으로 직접 읽을 수 있습니다(그림 2C, D). (2) 착상 시 출혈을 피해야 하며, 혈전은 신호 품질을 크게 저하시킵니다. (3) 출혈이 불가피하고 심할 경우, GRIN 렌즈를 제거하고 수정체를 세척한 후 출혈이 멈춘 후 다시 이식합니다.
  7. 수정체 이식 후에는 잔여 액체를 흡수하고 압축 공기로 불어 두개골 표면을 완전히 건조시킵니다.
  8. GRIN 렌즈 베이스를 두개골에 고정시키기 위해 치과 시멘트를 조심스럽게 발라주고, 노출된 두개골을 덮는 완전한 머리캡을 만듭니다(그림 2B). 시멘트가 주변 근육 조직과 접촉하지 않도록 주의하세요. 그 다음 렌즈 홀더를 조심스럽게 풀고 홀더와 미니스코프를 함께 분리하세요.
    참고: (1) 냉정한 슬래브에 치아 시멘트를 얼음 위에 섞어 굳어지는 과정을 늦추고 작업 시간을 늘리세요. (2) 미니스코프 연결 시 마우스를 고정하기 위해 렌즈 뒤에 헤드 바를 추가하는 것이 권장됩니다. (3) 렌즈 홀더나 미니스코프에 시멘트를 바르지 않도록 매우 조심해야 합니다.
  9. 두 액형 실리콘 접착제를 두 액체를 섞어 준비하세요. GRIN 렌즈 상단에 발라주어 회수 기간 동안 먼지와 긁힘으로부터 보호하는 밀봉 역할을 합니다.
  10. GRIN 렌즈 이식 후에는 회복 중 케이지 동료들이 수정체에 손상을 줄 수 있도록 쥐를 개별적으로 보관하세요.

3. 베이스플레이트 설치

  1. GRIN 렌즈 이식 후 2주에서 3주 후에 베이스플레이트 설치가 이루어집니다. 위에서 설명한 대로 입체흡입 기구에서 쥐를 마취하고 고정하세요.
  2. GRIN 렌즈 상단의 실리콘 씰을 제거하고 렌즈 표면을 렌즈 휴지 조각으로 부드럽게 닦으세요.
  3. 베이스플레이트를 미니스코프에 부착하세요. 전체 현미경-베이스플레이트 조립체를 홀더를 통해 입체 조작기 암에 장착하세요.
  4. 미니스코프를 데이터 수집 박스에 연결하고 실시간 영상을 켜세요.
  5. 미니스코프와 GRIN 렌즈 간의 정확한 광학 동축 정렬을 위해 매뉴퓰레이터를 미세하게 조정하여 미니스코프 대물렌즈와 이식된 GRIN 렌즈를 정렬합니다.
  6. 미니스코프 대물렌즈를 GRIN 렌즈 상단과 평행하게 위치시키고, 전체 GRIN 렌즈의 테두리가 완벽한 원형으로 영상 창에 포함되고, 렌즈 중심이 영상 창의 중심에 있도록 하세요.
  7. 미니스코프를 최적의 작동 거리로 낮춰 목표 초점면에서 뉴런의 선명한 이미지를 얻으세요.
  8. 치과 시멘트를 사용해 베이스플레이트를 기존 시멘트 캡에 연결하고 캡슐화하세요(그림 2B).
    참고: (1) 최종 고정 전에 미니스코프를 경험적으로 약 50-100 μm만큼 올려 고체 과정에서 발생하는 시멘트 수축으로 인한 초점면 이동을 보상하는 것이 중요합니다. (2) 베이스플레이트 설치 후 분리할 미니스코프 부품에 치과 시멘트가 닿지 않도록 매우 주의해야 합니다.
  9. 치과용 시멘트가 완전히 굳어진 후에는 홀더를 느슨하게 하고, 현미경을 베이스플레이트에서 조심스럽게 분리한 뒤, 즉시 베이스플레이트에 캡을 고정해 광학 인터페이스를 보호하세요.
  10. 베이스플레이트 설치 후 3-5일간 개별적으로 쥐를 보관한 후, 사회적 상태 조작(예: 사회적 격리)을 시작하기 전 최소 1주일간 우리 동료들과 다시 만나게 하세요.

4. 습관 화 및 영상 매개변수 설정

  1. 이식된 쥐는 미니스코프 부착을 위해 임시 머리 고정대에 익숙해지고, 정식 영상 촬영 전에 2-3번 영상 장비에 적응시키세요.
  2. 미니스코프를 베이스플레이트에 장착하려면 이식된 마우스의 머리를 고정하고, 베이스플레이트 캡을 제거한 뒤, 자석 인터페이스를 통해 미니스코프를 베이스플레이트에 도킹하세요. 그다음 옆 나사를 조여 미니스코프를 고정하세요. 동물이 기록 공간이나 케이지 안에서 자유롭게 움직이는 동안 10분간 칼슘 영상 촬영을 수행합니다.
  3. 이 파일럿 영상 세션 중에 부드러운 터치와 새로운 마우스 같은 자극을 도입하세요. 데이터를 분석하여 단일 뉴런 신호를 추출할 수 있는지 확인하라(섹션 6의 세부 사항 참조). 습관 과정 중에는 미니스코프 초점면을 작동 거리 전체에 걸쳐 조정하여 관찰되는 뉴런 수와 이미지 선명도를 극대화하여 최적의 영상 설정을 결정합니다.
  4. 조명 파워는 최대 값의 ~10%로, 센서 이득은 최대 값의 ~10-20%로 설정하여 포화 없이 선명한 신호를 얻으세요. 1280 x 800 공간 해상도와 20Hz 샘플링 속도로 촬영. 각 동물별로 이 설정을 저장하고 다음 영상 촬영 시 재사용하세요.

5. 미니스코프 칼슘 영상을 위한 사회적 행동 검사

  1. 사회적 재결합 분석 (그림 3A)
    1. 영상 촬영 1일, 3일 또는 5일 동안 미니스코프에 이식된 쥐를 격리하세요. 기저 검사, 재결합 및 재격리 시 칼슘 영상을 수행하세요.
    2. 기준선: 마우스를 미니스코프에 연결하고 10분 동안 마우스를 격리한 상태로 기록합니다.
    3. 재결합: 전 동료를 녹음실에 추가해 10분간 녹음한다.
    4. 재분리: 10분 재결합 후 카제메이트를 제거하고, 재분리 기간 동안 10분 더 영상을 찍습니다.
  2. 사회적 고립 검사 (그림 3B)
    1. 미니스코프에 이식된 쥐를 6시간 격리하고, 매 시간 시작 시 15분간 칼슘 신호를 기록하세요.
    2. 기록 챔버에 이전 카제메이트를 추가하고, 전체 영상 세션 종료 후 10분간 기록하여 사회적 재결합에 의해 유의미하게 조절되는 뉴런을 식별합니다(자세한 내용은 6절과 7절 참조).
      참고: (1) 이 특정 영상 일정은 신호 광표백을 최소화하고 사회적 격리 첫 6시간 동안 신경 활동을 모니터링할 수 있도록 하기 위해 사용됩니다. (2) 미니스코프는 전체 절차 전반에 걸쳐 연결되어 있습니다. (3) 이 접근법은 동일한 뉴런 앙상블을 전체 영상 세션 동안 추적할 수 있게 합니다. (4) 영상 촬영 시 식품과 하이드로겔이 제공됩니다.

6. 데이터 전처리

  1. 원본 영상 영상을 데이터 처리 소프트웨어로 가져오세요.
  2. 데이터 분석 시 계산 부하를 줄이기 위해 필요 시 원본 비디오를 공간적·시간적으로 다운샘플링합니다.
    참고: 이 분석을 위해 원시 영상 데이터는 1280 x 800 공간 해상도, 20Hz로 캡처됩니다; 공간적으로 4배 다운샘플링하고, 시간적으로 2배 다운샘플링합니다.
  3. 전역 평균 뺄셈을 적용한 공간 밴드패스 필터를 적용하여 고주파 잡음과 저주파 배경 드리프트를 줄이세요.
  4. 데이터 처리 소프트웨어의 모션 보정 알고리즘을 사용하여 모션 아티팩트를 수정합니다. 모션 보정된 영화를 시각적으로 점검하여 안정적인 신경 세포 소마타와 잔여 운동 아티팩트가 최소화되는지 확인하세요.
  5. "세포 식별" 버튼을 클릭하고 목록에서 "CNMFe"를 선택하여 CNMF-E17 (미세내시경 데이터에 대한 제한 있는 비음의 행렬 인수화) 알고리즘으로 개별 뉴런의 칼슘 활동 흔적을 추출하세요.
  6. 데이터 처리 소프트웨어에서 자 버튼을 클릭해 대표 뉴런의 소마 직경(픽셀 단위)을 측정하세요. "평균 셀 직경(픽셀)" 박스에 평균 크기를 입력하세요. 그 다음 적용 버튼을 눌러 CNMF-E를 실행하세요.
  7. 세포 검출이 불충분하거나, 과도한 비세포 성분이 나타나거나, 과도한 분할이 발생할 경우 CNMF-E 초기화 설정을 조정합니다.
  8. 추출된 모든 성분을 검사하고 세포 형태와 생물학적으로 그럴듯한 칼슘 역학에 따라 수용/거부하세요. 불규칙하거나 뾰족한 형태의 부품은 제외하세요. 노이즈나 움직임 유물이 우세한 흔적은 배제하세요.
    참고: (1) 그림 2E 와 2F 는 명확한 형태와 전형적인 칼슘 과도기를 가진 두 개의 인정된 뉴런을 보여줍니다. (2) 그림 2G 와 2H 는 뚜렷한 기저선 변동과 전형적인 칼슘 과도성이 없는 두 개의 거부된 뉴런을 보여줍니다.
  9. 사회 상태 조절 뉴런의 하위 식별을 위해 데이터 처리 소프트웨어에서 승인된 뉴런의 형광 추적을 내보내는 것(섹션 7).

7. 사회 상태 조절 뉴런 식별

  1. MATLAB이나 파이썬을 사용해 전처리 데이터를 더 분석하세요.
  2. 수용된 뉴런의 칼슘 활동 미량을 행동 타임스탬프에 정렬합니다.
  3. 행동 영상에서 사회적 재회 시점을 찾아보세요. 각 뉴런에 대해 활동을 재결합 전 사회적 격리 기간과 300초 사회적 재결합 기간으로 나누어 나눕니다.
  4. 각 뉴런에 대해 격리 및 재결합 기간 동안의 칼슘 활성 분포를 정량화하세요.
  5. 수신자 작동 특성(ROC) 분석18 을 수행하여 신경 활동이 고립 상태와 재결합 상태를 구별하는 능력을 평가하고, ROC 곡선 아래 면적을 계산하는 AUC 값을 산출합니다.
  6. 순열 검정을 사용하여 통계적 유의성을 평가합니다. 각 뉴런에 대해 칼슘 활동 값은 1초 시간 빈 내에서 행동 상태를 순환적으로 1,000회 섞어 AUC 값의 영분포를 생성합니다. 관찰된 AUC 값이 셔플된 영무분포의 95번째 백분위수를 초과하는 뉴런은 사회 상태에 의해 유의하게 조절된 것으로 간주됩니다.
  7. 조절 방향에 따라 유의미하게 조절된 뉴런을 분류합니다. 재결합에 의해 억제된 뉴런을 분리 뉴런으로, 재결합에 의해 활성화되는 뉴런을 재결합 뉴런으로 분류한다(그림 4).

8. 실험 후 검증

  1. 쥐를 관류하고 표준 조직학 검사를 통해 GRIN 수정체 추적과 바이러스 발현을 검증합니다( 그림 2I의 조직학 영상 예시 참조).
  2. 4% PFA를 사용해 마우스 머리 전체와 임플란트를 고정한 후 GRIN 렌즈를 제거하면 투명한 렌즈 자국을 시각화하세요.
    참고: 올바른 표적을 가진 동물 데이터만 포함하세요.

9. 문제 해결 및 실용적인 팁

  1. 미니스코프 뒤에 치아 시멘트로 헤드바를 고정해 미니스코프 장착과 제거를 용이하게 하세요.
    참고: 헤드바는 너무 길지 않아야 하며, 사회적 행동에 방해가 되지 않도록 약간 기울어진 각도로 배치할 수 있습니다.
  2. 수술 후 회복 기간 동안 이식된 쥐를 최소 일주일 이상 개별적으로 보관하세요. 이렇게 하면 쥐가 회복할 충분한 시간을 벌고 다른 쥐들이 이식물을 손상시키는 것을 방지할 수 있습니다.
  3. 이식된 쥐들을 완전히 회복하면 이전 카제메이트와 다시 결합시키세요. 커버 캡을 정기적으로 점검하고 조여 주세요. 여분의 뚜껑을 준비하고, 동물 관리 중에 잃어버렸을 때 다시 덮으세요.
  4. GCaMP 바이러스 주입 후 3-4주 후에 칼슘 신호를 확인하세요. 신호가 너무 약하거나 불분명할 경우, 회복 기간이 길어지면 신호의 품질이 향상될 수 있습니다.
  5. GRIN 렌즈 쪽이나 미니스코프 쪽 렌즈 표면에 주의하세요. 렌즈는 깨끗하게 유지하고 긁히지 않도록 하세요. 사용하지 않을 때는 렌즈를 가리세요.
  6. 영상 촬영 전에 신호 케이블 길이를 동물이 영상 영역의 모서리에 도달할 수 있을 만큼 길고, 원활한 사회적 상호작용이 가능하도록 짧게 조정하세요.
  7. 사회적 상호작용 중 다른 쥐가 물지 않도록 필요할 때는 단단한 재질로 케이블을 보호하세요. 신호 케이블을 정기적으로 점검하여 강한 사회적 상호작용으로 인해 꼬였는지 모니터링하세요.
  8. 연속된 영상 세션(예: 그림 3B)에서 동일한 신경 집합을 식별하기 위해, 원시 영상 영상을 연결해 칼슘 흔적을 추출할 수 있습니다.
  9. 예를 들어, 행동 영상과 칼슘 신호 등 여러 신호를 동기화하기 위해, 일반적인 TTL 입력과 동기화된 손전등이 서로 다른 녹화 파일을 정렬하는 데 사용됩니다.

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결과

신경 집단 식별
우리는 GCaMP 바이러스를 발현하고 C57BL/6J 마우스의 MPN에 GRIN 렌즈를 이식했습니다. 수술 후 마우스는 개별적으로 회복하여 최소 일주일 동안 케이지 동료들과 재회했습니다. 그 후 칼슘 영상 촬영 3일간 단독으로 보관되었습니다. 영상 촬영 중에는 10분간의 격리 기저선이 먼저 기록되었고, 이어서 이전 케이지 동료와의 10분간 사회적 재회가 기록되었습니다. 사회적 재회 전후(각 기간마다 300초)를 기록한 칼슘 활성은 ROC 분석에 사용되었다(자세한 내용은 7절 참조).

MPN 영역에서는 사회적 고립과 재회 기간 동안 독특한 활동 패턴을 가진 두 개의 뚜렷한 신경 집단이 확인되었습니다. MPN분리 뉴런은 사회적 고립 시 지속적인 활동과 재결합 시 빠른 억제를 보이는 반면, MPN재결합 뉴런은 반대 패턴을 보인다(

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토론

이 프로토콜은 생체 내 미니스코프 칼슘 영상과 사회적 행동 패러다임을 결합하여 시상하부 뉴런의 활동 프로필을 평가하는 통합 접근법을 상세히 설명합니다. 이 기술은 자연스러운 사회적 상호작용 중 심부 뇌 구조에서 장기적이고 세포 해상도에 가까운 칼슘 영상을 가능하게 합니다. 다음 섹션에서는 이 접근법의 중요한 단계, 방법론적 중요성, 한계 및 향후 잠재력을 논의합니다.

이 프로토콜의 성공은 일련의 세심하고 상호 연결된 외과 및 실험 절차에 달려 있습니다. 첫째, 입체성 바이러스 주입의 정밀도가 매우 중요합니다. 바이러스 역가, 주입 속도, 주사 후 거주 시간은 효율적이고 표적 바이러스 발현을 달성하고 조직 손상과 바이러스 역류를 최소화하기 위해 최적화되어야 합니다. 따라서 GRIN 렌즈 이식은 전체 시술의 성공에 있어 큰 기술적 도전 과제를 제시합니다. 유리 피펫으로 조직을 미리 절제하고, 매우 느린 속도...

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공개 사항

저자들은 상속된 재정적 이해관계나 이해 충돌이 없음을 선언합니다. ChatGPT는 원고 편집 과정에 사용되었으며, 모든 저자가 세심하고 상세한 교정을 했습니다.

감사의 글

미니스코프 실험 초기 훈련을 지원해 주신 Catherine Dulac 교수님과 수술 수행에 도움을 주신 양선 교수님께 감사드립니다. 이 연구는 웨스트레이크 대학교의 스타트업 자금과 NOMIS 재단, 하버드 대학교 탄양 자폐 연구 센터, 제인 코핀 차일즈 의학 연구상(D.L.), 찰스 A. 킹 트러스트 박사후 연구원 펠로우십의 지원을 받았습니다. 원고에 대한 의견을 주신 Liu Lab 모든 회원분들께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
AAV2/9-hSyn-jGCaMP7f-WPRE-pA타이툴S0587-9바이러스 매개체, 수술
항산성 혈류 젤라틴 해면후캉센FKS-A수술
베타딘 용액 (10% 요오딘 포비돈) 500mL하이노트Q13702855HNW002수술
행동 영상용 카메라다헝MER2-160-227-U3C행동
카프로펜MCEHY-B1227수술
디지털 입체 정체 기기후륜구동68803수술
에탄올 (75%)시노팜 화학 시약 주식회사801769610수술
눈 연고포두H37022025수술
인스코픽스 데이터 처리 소프트웨어(IDPS)인스코픽스1000-006551데이터 분석
이소플루란후륜구동R510-22-10수술
퀵실 접착제 팩 2개짜리월드 프리시전 인스트루먼트퀵-실수술
마이크로드릴후륜구동78001수술
MP-1000 마이크로피펫 풀러후륜구동MP-1000수술
다기능 동물 마취 솔루션후륜구동태극에수술
나노리터 마이크로인젝션 펌프후륜구동R-480수술
nVista 3.0 미니스코프인스코픽스1000-004323영상
안과 겸자후륜구동F12006-10수술
작동 가위후륜구동S14001-15수술
프로뷰 임플란트 키트인스코픽스1000-004238수술 및 영상
레진 시멘트 (슈퍼 본드)선 메디컬슈퍼 본드 C& B수술
베이스플레이트 커버 5개 세트인스코픽스1050-004639영상
5장짜리 베이스플레이트 세트인스코픽스1050-004638영상
GRIN 렌즈 5개 세트, 직경 0.6mm, 길이 7.3mm인스코픽스1050-004626수술 및 영상
스테레오택시스 현미경머지더MSD205A수술
멸균 생리식염수키두켈린R1B25071902수술

참고문헌

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  3. Riters, L. V., Kelm Nelson, C. A., Spool, J. A. Why do birds flock? A role for opioids in the reinforcement of gregarious social interactions. Front Physiol. 10, 421(2019).
  4. Panksepp, J. B., Lahvis, G. P. Social reward among juvenile mice. Genes Brain Behav. 6 (7), 661-671 (2007).
  5. Matthews, G. A., Tye, K. M. Neural mechanisms of social homeostasis. Ann N Y Acad Sci. 1457 (1), 5-25 (2019).
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  7. Liu, D., et al. A hypothalamic circuit underlying the dynamic control of social homeostasis. Nature. 640 (8060), 1000-1010 (2025).
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