산후 스트레스성 요실금에서 전기침술에 의한 운동 단백질 경로 변화

요약

전기침술은 산후 스트레스성 요실금 모델에서 요역학 지표를 개선했으며, 운동 단백질 관련 경로의 조절과 관련이 있었습니다. 이러한 발견은 치료 효과의 분자적 메커니즘을 시사합니다.

초록

산후 스트레스성 요실금(SUI)은 여성의 삶의 질에 큰 영향을 미치지만, 효과적인 치료의 근본적인 분자 기전은 여전히 밝혀지지 않았습니다. 이 연구는 쥐 SUI 모델에서 전기침술(EA)의 치료 효과와 분자 경로를 조사하는 것을 목표로 했습니다. 우리는 질 풍선 확장(VBD)을 이용해 SUI 모델을 확립하고, 참가자를 모델 그룹과 EA 처리된 그룹으로 무작위로 배분하였습니다. 기능 회복은 요역학 검사를 통해 평가되었으며, EA가 누출점 압력(LPP)과 최대 방광 용량(MBC)을 유의미하게 증가시킨다는 결과가 나타났습니다. 헤마톡실린과 에오신, 그리고 매슨의 삼색 염색을 이용한 조직병리학적 분석 결과, 근육 구조의 개선과 콜라겐 침착의 42.3% 감소, 염증 반응 억제가 나타났습니다. 정량적 단백질체학은 2,907개의 차별 발현 단백질(DEP)을 확인했으며, STRING 데이터베이스는 모터 단백질 경로를 중심 표적으로 강조했습니다. 구체적으로, EA는 MYL1, TNNI2, MYLPF, TNNT3, TNNT1 등 핵심 단백질을 선택적으로 하향 조절했습니다. 웨스턴 블롯과 qPCR로 검증된 이 결과는 EA가 근육 수축력을 조절하고 골반저를 재형성함으로써 SUI를 완화하며, 표적 SUI 치료의 잠재적 기전에 대한 통찰을 제공함을 시사합니다.

서론

스트레스성 요실금(SUI)은 산후 여성의 15–35%에게 영향을 미치는 흔한 골반저 질환으로, 삶의 질과 정신 건강에 큰 영향을 미칩니다 ^1,2. 신체적 증상 외에도 산후 SUI는 상당한 심리사회적 부담을 만듭니다; 많은 여성들이 당혹감, 자존감 저하, 사회적 위축을 경험합니다. 이 상태는 여성다움에 대한 감정을 감소시키고 다양한 활동에 참여하는 것을 꺼리게 하여 고립감을 악화시키고 산후 우울증에 기여할 수 있습니다^. SUI는 요실금 제품과 의료 방문 비용으로 인해 경제적 어려움도 제기합니다. 골반저 운동과 외과적 중재와 같은 치료 옵션이 존재하지만, 이들의 효능 한계와 재발 위험은 산후 SUI의 근본 원인을 겨냥하는 더 효과적이고 덜 침습적인 치료법의 필요성을 강조합니다 ^4,5. SUI의 발병 기전은 골반저 근육 기능 장애, 결합 조직 손상, 신경근 손상을 포함하는 다요인적 원인입니다. 질식 분만 중 기계적 외상은 산후 SUI의 주요 원인^{중 하나입니다 6,7}. 또한, 콜라겐 섬유 소모와 비정상적인 엘라스틴 대사로 나타나는 세포외기질 재형성의 불균형은 골반 지지 구조를 손상시킵니다⁸. 새로운 증거는 줄무늬 요도 괄약근의 수축력 저하가 근육 특이 단백질, 특히 액틴-마이오신 상호^{작용을 조절}하는 모터 단백질의 이상한 발현에 의해 유발되는 중요한 요인임을 시사한다.

전기침술(EA)은 전통 침술과 전기 자극을 통합한 현대적 적응법으로, 신경 회로를 조절하고 조직 복구 과정을 촉진함으로써 치료 효과를 높입니다 10,11,12,13. EA는 통증, 신경퇴행성 질환, 비뇨기 질환(과민성 방광 및 만성 전립선염 포함)을 관리하는 데 성공을 거두었습니다. 그 효과는 이중 메커니즘을 통해 매개됩니다: (1) 체감각 신경과 중추 통증 억제 경로의 활성화를 포함하는 신경조절(¹⁴), (2) 조직 수준 조절을 통해 혈관신생을 촉진하고 염증을 줄이며 세포외 기질 항상성을 회복합니다 15,16,17. 특히 EA는 SUI 환자에서 골반저 근육 기능을 개선했으며, 요도 폐쇄 압력 증가와 근전도 활동 증가로 입증되었습니다. 그러나 EA가 SUI에 미치는 치료 효과의 분자 경로, 특히 근육 수축성 관련 단백질 조절에 미치는 역할은 아직 충분히 이해되지 않았습니다.

소변 저장 중에는 운동 단백질과 그 조절 소단위의 정밀한 조절을 통해 요도 괄약근의 지속적인 수축이 유지되며, 이들은 줄무늬근에서 액틴-미오신 상호작용을 조율합니다 18,19,20. 휴식 상태에서는 빠른 근육 조련 구조의 골격근 이소형체인 트로포닌 I2(TNNI2)와 같은 억제성 소단위가 액틴 필라멘트에 결합하여 트로포닌-트로포미오신 복합체를 안정화하여 마이오신 결합 부위를 차단하고 근육 이완을 강화합니다^21,22. 동시에, 마이오신 ATPase 활성을 조절하는 조절 소단위인 마이오신 경쇄 1(MYL1)은 저칼슘 조건에서 인산화되지 않아 크로스브리지 사이클링의 효율을 제한합니다^. 신체적 스트레스 중 신경 활성화 시 칼슘 유입은 트로포닌 복합체의 구조 변화를 유발합니다: 칼슘이 트로포닌 C(TNNC)에 결합하여 TNNI2를 액틴에서 대체하고, 트로포마이오신을 후퇴시키며, 미오신 결합 부위를 노출시킵니다. 동시에 칼슘/칼모듈린 의존성 마이오신 경쇄 키나아제(mLCK)는 MYL1을 인산화하여 마이오신 ATPase 활성을 높이고 강력한 액틴-마이오신 교차 다리 형성을 촉진합니다. 트로포닌 T1(TNNT1)과 같은 구조적 소단위체는 트로포닌 복합체가 액틴에 올바르게 정렬되도록 보장하여 칼슘 신호에 동기화된 반응을 가능하게 합니다^24,25. 스트레스성 요실금(SUI)에서는 억제성 소단위(예: TNNI2)의 병리적 과발현이 액틴-미오신 차단을 연장시키고, MYL1과 TNNT1의 조절 이상은 마이오신 조립과 칼슘 감수성을 방해하여 괄약근 수축력을 모두 저하시킵니다 ^5,26. 이러한 분자 이상은 조직학적 특징인 무질서한 근섬유와 요도 저항 감소와 연관되어 있습니다. 따라서 TNNI2, MYL1, TNNT1의 생리적 발현 회복이 치료적 우선순위로 떠오르며, 이는 수축-이완 평형을 재조정하여 스트레스 사건 시 괄약근의 적응 능력을 강화하여 닫힘 압력을 생성하는 능력을 향상시킵니다.

프로토콜

모든 절차는 광저우 마일스 바이오테크놀로지 유한회사의 동물윤리위원회의 승인을 받았으며, 승인 번호는 IACUC-MIS2023045입니다.

SUI 쥐 모델 설립
총 20마리의 암컷 스프래그-도울리(SD) 쥐(6주에서 8주)를 사용하여 골반저 손상 모델을 만들었으며, 이는 출산을 모방했습니다. 질 풍선 확장(VBD)을 유도하기 위해 쥐들은 케타민(75 mg/kg)과 자일라진(10 mg/kg) 복막 내 주사로 마취되었습니다. 공기가 빠진 10 Fr 폴리 카테터가 중간 질관에 조심스럽게 삽입된 후, 풍선에 3mL의 멸균 생리식염수로 부풀렸습니다. 풍선은 진통과 관련된 골반저 근육의 장기간 기계적 늘어남과 음부신경 압박을 재현하기 위해 4시간 동안 제자리에 유지되었습니다. 모델 촬영 기간은 7일이었습니다. 8일째에는 6마리의 동물이 무작위로 선정되어 요역학 검사를 진행했습니다.

이 모델의 성공적인 확립은 요역학 검사와 근육 손상의 지표로 작용하는 혈청 락테이트 탈수소효소(LDH) 수치 측정을 통해 확인되었습니다. 성공적인 모델링이 확인된 후, SUI 쥐는 가짜 운영군과 치료 그룹으로 무작위로 나뉘었으며, 각 그룹에는 다섯 마리의 쥐가 포함되었습니다. 동시에 5마리의 정상 SD 쥐를 대조군으로 제공하였다. 가짜 그룹에서는 침 바늘을 전기 자극 없이 BL23(L2 척추 돌기에서 6mm 외측에 위치)과 GB30(고관절 뒤쪽에 위치)에 삽입하였다. 전기침술 그룹에서는 표준 임상 치료 방법을 따라 전기침술기구를 사용해 동일한 경혈점을 자극하였습니다. 전기침술 장치는 2 V에서 1 Hz의 희소-밀도 파형으로 설정되었습니다. 각 중재는 10일 연속으로 하루 30분씩 진행되었습니다. 모든 동물은 매일 모니터링되었고 표준 실험실 조건 하에 보관되었습니다. 실험이 끝난 후, 각 그룹의 동물들에 대해 요역학 검사가 실시되었습니다. 이후 각 쥐 그룹은 3% 이소플루란과 1.0 L/min 산소 혼합물로 마취를 받았습니다. 쥐들이 의식을 잃은 후 이소플루란 농도를 5%로 조정했고, 호흡부전으로 사망한 후 샘플을 채취했습니다.

요역학 검사
이소플루란 유도 마취 후, 동물들은 등을 대고 눕히고 고정되었습니다. 복부 중앙선 절개로 방광이 노출되었다¹⁸. 경막외 카테터는 방광 돔에 직경 2mm 의 누공을 통해 삽입하고, 내강 안쪽으로 0.5–1.0cm 진출한 후 11-0 봉합사로 가방 끈 기법으로 고정했습니다. 카테터는 압력 모니터링 시스템에 연결되어 마이크로 시린지 펌프로 37 °C 메틸렌 블루 염색 식염수로 10 mL/h로 관류되었으며, 동시에 방 내 압력 모니터링이 이루어졌습니다. 최대 방광 용량은 주입 시간(주입 시작과 첫 요도액 방울 사이의 간격)과 유량의 곱으로 계산되었습니다. 누설점 압력(LPP)은 수작업으로 가한 복부 압박이 갑작스럽게 해제된 직후 방광내 압력의 최고치를 기록하여 측정했습니다. 모든 지표는 요동역학 분석 시스템을 사용하여 측정값당 3배 측정값을 사용하였습니다. 모든 샘플은 세 명의 독립 운영자가 단일 측정을 수행하며 단일 맹목적으로 무작위로 코딩 및 분석했습니다. 세 가지 독립적인 측정 결과는 통계 분석에 사용되었습니다.

혈청 락테이트 탈수소효소(LDH) 수치를 측정하세요
수술 후 7일째에 각 쥐의 꼬리정맥에서 약 1mL의 전혈이 채취되었습니다. 채취된 샘플은 혈전이 형성될 때까지 실온에 1시간 동안 방치한 후, 2,000 × g에서 15분간 원심분리했습니다. 약 0.5mL의 상정액이 혈청으로 신중히 수집되었습니다. 혈청 락테이트 탈수소효소(LDH) 수치는 제조사 프로토콜에 따라 D-락테이트 탈수소효소 분석 키트를 사용해 정량적으로 측정되었습니다.

단백질체 프로파일링 및 생물정보학 분석
모델 및 치료군에서 분리된 요도 평활근 조직에 대한 정량적 단백질체학적 분석이 수행되었습니다. 단백질은 Proteome Discoverer 2.4를 사용한 질량분석법 원시 데이터에서 1% 오발견률 임계값으로 확인되었습니다. 차별 발현 단백질(DEP)의 생물정보학적 분석은 R 기반 패키지를 사용하여 수행되었으며, 차등 발현 분석은 limma 패키지(|log2FC| > 1, 조정 p < 0.05)를 사용했고, 유전자 온톨로지(GO) 풍부화 분석과 교토 유전자 및 유전체 백과사전(KEGG) 경로 분석은 clusterProfiler 패키지를 사용했으며, 보정 p < 0.05, q<-값 0.2에서 풍부 항/경로가 유의한 것으로 간주되었습니다; 계층적 클러스터링은 Pheatmap 패키지를 사용하여 시각화되었습니다. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크는 STRING 데이터베이스(v11.5, 신뢰도 점수 > 0.7)를 사용하여 구축되었습니다.

헤마톡실린-에오신 염색
쥐 평활근 조직은 4% 파라포름알데히드에 고정하고 파라핀에 박혀 있었다. 직렬 절편(두께 5μm)은 미세토임을 사용해 준비하고 표준화된 H&E 염색 키트로 염색했습니다. 형태학적 평가는 40×–400× 배율의 밝은 영역 현미경을 사용하여 근육 조직의 구조적 완전성, 염증 세포 침윤, 기질 재형성에 중점을 두었습니다.

매송의 트리크롬 염색
윤리위원회가 승인한 실험 프로토콜에 따라, 우리는 치료 10일째에 동물들로부터 샘플을 채취했습니다. 쥐 근육 조직은 4% 파라포름알데히드와 파라핀 함정으로 고정되었습니다. 5 μm 두께의 직렬 절편은 회전식 미세절기를 사용해 절단되었습니다. 탈파라핀화된 부분은 마송의 트리크롬으로 염색되었다. 염색된 단면은 밝야 현미경으로 100× 배율로 촬영되었습니다.

서부 블롯팅
총 단백질은 저온에서 유지된 RIPA 용해 완충제에서 기계적 교란을 통해 쥐의 평활근 조직에서 추출되었으며, 프로테아제 억제제로 보완되었습니다. 용해액은 10,000 × g에서 4°C에서 15분간 원심분리하여 정제하였고, 단백질 함유 상액을 수집하여 분석하였습니다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 교정 기준으로 사용한 비신코닌산(BCA) 분석법으로 결정하였습니다. 10% 또는 12% SDS–폴리아크릴아마이드 겔에 동일한 양의 단백질(30 μg)을 적재하여 환원 조건에서 분리했습니다. 전기영동 후, 단백질은 0.22 μm 크기의 PVDF 막에 옮겨졌습니다. 막은 3% BSA에 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅하여 비특이적 결합 부위를 차단한 후, 4°C에서 GAPDH, MYL1, TNNI2, TNNT1, TNNT3, MYLPF를 인식하는 1차 항체와 함께 하룻밤 배양했습니다. TBST로 세 번 세척한 후, HRP 표지된 2차 항체를 상온에서 2시간 동안 적용하였다. 신호 검출은 화학발광 기판을 사용하여 수행되었으며, 영상은 발광 영상 시스템으로 촬영되었습니다. 단백질 발현의 정량화는 덴시토메트릭 분석을 통해 수행되었으며, GAPDH가 내부 기준 역할을 하였습니다.

정량적 실시간 PCR(qPCR)
조직 샘플은 총 RNA 추출 시약으로 용해되었고, 제조사의 RNA 추출 키트 지침에 따라 RNA를 분리했습니다. 유전자 특이적 프라이머는 전용 소프트웨어(표 1)를 사용하여 설계되었으며, 그 특이성은 BLAST 분석(≥18 bp 상동성, Tm = 58–62 °C)을 통해 검증되었습니다. RNA는 역전사 키트를 사용해 역전사되었고, 표적 유전자의 발현은 SYBR Green qPCR 검출 키트로 검출되었습니다.

통계 분석
두 그룹 간의 통계적 비교는 독립 표본 t-검정을 사용했으며, 여러 그룹 간 차이는 일원 ANOVA와 본페로니 사후 분석으로 평가하였습니다. 데이터는 표준편차± 평균 또는 표준오차의 평균 ± 표준오차(SEM)로 표현됩니다. p < 0.05 치는 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었습니다.

결과

질 풍선 확장 손상을 입은 쥐의 요역학 지표
방광 기능, 특히 요실금과 최대 방광 용량은 모델링 전후 평가하였다. 요역학 분석 결과, 질 풍선 확장(VBD) 후 최대 방광 용량(MBC)과 누출점 압력(LPP)이 기저치 대비 통계적으로 유의하게 악화되었다(P < 0.05). MBC는 2.34 ± 0.21 mL에서 0.75 ± 0.32 mL로 감소했으며(표 2 및 그림 1A), LPP는 41.83 ± 5.45 cmH₂O에서 22.16 ± 6.90 cmH2O로 감소했습니다(표 2 및 그림 1B).

스트레스성 요실금 쥐에서 요역학 지표 개선
방광 기능 지표, 예를 들어 요...

토론

산후 여성에게 흔히 발생하는 비뇨기학적 질환인 SUI는 임신 및 출산 중 골반저 지지 구조 손상과 병리적으로 연관되어 있습니다 ^7,27,28. 복압을 높이는 활동(예: 기침, 재채기, 운동)에서 비자발적으로 소변이 새는 것이 특징이며, SUI는 환자의 신체적·심리적 웰빙과 삶의 질에 심각한 손상을 줍니다²⁹.

병태기전학적으로 Sui 발병은 임신 및 출산 중 골반저 지지 구조의 해부학적 변화 및 신경근 손상과 직접적으로 연관되어 있습니다 ^6,30. 요도 폐쇄 기능을 유지하는 데 필수적인 골반저 근육은 분만 중에...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.22 & 마이크로; m개의 PVDF 막	밀리포어	ISEQ00010
2× UniTaq SYBR qPCR 마스터 믹스 (ROX-)	TIANYAbiotech	P1504
4% 파라포름알데히드	GSbioth	GS539A
BCA 분석 키트	딩궈 바이오테크	BCA02
밝시야 현미경	MSSHOT	ML31
D-락테이트 탈수소효소 분석 키트	비요타임	P0392S
ECL 프라임 시약	시티바	RPN2232
전기영동 장치	WIX	미니프로4
완전 자동화 화학발광 영상 분석 시스템	후지필름	LAS-3000
GAPDH 항체	어피니티 바이오사이언스	T0004
HRP 결합 2차 항체	어피니티 바이오사이언스	S0001, S0002
ImageJ 1.54 소프트웨어	NIH
매송의 트리크롬 스테인 키트	GSbioth	GS800A
MYL1 항체	클라우드 클론	PAB105Ra01
MYLPF 항체	어피니티 바이오사이언스	DF9048
이름	회사	카탈로그 번호
파워랩 차트 v5.2.1	보조 장치
프라이머 프리미어 5.0 소프트웨어	프리미어 바이오소프트
프라임스크립트 RT 마스터 믹스	타카라	RR036A
프로테옴 디스커버러 2.4 소프트웨어	써모피셔 사이언티브
급속 반건식 회전 필름 장치	바이오-래드	788BR04132
실시간 형광 qPCR 정량 시스템	톈롱	TL100
RIPA 용해 완충제	비요타임	P0013B
RNA 추출 키트	에이드랩	RN70
회전식 미세절기	라이카	RM2235
SDS-PAGE 겔	비요타임	P0052A, P0053A
표준화된 H& E 스테인 키트	GSbioth	GS700A
TBST 버퍼	바이오샤프	BL346A
TNNI2 항체	클라우드 클론	PAD230Ra01
TNNT1 항체	클라우드 클론	PAD231Ra01
TNNT3 항체	클라우드 클론	PAD233Hu01
총 RNA 추출 시약	바이오샤프	BL258A
요동역학 검사 시스템	테크맨	BL-420