효소 소화 및 밀도-구배 분리를 이용한 루이스 쥐로부터의 췌장 섬 분리 및 정제

요약

이 프로토콜은 루이스 쥐 췌장 섬의 외과적 채취, 효소 소화 및 밀도-구배 정제를 표준화하는 방법을 설명하여, 이식 또는 시험관 내 연구에 직접 사용할 수 있는 고수율, 고순도 제제를 가능하게 합니다.

초록

췌장 섬은 임상적 섬 이식과 당뇨병의 기전과 진행 과정을 이해하기 위한 전임상 연구 모두에 필수적입니다. 그러나 이러한 분야의 진전은 고품질 섬의 가용성에 의해 제한되는 경우가 많으며, 신흥 치료 전략은 더 크고 깨끗하며 표준화된 준비를 요구하기 때문입니다. 이 글은 루이스 쥐의 췌장 섬을 외과적 수확, 효소 소화, 밀도-구배 정제를 위한 고처리량 표준화 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 유관 내 췌장 관류와 정의된 효소 혼합물, 여러 췌장의 집합 소화, 밀도 기반 분리를 결합하여 수율을 극대화하고 파편화를 최소화하며 일상적인 손으로 따는 작업을 없애는 방식을 제공합니다. 섬 수율은 두 가지 상호 보완적인 방법으로 정량화됩니다: 임상 환경에서 흔히 사용되는 전통적인 분할 계산법과 반자동 전부 준비 영상 기반 방법입니다. 12개의 췌장에서 대표적인 분리 사례에서, 수작업 계산으로 췌장당 약 3,300개의 섬 상당량(IEQ)과 2,700개의 절대 섬(~39,600 IEQ)이 나타났으며, 크기 분포는 62%(50-100 μm), 17%(100-150 μm), 10%(150-200 μm), 5%(200-250 μm), 6%(>250 μm)였다. 비교하자면, 전체 준비 자동화 분석에서는 총 IEQ가 16,350개(췌장당 IEQ는 1,362개)가 보고되어 알리쿼트 기반 정량의 고유한 변동성을 강조하였다. 디티존 염색으로 제제의 순도는 98%였으며, 분리 후 3일과 7일째에 아이슬렛 생존율은 시험 관 내에서 98%로 유지되었습니다. 정적 포도당 자극 인슐린 분비를 통한 기능 평가 결과, 16.7 mM 포도당으로 1시간 자극 후 인슐린 분비가 10배 증가하는 것으로 나타났습니다. 전반적으로 이 프로토콜은 추가 정화 없이 즉시 사용할 수 있는 고순도, 기능적으로 온전한 섬 준비물을 생성하는 재현 가능하고 효율적인 접근법을 제공합니다. 소는 배양 내에서 최대 7일간 강력한 기능을 유지하여 대규모 시험관 내 검사와 생체 내 이식 연구를 위한 유연성을 제공합니다.

서론

췌장 섬 이식은 제1형 당뇨병(T1D) 환자에서 내인성 인슐린 생성을 회복하는 실질적인 전략을 나타냅니다^. T1D를 넘어서, 섬 생물학은 진행성 β세포 기능 장애와 손실이 특징인 제2형 당뇨병(T2D)과 만성 췌장염, 췌장 종양, 외상성 손상으로 부분 또는 전췌장 절제술을 받는 환자와 점점 더 관련이 깊어지고 있습니다. 이러한 맥락에서 고품질 섬에 대한 접근은 세포 치료 발전, β세포 실패 모델링, 섬-면역 및 섬-기질 상호작용 연구, 그리고 신흥 재생 접근법 개발에 필수적입니다^. 따라서 견고하고 재현 가능한 섬 분리 절차는 다양한 췌장 내분비 질환에 걸친 기전 연구와 중개 개발을 지원하는 데 매우 중요합니다.

섬은 췌장 질량의 2% 미만을 차지하지만, 포도당 항상성에 불균형적으로 중요한 역할을 합니다. 저산소증, 酵소 과소화, 산화 스트레스, 기계적 전단에 대한 본질적 취약성 때문에 격리 관련 손상에 특히 민감합니다 ^3,4,5. 온도, 산소 공급, 조직 취급의 미세한 편차조차도 항산화 방어력이 제한되고 대사 요구량이 높아 β세포 자극-분비 결합을 저해하거나 세포자멸사를 유발할 수 있습니다 ^6,7. 그 결과, 대부분의 기존 프로토콜은 임상 및 실험 환경에서 수확 후 24-48시간 이내에 빠른 하위 사용을 강조합니다 8,9,10,11,12. 이 '즉각적 사용' 프레임워크는 악화를 최소화하지만, 실험적 유연성을 제한하고 종단 연구를 방해하며, 대규모 시험관 검사나 체내 이식 실험을 위한 충분한 섬 수를 확보하는 데 어려움을 줍니다.

설치류 모델 중에서는 근친교배된 유전적 배경, 안정적인 면역 프로필, 재현 가능한 생리학적 특성 덕분에 루이스 쥐가 섬 연구에 널리 활용된다¹⁴. 변형 의존적 섬 수율, 반응성, 회복력의 차이는 잘 문서화되어 있습니다. De Groot 등은 루이스 쥐 섬들이 다른 균주에 비해 포도당 자극 인슐린 분비가 우수함을 보여주며, 기능적, 대사적, 이식 연구에 적합함을 강조했다¹⁵. 추가 연구를 통해 면역학 및 알로/이종이식 연구의 신뢰성이 확인되었습니다 14,15,16. 하지만 실험실 간 간에, 섬 수확량, 순도, 기능의 변동성은 여전히 중요한 장벽으로 남아 있습니다. 이러한 변동성의 상당 부분은 효소 혼합, 관내 관류 기술, 췌장 관리, 소화 시기, 정^{제 전략의} 불일치에서 비롯됩니다.

이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 루이스 쥐의 췌장 섬을 외과적 수확, 효소 소화, 밀도-구배 정제를 위한 재현 가능한 단계별 프로토콜을 개발했습니다. 이 워크플로우는 수율 극대화, 단편화 최소화, 기능적 생존 가능성을 유지하도록 최적화되어 있습니다. 중요한 점은, 이 연구는 섬 상가물(IEQ), 시간에 따른 생존 가능성, 순도, 포도당 자극 인슐린 분비 등 명확한 벤치마크를 설정하여 연구자들이 성공적인 분리와 비최적 분리를 신뢰성 있게 구분할 수 있게 한다는 것이다^{18, 19, 20}. 수확량과 수명을 모두 개선함으로써 이 프로토콜은 실험의 유연성을 높이고 필요한 기증 동물 수를 줄여 보다 윤리적이고 확장 가능한 실험 설계를 지원할 수 있습니다.

기존 방법과 구별되는 본 방법은 루이스 쥐 섬을 최대 7일간 유지할 수 있고 생존력과 기능을 유지할 수 있음을 보여주며, 장기간 시험관 내 연구에 활용 가능성을 확장합니다. 프로토콜은 또한 한 배치에 최대 30개의 췌장을 처리할 수 있는 간소화된 풀링 처리 전략을 포함하여 균일한 소화와 샘플 간 변동성을 줄입니다. 내분비 순도가 98%에 이르기 때문에, 이 절차는 수작업으로 직접 따는 작업을 없애고 미생물 오염 가능성을 줄여줍니다. 불순하거나 기계적으로 손상된 제제를 자주 생성하는 단일 단계 또는 대량 소화 방법과 비교할 때^, 이 고처리량 워크플로우는 시험 관 내 분석, 대사 프로파일링, 생체 이식 연구에 적합한 깨끗하고 이식 품질의 섬을 다수 신뢰성 있게 제공합니다.

프로토콜

모든 절차는 휴스턴 감리교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC, 프로토콜 #IS00007362)의 승인을 받았으며, 국립보건원(NIH)의 실험동물 관리 및 사용 가이드와 동물복지법에 따라 진행되었습니다.
참고: 프로토콜 전반에 걸쳐 사용된 재료와 기기는 재료표에서 확인할 수 있습니다.

1. 수확 및 격리일 전 준비

1. 다음 용액은 생물안전 캐비닛 내에서 무균 조건에서 준비하고( 표 1 참조) 사용 전까지 4 °C에서 보관하세요.
   페니실린-스트렙토마이신 세척액(펜-스트렙토메신).
   매체 세척.
   소환 완충 부채.
   아슬렛 컬처 미디어.
   크렙스 버퍼.
2. 도구와 장비를 오토클레이빙으로 멸균하세요.
   1. 오토클레이브 췌장 채취 수술 키트: 수술용 커튼, 거즈, 쥐 이빨 조직 겸자, 납작한 겸자, 미세한 곡선 겸자, 피부 가위 1개, 미세 해리 가위, 작은 지혈고정기 2개, 곡선 지혈고정기 1개.
      참고: 수술자가 두 명 있을 경우 두 개의 췌장을 오토클레이브하여 수술용 팩을 채취하세요.
   2. 오토클레이브 췌장 청소 수술 팩: 미세한 곡선 겸자와 미세 해리 가위.
   3. 30cm x 30cm 알루미늄 호일 한 장을 오토클레이브합니다.
   4. 가공할 췌장 개수에 따라 1-6개의 600 mL와 1L 비커를 사용한다( 표 2 참조).
   5. 500 μm 체로 오토클레이브 1개.
   6. 14G 척추 바늘 두 개를 오토클레이브하세요. 한 명이 소화되지 않은 췌장 조직으로 막힐 경우를 대비해서요.
   7. 50mL 주사기당 오토클레이브 주사기 튜브 1개를 사용하세요( 표 3 참조).
3. 소화를 위해 물욕을 준비하세요.
   1. 궤도 셰이커가 장착된 물욕조에 오토클레이드 처리된 초순수한 물을 플랫폼 수면에서 3/4인치 높이까지 채우세요.
   2. 3mL 항균 용액을 넣고 뚜껑을 닫아 오염을 최소화하세요.

2. 수확 및 격리일의 준비

1. 그라디언트 주사기를 준비하세요.
   1. 다음 단계와 "섬 정제" 단계 5.2에 사용된 섬 구배 용액 1.108 g/cm³, 1.096 g/cm³, 1.069 g/cm³를 4 °C 저장에서 제거하여 상온(약 1시간)까지 평형을 맞춥니다.
      참고: 필요한 구배 부피는 처리할 췌장 수에 따라 달라집니다; 표 3 을 참고하여 특정 경사의 적절한 해동 부피를 확인하세요.
   2. 50 mL 주사기에 1.096 g/cm³와 1.069 g/cm³ 구배로 미리 적재하고 라벨을 붙입니다.
      1. 1.069 g/cm³와 1.096 g/cm³ 밀도 구배 용액을 격렬하게 혼합하세요.
      2. 표 3에 따라 적절한 양을 수술용 튜브와 16G 바늘이 장착된 50mL 주사기에 투여하세요.
      3. 채우기 후에는 바늘을 뚜껑으로 덮어 멸균을 유지하고, 주사기는 "Islet Purification" 5.5단계에서 사용할 때까지 따로 보관하세요.
   3. 실온에서 1.108 g/cm의³ 그라데이션을 보관하다가 나중에 사용하세요.
2. 작동 해리 배지(WDM) 효소 용액을 만들어 주사기에 넣어 관류와 오토클레이브 비커를 사용하세요.
   1. 생물안전 캐비닛 내에서 멸균 환경에서 작업하고, 모든 용액은 얼음 위에 보관하세요.
   2. 콜라겐제, 열분해신, DNase I의 알리코트를 얼음에 녹여 보관합니다.
   3. 멸균 1L 비커에 효소 시약을 희석하여 WDM을 사용해 최종 농도를 얻습니다: 콜라게나제 0.15 mg/mL, 열분해신 5 μg/mL, DNase I 0.1 mg/mL(표 2).
   4. WDM을 10번 부드럽게 섞어 소용돌이치는 동작을 사용하세요. 피펫으로 섞지 마세요; 부드럽게 휘저어 효소 활성을 보존하세요.
   5. 16G 바늘을 사용해 각 10mL 주사기에 10mL의 WDM 효소 용액을 하나씩 주입하여 빠르게 충전한 후, 이후 췌장 관류를 위해 캡이 달린 25G X 1/2인치 바늘로 교체합니다.
   6. 주사기를 오토클레이드 알루미늄 호일로 감싸 얼음 위에 올려두면 사용 가능하다.
   7. 표 2에 따라 채취된 췌장을 보관하기 위해 초과 WDM을 멸균된 600mL 비커에 균등하게 투여합니다. 각 비커를 멸균 알루미늄 호일로 덮고 얼음 위에 보관하세요(표 2).
3. 세포 배양 작업 공간을 준비하세요.
   1. 궤도 수욕 셰이커를 130rpm, 37 °C로 설정해 켜. 췌장 채취 중에는 그대로 두세요.
   2. 다음 물품들을 생물안전 캐비닛에 UV 조명 아래 1시간 동안 보관하여 추가 멸균을 하세요.
      멸균 500 μm 체.
      멸균 1L 비이커.
      주사기 펌프.
   3. 세포 배양 인큐베이터는 25 °C 5%_CO2로 설정하세요.
   4. 원심분리기를 4°C로 설정하고, 가속과 감속은 9°C로 설정하세요.
4. 수확할 재료를 모아 수술실로 이동하세요.
   1. 지정된 췌장 청소제:
      1. 필요한 수의 600 mL WDM 비커와 췌장 세척액을 담을 수 있도록 큰 얼음통 하나를 모으세요( 표 1 과 표 2 참조).
      2. 췌장 6개당 멸균 페트리 접시 1개를 준비해 처리하세요.
      3. 멸균 미세 해부 가위 1개와 작고 곡선형의 섬세한 겸자 2개를 모으세요.
   2. 지정된 췌장 수확기:
      1. 멸균 채취 수술 가방을 준비하세요.
      2. 멸균 수술용 장갑을 챙기세요.
      3. 10mL WDM 주사기가 미리 장전되어 있고 오토클레이드 알루미늄 호일로 밀봉된 얼음 트레이를 준비하세요.
5. 수술실에서 췌장 채취 스테이션을 준비하세요.
   1. 유리 구슬 멸균기를 켜서 각 동물 사이에 1분간 소독기를 담가서 수술 도구를 멸균하세요. 기기는 멸균된 1x PBS에 담그면 빠르게 냉각될 수 있습니다.
   2. 현미경 시야 아래에 흡수 패드를 놓아 혈액이나 누출된 WDM 효소 용액을 확인하세요.
   3. 현미경을 눈과 대물렌즈 합산 6.3배 배율로 설정하세요.
   4. 수술용 가방을 열고 무균 기법으로 멸균 수술용 장갑을 착용하세요.
   5. 외과적 채취를 진행하세요.
6. 수술실에서 췌장 세척 스테이션을 준비하세요.
   1. 펜-스트렙 용액을 100mm 페트리 접시(약 6mL)의 절반만큼만 채워 고립된 췌장을 담근 후 얼음 위에 올려놓습니다.
   2. 수술용 가방을 열고 무균 기법으로 멸균 수술용 장갑을 착용하세요.
7. 수술실에서 안락사 챔버를 준비하세요.
   1. 저수지 트레이를 빈 깨끗하고 재밀봉 가능한 쥐 우리에 넣으세요.
   2. 트레이에 이소플루란을 반쯤 채우세요.
   3. 쥐를 넣는 동안 물이 흘러나가지 않도록 천공 트레이를 저장소 위에 올려두세요.
   4. 챔버 뚜껑을 케이지 뚜껑으로 밀봉하세요.
8. 췌장 채취로 진행하세요.

3. 췌장 적출

1. 쥐를 한 마리씩 트레이 위에 있는 안락사 챔버에 넣어 급속한 이소플루란 과다복용을 시행하세요.
   참고: 쥐의 안락사 시간은 특히 아이소플루란이 증발함에 따라 달라질 수 있습니다.
2. 각 쥐의 맥박과 호흡이 없음을 확인하세요.
3. 복강을 방해하지 않는 보조 방법(예: 심장 천자)으로 안락사를 확정하세요.
   참고: 다른 1차 안락사 방법도 허용됩니다; 그러나 신속한 안락사가 섬 저산소증을 최소화하기 때문에 아이소플루란 과다복용이 선호됩니다.
4. 쥐의 복부 털에 70% 에탄올을 뿌려 매트를 마디시키고, 수술 현장에서 털이 풀리는 것을 방지하세요.
5. 안락사된 쥐를 현미경 아래에 눕히고, 머리는 조작자 쪽에 위치합니다. 상복부가 현미경 시야 안에 있는지 확인하세요.

그림 1: 쥐 췌장의 외과적 노출 및 관내 관류 관류. 췌장 노출과 오디 괄약근을 통한 관류 주요 단계의 삽화. (A) 복강이 열린 루이스 쥐 안락사. (아아) 총담관과 간정맥의 클램프 위치. (B) 십이지장의 확대 뷰에서 오디 괄약근 부위에 치혈기가 표시됨. (비비) 관류 바늘이 주 췌장 관 안에 위치해 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 췌장 채취 (췌장 수확자 역할):
   1. 치골 결합에서 각 측면 갈비뼈를 향해 피부 가위를 사용해 'V자형' 절개를 하여 복강에 접근합니다( 그림 1A 참조).
   2. 평평한 겸자를 사용해 소장과 대장을 동물의 왼쪽으로 당겨 복강 '작업공간'을 정리합니다.
   3. 평평한 겸자와 곡선 지혈기를 사용해 십이지장을 펼칩니다. 총담관과 간문맥이 현미경 시야에 들어오도록 하세요.
   4. 간두를 후퇴시키고 곡선 지혈기로 총담관과 간정맥을 고정하세요. 간에서 1-2mm 떨어진 곳을 집어붙입니다( 그림 1Aa 참조).
      참고: 3.6.1-3.6.4 및 3.6.8 단계는 직접 시각화를 통해 수행할 수 있습니다. 섬세한 조직 조작을 위해 다른 모든 단계는 현미경을 사용하세요.
   5. 현미경 시야 아래, 평평한 겸자와 평평한 지혈기를 사용해 십이지장 내 내용물을 부드럽게 움직이며 오디 괄약근을 제거합니다.
      참고: 십이지장 내용물이 바늘 삽입 부위에서 밀려나도록 하세요.
   6. 오디 괄약근 주변 부위를 격리하여 평평한 항혈기로 십이지장을 양쪽 약 5mm 떨어진 곳에 부드럽게 고정합니다. 조직의 무결성을 유지하기 위해 최소한의 압박을 유지하세요( 그림 1B 참조).
   7. 멸균된 WDM 주사기를 사용해 바늘을 십이지장 벽을 조심스럽게 통과시키고, 오디 괄약근을 통과한 후 주 췌관으로 진입하여 관류를 시행합니다( 그림 1Bb 참조).
      1. 바늘이 오디 괄약근을 통과하면, 일정한 압력을 유지한 채 약 500 μL/s 속도로 7-10 mL의 WDM을 췌장에 관류하여 췌장이 완전히 팽창할 때까지 투여합니다.
         참고: 베벨이 위로 향하게 하고 바늘이 췌장관과 평행하게 되어 외상을 최소화하세요. 삽입 즉시 주사를 시작하세요. 이렇게 하면 괄약근과 관이 확장되어 바늘이 더 잘 들어갈 수 있습니다. 췌장은 비장 근처에 위치한 꼬리가 눈에 띄게 관류되어 있을 때 완전히 팽창한 것으로 간주됩니다.
   8. 췌장을 주변 구조물에서 부드럽게 해부하여 다음 순서로 절제합니다: 비장, 위, 대장, 십이지장, 장막.
      참고: 조직 손상을 최소화하기 위해 둔탁 해리법을 사용하세요. 해부학적 방향을 유지하고 혈관 및 유관 연결부의 긴장을 줄이기 위해 순차적으로 진행하세요.
      1. 십이지장에서 두 개의 평평한 지혈기를 모두 제거하세요.
      2. 평평한 겸자를 사용해 췌장인대(췌장과 비장을 연결하는 인대)를 클램프하고 부드럽게 견인하세요.
      3. 미세한 곡선 박리 겸자를 사용해 췌장을 인접한 비장 부착부에서 조심스럽게 움직이고 분리합니다.
      4. 췌장 조직을 가늘게 굽은 겸자로 들어 올리고 평평한 겸자로 부드럽게 반대 견인을 가해 췌장을 위에서 분리합니다.
      5. 그 후 평평한 겸자를 사용해 대장을 췌장에서 분리하기 위해 단단한 견인을 가합니다.
      6. 납작한 겸자를 사용해 소장을 들어 올리고, 미세한 굽은 겸자로 장간막과 췌장을 분리합니다.
      7. 평평한 겸자로 관류된 췌장을 부드럽게 들어 올리고, 미세 해리 가위로 결합 조직에 남아 있는 부착물을 절단합니다.
   9. 즉시 절제된 췌장을 얼음 세척액이 담긴 페트리 접시에 옮기고, 즉시 다음 췌장을 채취하세요. 동시에 췌장 세척자가 창 청소를 시작합니다.
7. 췌장 청소 (췌장 청소 역할):

그림 2: 관류된 쥐 췌장 세척. 비필수 조직 제거 전후의 췌장을 순차적으로 시각화합니다. (A) 박리 직후 관류된 췌장, 인접한 지방 조직, 림프절 및 결합 구조가 보인다. (B) 주요 해부학적 랜드마크가 표시된 관류 췌장. (C) 과잉 조직을 제거한 후 췌장을 세척한 사진, 소화 전 최종 모습을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

1. 미세한 굽은 겸자와 미세 해리 가위를 사용해 림프절, 지방 조직, 장간막, 그리고 관류된 췌장에 있는 큰 혈관을 조심스럽게 절단하세요( 그림 2 참조).
2. 깨끗한 췌장을 멸균 600 mL 비커에 25 mL의 냉 WDM을 담아 옮깁니다. 수술 작업실에서 세포 배양 작업부로 옮기는 동안 청결을 유지하기 위해 비커를 멸균 알루미늄 호일로 덮으세요.
   1. 페트리 접시의 세척액은 6번마다 교체하여 오염을 방지하세요.
   2. 첫 췌장이 얼음 위에 올려진 시간을 기록하세요. 이 기록은 냉기 허혈 시간을 기록하는 데 사용됩니다.

8. 모든 췌장을 확보하고 세척한 후에는 세포 배양 작업실에서 소화 단계로 신속히 진행하세요.

4. 췌장 소화

1. 궤도 셰이커 회전을 멈추고, 췌장이 들어있는 덮개를 설치된 비커를 지정된 수욕 홀더에 고정하세요.
2. 빠르게 궤도 셰이커를 130rpm으로 설정한 상태로 재가동하고 소화 시간을 위한 10분 타이머를 시작하세요( 그림 3A 참조).
   참고: 이 시점을 냉 허혈 기간의 끝으로 기록하세요. 각 섬 수확과 해당 냉허혈 시간을 실험실 기록에 기록하세요.
3. 5분 지점에서 비커를 시계 방향으로, 그리고 반시계 방향으로 돌려 조직 해리를 돕습니다.
4. 8분이 되면 냉장 저장소에서 소환액을 꺼내 생물안전 캐비닛으로 옮겨 즉시 사용할 수 있습니다( 표 1 참조).
5. 10분 지점에 빠르게 비커를 얼음에 담가서 효소 활성을 늦추세요( 그림 3B 참조).
   참고: 이 시점부터는 모든 조직, 세포, 용액을 얼음 위에 올려 4.20단계까지 보관하세요.
6. 비커 외부와 트레이를 생물안전 캐비닛으로 옮기세요.
7. 비커 내 용액과 1:1 비율로 소화를 멈추기 위해 소화를 멈추는 완충제를 추가하세요(비커당 약 75-100 mL).
8. 50mL 주사기와 14G 척추 바늘을 장착한 주사기를 사용해 조직 부유액을 부드럽고 반복적으로 흡인하고 배출하여 큰 조직 조각을 해리합니다( 그림 3C 참조).
9. 현탁액을 200mL 원뿔형 튜브로 옮기세요.
10. 비커를 5mL 세척 매체로 헹구고, 섬 소화물이 들어 있는 200mL 원뿔 튜브에 옮겨 남은 소화물을 수집합니다.
11. 원심분리기는 200 × g 에서 4 °C에서 5분간 분해합니다. 안전을 위해 적절한 원심분리기 병 어댑터와 쿠션 사용을 반드시 확인하세요.
12. 상청액을 조심스럽게 디캔트한 후, 이전과 같은 14G 척추 바늘을 사용해 100mL 세척 매체에 펠릿을 다시 부탁합니다.
13. 부유물을 멸균된 500 μm 체로 걸러내어 무균 600 mL 비커 위에 올려 큰 미소화 조직을 제거합니다.
    참고: 췌장 관류 및 세척이 최적으로 이루어졌다면, 체에 최소한의 지방 조직과 관류되지 않은 췌장이 남아 있지 않습니다.
14. 체를 10mL 세척 매체로 헹구어 갇힌 조직을 회수하세요.
15. 여과액을 새로운 200 mL 원뿔 튜브로 옮기세요.
16. 200 × g 원심분리기에서 4 °C에서 5분간 가열합니다.
17. 상원액을 디캔트한 후 10 mL 혈청학적 피펫을 사용해 100 mL 세척 배지에 재현탁합니다.
    참고: 아이슬렛에 노출되기 전에 FBS 함유 완충제로 피펫 팁을 미리 적셔서 세포 손실을 최소화하세요.
18. 원심분리기에서 600 × g에서 4 ° C에서 5 분간 가열합니다.
19. 상청액을 조심스럽게 흡입하여 건조한 펠릿을 얻으세요.
20. 원심분리기 온도를 22°C로 설정하여 구배 분리를 준비하세요.
    참고: 이 과정은 샘플 없이 2000 x g 원심분리기를 22 °C에서 15분간 15분간 돌리면 신속히 진행할 수 있습니다.

5. 섬 정화

1. 50 mL 원뿔관 수를 확인하려면 표 3 을 참조하십시오.
   참고: 전체 펠릿 부피를 고르게 분배하려면 표 3을 참고하여 약 2-3 mL의 펠릿 소화를 각 구배 튜브에 나누도록 하십시오. 약한 섬 밴드 분리가 나중에 관찰된다면, 분리 해상도를 높이기 위해 추가 그라디언트 튜브를 사용하세요.
2. 10 mL 혈청학 피펫 팁을 1.108 g/cm³ 밀도 구배 용액으로 미리 적시 하여 섬이 팁 내부 표면에 부착되지 않도록 합니다.
3. 각 조직 펠릿을 15 mL의 1.108 g/cm³ 기울기 용액에 재현탁하라, 2 mL 펠릿 부피에 미리 적은 10 mL 혈청 피펫을 사용한다. 총 부피가 10mL를 초과함에도 불구하고, 더 작은 피펫 폭은 보다 제어된 혼합과 효율적인 펠릿 해리를 가능하게 합니다. 고르게 부드럽게 섞으세요.
4. 각 50mL 원뿔관 바닥에 세포 현탁액 15mL를 조심스럽게 분사하여 튜브 벽과 접촉하지 않도록 하여 깨끗한 구배 수준을 유지합니다.
5. 미리 적재된 그라디언트 주사기를 사용해 1.096 g/cm³ 그라디언트 10 mL를 순차적으로 겹쳐 넣고, 이어서 1.069 g/cm³ 그라디언트 10 mL를 덧쉰다.
6. 각 기울기를 주사기 펌프로 분당 5mL 속도로 분당 분량으로 분량을 분당 16G의 바늘 끝을 튜브 내부 벽에 대고 배치하여 그라데이션 혼합을 방지합니다.
7. 원심분리기는 22°C에서 700 × g 에서 15분간 원심분리하며, 원심분리기 가속도는 3, 감속은 0으로 설정하여 구배 혼합을 방지합니다.
   참고: 감속 시간이 길어진 점을 고려할 때, 전체 원심분리 사이클은 약 45분이 소요됩니다. 시간을 면밀히 관찰해야 하며, 구배 혼합과 세포 손상을 방지하기 위해 섬을 신속하게 수집해야 합니다. 필요하다면 밀도 차이를 고려하기 위해 부피가 아닌 무게 단위로 균형 맞추기 튜브를 준비하세요. 튜브를 제거한 후 원심분리기를 4°C로 재설정하고, 가속과 감속을 9로 설정하여 다음 단계를 준비합니다.
8. 원심분리 후에는 1.069-1.096 g/cm³와 1.096-1.108 g/cm³ 구배층 사이의 경계에 위치한 섬층을 식별합니다( 그림 3D 참조).
9. 세척 매체로 미리 적신 파스퇴르 피펫을 사용해 상단층에 모인 조직을 조심스럽게 흡입하여 버리세요.
10. 또 다른 파스퇴르 피펫을 적셔 섬 층을 채취한 뒤, 세척 매체 5mL가 들어있는 미리 냉각된 200mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
11. 세척 매체를 사용해 미리 냉각한 200 mL 원뿔 튜브 용량을 200 mL로 올립니다.
12. 600 × g 에서 원심분리기를 5분간 하고 상청액을 디캔트합니다.
13. 펠릿을 미리 적신 10mL 혈청학적 팁을 사용해 30mL 세척 매체에 재현탁합니다.
14. 섬 입을 개선하기 위해 미리 습한 10mL 혈청학적 팁을 사용하여 새로운 50 mL 원뿔 튜브로 현탁액을 옮깁니다.
15. 같은 200mL 원뿔 튜브를 20mL 세척 매체로 헹군 후 나머지 섬들이 포함된 50mL 원뿔 튜브로 옮깁니다.
16. 50mL 원뿔형 원뿔 배지를 300 × g, 4 °C에서 5 분간 원 심분리합니다.
17. 상청액을 디캔트한 후 50mL의 섬 배양 배양액에 다시 부탁합니다( 표 1 참조).
    참고: 수동 정량 측정법으로 아이슬릿을 세는 경우 이 단계에서 100 μL 알리코트를 제거하세요.
18. 조직 배양 처리되지 않은 100mm 페트리 접시에 균등하게 배판하며, 루이스 쥐 췌장 5개당 1판씩 사용합니다.
    1. 총 섬 배지 부피는 췌장 개 수 ÷ 5 × 10 mL 식으로 계산합니다.
    2. 계산된 매체 부피의 절반으로 아슬렛 펠릿을 재현탁한 후, 정해진 플레이트 수에 고르게 분포합니다.
    3. 잔류 아일릿이 포함된 50mL 원뿔형 튜브를 계산된 배지의 나머지 절반으로 헹구고, 같은 플레이트에 이 워시를 피펫팅하여 접시당 최종 부피 10mL를 얻습니다( 그림 3E 참조).
19. 25°C에서 5% CO₂에 하룻밤 배양하세요. 각 페트리 접시 옆에 24시간마다 3mL의 아이슬렛 배양 배지를 넣고 부드럽게 휘저어 배지를 보완합니다.
20. 섬 세기(6단계)로 진행하세요.

그림 3: 고립된 섬의 췌장 소화 및 정화. 집합된 췌장 소화에서 섬 정화까지의 순차적 단계를 대표하는 이미지입니다. (A) 효소 소화 전에 관류 췌장을 모으는 것. (B) 효소 소화 후 췌장이 파편화됨. (C) 균일한 조직 현탁, 기계식 후. (D) 원심분리 전(왼쪽)과 원심분리 후(오른쪽)의 밀도-구배 튜브들, 구배 경계면에 보이는 섬띠가 동그라미 쳐진 경우. (E) 채집 직후 0일차 섬의 밝은 시야 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

6. 섬 세기

1. 수동 섬 수량 수집.
   1. 5.16단계에서는 200 μL 피펫과 일반 200 μL 팁을 사용해 섬 현탁액의 100 μL 알리코트 3개를 추출합니다.
      참고: 측정을 위해 알리코트를 취할 때는 피펫 혼합을 통해 아이슬릿이 매지에 균등하게 부유되도록 하세요.
   2. 각 알리코트를 1 mL 1× PBS가 들어 있는 2mm × 2mm 격자 격자 접시에 옮깁니다.
   3. 역현미경으로 섬을 세고, 접안렌즈 렌즈 삽입물로 직경별로 분류합니다.
      참고: 모든 섬이 원형인 것은 아닙니다; 카운트 내내 수평 또는 수직 측정을 준수하세요.
   4. 표준화된 변환표( 표 4 참조)를 사용하여 150 μm 섬 등가물의 총 수를 계산하십시오.
      참고: 각 샘플의 IEQ를 비교하세요. 알리코트의 IEQ가 30% 이상 차이가 나면, 가장 유사한 알리코트들의 평균을 적용하세요.

7. 안전 수칙

1. 모든 외과 및 조직 처리 절차는 적절한 경우 생물안전 캐비닛 내에서 무균 상태로 수행하세요. 시약과 휴지 취급 시 안전 고글, 실험복, 장갑, 수술용 마스크 등 개인 보호 장비(PPE)를 착용하세요.
2. 적절한 수술 도구와 개인 보호 장비와 함께 무균 환경에서 췌장 채취를 수행하세요. 흡입 노출을 방지하기 위해 기관 지침에 따라 아이소플루란 및 기타 마취제를 다루세요.
3. 동물 조직, 날카로운 도구, 생물학적 위험 폐기물을 기관 생물안전 프로토콜을 준수하여 처리합니다. 효소 시약과 생물학적 물질은 별도 명시가 없는 한 얼음 위에 보관하여 활성과 생존 가능성을 유지합니다.

결과

다음 결과는 설명된 방법으로 수행된 전형적인 섬 분리 사례로, 12개의 루이스 쥐 췌장을 병행하여 처리한 것입니다.

수확량과 크기 분포

수동 알리코트 카운팅과 IEQ 변환

"Islet Counting" 6.1 섹션에 설명된 대로 혼합 섬 현탁액에서 두 개의 독립 100 μL 알리코트가 얻어졌으며, 직경 빈(50-100 μm, 100-150 μm, 150-200 μm, 200-250 μm, 250-300 μm)으로 계수되었습니다. 카운트는 표준 등가율표를 사용하여 섬 등가물(IEQ; 150 μm 기준)로 변환하고 총 현탁 부피로 외삽했습니다( 그림 4A 참조). 시험 분리(n = 12)를 통해, 50-100 μm 빈에 중앙 섬 직경이 있는 3330 IEQ/췌장의 수율이 나왔습니다. 복제 알리코트는 빈당 18.8%(변동 계수)로 일치했으며, 이는 수동 계산 방법을 사용할 경우 예상되는 중간 정도의 변동을 나타냅니다. 이전 14회의 섬 분리 중 이 방법은 평균 1353(SD 607) IUQ/췌장을 생성했습니다.

자동 전체 판 정량화

수동 IEQ를 벤치마킹하기 위해 현미경으로 D1에서 밝은 필드 이미지를 획득한 후 스티칭하여 전체 접시 합성 이미지(4× 대목적 렌즈; 1/100초 노출)를 생성했습니다. 자동 크기 측정과 객체 정량화는 Fiji와 코딩을 사용해 50-600 μm의 사전 정해진 크기 임계값으로 수행되었습니다. 이미지는 먼저 배경 변화를 줄이고 대비의 균일성을 높이기 위해 사전 처리되었습니다. 섬 구조는 주변 조직에 대한 강도 차이를 기반으로 확인되어 이진 물체 마스크를 생성했습니다. 인접하거나 부분적으로 접촉하는 섬들은 물체 수를 과소평가하지 않도록 분리되었다. 지정된 크기 범위를 벗어난 물체는 잔해와 비섬 조직을 제거하기 위해 제외되었다. 각 보존된 물체에 대해 면적과 x축 및 y축 직경을 포함한 형태계측 매개변수를 추출했습니다. 그 후 섬들은 직경별로 분류되었고, IEQ는 각 크기 빈의 섬 수에 대응하는 변환 계수를 곱하여 계산했습니다. 자동 크기 측정을 통해 총 98,832개의 객체가 생성되었으며, 평균 x축과 y축 직경은 각각 117 μm, 116 μm, 추정 총 16,350 IEQ로 추정되었으며, 이는 D0에서 측정된 수동 IEQ와 강한 상관관계를 보였습니다(Spearman r = 0.937, p = 0.0048; 그림 4A-C 참조).

섬 세포 탈락

정제 후 2시간 후와 1일차(D1)에 동일한 방법으로 "자동 전체 판 정량화"를 사용하여 초기 섬 안정화("탈모")를 평가하는 전체 플레이트 이미지가 촬영되었습니다. 2시간에서 D1까지 객체 수는 0.9%, IEQ는 -6.11% 변화했습니다( 그림 4D 참조). D0와 D1 간의 섬 직경 쌍 비교에서는 통계적으로 유의한 중앙값 2 μm 감소가 나타났다(Wilcoxon signed rank test, p = 0.0136, n = 2820). 하지만 이 변화의 작은 규모는 생물학적이거나 임상적으로 의미가 있을 가능성은 낮습니다.

그림 4: 섬 크기 분포, 상관관계, 조기 탈락의 정량적 평가. 수동 및 자동 분석을 통해 얻은 섬 측정값의 그래픽 요약. (A) 0일차(D0) 표준 섬 등가 IEQ 크기 빈 간 수동 정량화에 기반한 섬 크기 분포. (B) 1일차(D1) 섬 크기 분포는 동일한 표준화된 IEQ 크기 빈 내에서 자동 이미지 기반 측정에 의해 결정되었습니다. (C) IEQ 크기 빈 간 수동 D0와 자동 D1 정량화 간의 상관관계. (D) 동일판의 자동 측정을 위한 D0과 D1 사이 섬 직경 분포의 박스플롯. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

순도 (내분비 대 외분비 함량)

디티존(DTZ) 염색

D1에서는 상온에서 DTZ로 30초간 염색한 섬들(n = 451)을 즉시 밝시야 현미경(4× 대가, 1/20초 노출)으로 영상화했습니다. 피지에서는 남은 픽셀 면적이 전체 섬 면적에 해당하도록 배경 픽셀을 제거했습니다. DTZ 음성 외분비 조직 영역은 어두운 색상 대비로 식별되며, 올가미 도구를 사용해 수동으로 선택했고, 관심 영역의 각 영역은 자동으로 픽셀로 기록되었습니다. 내분비 순도는 전체 섬 픽셀에 비해 DTZ 양성 픽셀의 비율로 계산되었으며, 순도는 98.56 ± 0.38%였습니다(그림 5A).

생존 가능성 및 기능적 성능

포도당 자극 인슐린 분비(GSIS)

각 시점(D1, D3, D7)마다 크기가 일치하는 15개의 섬이 손수 선택되어 24웰 판의 개별 우물에 배치되었으며, 이 판은 4배로 준비되었습니다. 섬들은 37 °C 5%_CO2 환경에서 크렙스 완충제에서 저-고-저 포도당 자극 프로토콜 하에 배양되었습니다: 먼저 저포도당(2.8 mM, 60분), 이어서 고혈당(16.7 mM, 60분, 표 1 참조)에서 배양했습니다. 각 잠복 기간 종료 시 배출 분획을 수집하고, 인슐린 농도는 쥐 인슐린 ELISA 분석법으로 정량화되었습니다. 자극 지수는 고혈당과 저혈당 상태에서의 인슐린 분비 비율로 계산되었습니다. 자극 지수는 각각 1일차, 3일차, 7일차에 9.37, 8.34, 6.7이었으며, 유의한 차이는 없었다(그림 5B).

생체/죽음 염색

D1, D3, D7에서는 15개의 섬이 직접 선별되어 제조사 지침에 따라 Live/Dead 생존 키트로 염색되었습니다. 간단히 말해, 섬들은 25°C에서 30분간 생사염색 용액에서 배양한 후, 일정한 현미경 설정으로 영상화하여 시간대(4배 객관; 1/30초 노출, 텍사스 레드 및 GFP 필터)를 비교할 수 있도록 했습니다. 생존 가능성은 섬 분할과 형광 측정을 위해 scikit-image를 사용하는 Python 스크립트를 사용하여 정량화되었습니다. 섬은 녹색과 적색 형광 채널을 결합하고, Li의 임계값 기법을 적용해 이진 마스크를 생성하며, 유역 분할을 이용해 접촉하는 섬들을 분리하여 식별했습니다. 물체들은 잔해와 유물을 제외하기 위해 구역별로 필터링되었습니다. 각 섬에 대해, 생존 가능성은 전체 통합 밀도(녹색 픽셀)의 비율과 전체 통합 밀도(녹색 더, 빨간 픽셀)의 비율로 계산되었습니다. 결과는 D1에서 68± 9%, D3에서 98.2 ± 0.6%, D7에서 100%의 생존 가능성을 보여주었습니다. 70% 에탄올로 10분간 처리한 양성 대조 샘플은 생존율이 2.7± 7.2%를 보였습니다(그림 5C-F 참조).

그림 5: 섬의 순수성, 생존 가능성 및 기능적 반응성 평가. 시간에 따른 고립된 섬 특성의 대표 이미지와 정량적 요약. (A) 디티존(DTZ)으로 염색된 섬들의 대표적인 10× 밝은 시야 이미지로, 붉게 염색된 내분비 섬과 염색되지 않은 외분비 조직을 보여줍니다. (B) 1일차, 3일차, 7일차의 고혈당/저혈당(HG/LG) 자극 지수의 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS) 값. (C-E) 1일차(C), 3일차(D), 7일차(E)의 섬의 생형/죽음형 형광 이미지. (F) 에탄올로 처리된 양성 대조 섬의 생/죽은 형광 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보시려면 여기를 클릭해 주세요.

(a) 세척 매체
구성 요소	최종 집중	양 (mL)
RPMI 1640	-	500 mL
태아 소 혈청	10%	50 mL
펜-연쇄상구균 (10,000 U/mL)	1%	5.5 mL
젠장	25 mM	100만 개 재고에서 12.5mL
L-글루타민	2 mM	200 mM 스톡에서 5mL
(b) 아슬렛 컬처 미디어
구성 요소	최종 집중	양 (mL 또는 g)
RPMI 1640, 포도당 없음	-	500 mL
태아 소 혈청	10%	50 mL
펜-연쇄상구균 (10,000 U/mL)	1%	5.5 mL
젠장	20 mM	1M 재고에서 11mL
피루브산나트륨	1 mM	100 mM 스톡에서 5.5 mL
포도당	5.5 mM	200 g/L 재고에서 2.75 mL
(c) 페니실린-스트렙토마이신 세척액
구성 요소	최종 집중	양 (mL 또는 g)
식염수 용액, 0.9%	-	500 mL
페니실린 스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	2%	10 mL
(D) 소환 버퍼
구성 요소	최종 집중	양 (mL 또는 g)
HBSS	-	500 mL
태아 소 혈청	20%	100 mL
HEPES (1 남성)	2.50%	2.5 mL
(E) 크렙스 완충
구성 요소	최종 집중	양 (mL 또는 g)
dH2O	-	975 mL
나클	115 mM	6.72g
NaHCO3	24 mM	2.02 g
KCl	5 mM	0.3728 g
HEPES (1 남성)	25 mM	25 mL
MgCl2	1 mM	0.0952 g
BSA	0.10%	1 g
CaCl2	2.5 mM	0.2775 g

표 1: 해결책 목록. 섬 분리 및 정화 프로토콜 전반에 걸쳐 사용되는 모든 용액의 조성 및 준비 세부 사항. 각 하위 섹션에는 성분, 최종 농도, 준비 볼륨, 카탈로그 번호가 나열되어 있습니다. (A) 세척 매체는 소화와 정화 과정에서 조직을 헹구고 세척하는 데 사용됩니다. (B) 분리 후 섬 유지 및 생존 가능성에 사용되는 섬 배양 매개체. (C) 페니실린-스트렙토마이신 세척액으로, 채취한 췌장을 소독하고 세척하는 데 사용됩니다. (D) 소효 소화를 종료하고 세포 생존력을 보존하는 데 사용되는 소결 버퍼. (E) 포도당 자극 인슐린 분비(GSIS) 분석에 사용되는 크렙스 버퍼.

췌장 수(pancrease)	콜라겐제 (15.38 mg/mL)	열분해신 (1 mg/mL)	DNAse (100 mg/mL)	작동 버퍼	사용 가능한 600 mL 비커	부피/비커
30	4.5 mL	2.25 mL	450 μL	450 mL	5	25 mL
24	3.6 mL	1.8 mL	360 μL	360 mL	4	25 mL
20	3 mL	1.5 mL	300 μL	300 mL	3	25 mL
16	2.4 mL	1.2 mL	240 μL	240 mL	2	25 mL
12	1.8 mL	0.9 mL	180 μL	180 mL	2	25 mL
10	1.5 mL	0.75 mL	150 μL	150 mL	2	25 mL
최종 콘테스트.	0.15 mg/mL	5 mg/mL	0.1 mg/mL

표 2: 췌장 양에 따른 소화 효소 용액. 다양한 수의 쥐 췌장을 위한 작업 해리 배지(WDM)를 준비하기 위해 필요한 콜라겐제, 열해리신, DNase I 양. 각 효소의 최종 농도는 표 하단에 나열되어 있습니다.

췌장 수(pancrease)	50 mL 튜브 번호	부피/주사기	1,096개의 주사기 수	1,068개의 주사기 수
30	10개의 튜브	50 mL	2	2
24	8개의 진공관	40 mL	2	2
20	6개의 진공관	30 mL	2	2
16	4개의 진공관	40 mL	1	1
12	4개의 진공관	40 mL	1	1
10	2개의 진공관	20 mL	1	1

표 3: 췌장 수량에 따른 경배 하중. 50mL 원뿔관 수와 처리된 췌장 수에 따라 섬 정제에 필요한 구배 부피.

섬 지름 범위 (μm)	섬 입자 번호 (AI)	IEQ 변환 계수	범위별 IEQ
50-100	a	* 0.167	a * 0.167
101-150	b	* 0.648	b * 0.648
151-200	c	* 1.685	c * 1.685
201-250	d	* 3.500	D * 3.500
251-300	e	* 6.315	E * 6.315
301-350	f	* 10.352	f * 10.352
> 350	g	* 15.833	g * 15.833

표 4: 섬 동등 변환. 섬 직경 범위를 표준화된 섬 등가물(IEQ)로 변환하는 과정. 표에는 관측된 섬 직경 빈, 범위별 섬 입자 수, 각 크기 범위별 IEQ 변환 계수, 그리고 범위별 IEQ 기여도를 나열합니다.

토론

이 프로토콜은 루이스 쥐에서 췌장 섬을 분리하고 정제하는 고처리량 접근법을 제시합니다. 이 방법의 성공은 섬의 무결성과 기능을 보존하는 여러 중요한 단계에 달려 있습니다. 여기에는 췌장의 정확하고 완전한 관내 관류 관류, 관류된 췌장의 신중한 세척, 그리고 정확한 효소 소화 시간이 포함됩니다. 췌장의 균일한 팽창을 달성하고 콜라게나제-열해산-DNase 혼합물이 균등하게 분포되도록 하는 데 일관된 장기 관류가 필수적이며, 이 혼합물은 각각 세포외 기질을 소화하고, 효소 침투를 높이며, DNA 매개 점도를 감소시키는 역할을 합니다^21,22. 관류 부족은 조직 소화가 불완전하고 섬의 상당 부분이 손실될 수 있는데, 체로 소화되지 않은 조직이 걸러져 나갑니다. 마찬가지로, 소화 전에 지방이나 혈관 조직을 적절히 제거하지 않으면 비내분비 불순물이 유입되어 순도를 낮출 수 있습니다. 마지막으로, 장기간의 소화는 과도한 세포외기질 파손으로 인한 섬의 분리 해체를 초래하며, 최적이 아닌 소화는 척수 바늘을 통한 기계적 소화에 저항하는 소화 되지 않은 조직을 생성합니다. 이러한 단계는 가장 흔한 기술적 함정을 나타내며, 교육 및 최적화 과정에서 신중히 모니터링해야 합니다.

이 방법은 루이스 쥐를 위해 특별히 설계되었으나, 소화 시간과 효소 비율 23,24,25,26의 소규모 재최적화를 통해 다른 균주나 종에도 적용할 가능성이 높습니다. 일부 실험실에서는 특정 효소 로트나 조직 특성에 맞게 수확량을 최적화하기 위해 작업 해리 배지(WDM) 내 콜라게나제, 열분해신, DNase I의 비율을 조절하기도 합니다. 이를 위해 실험실은 제조사의 효소 및 조직 최적화 단계별 가이드를 꼼꼼히 따르며, 모든 경우에 0.1 M EDTA, 시스테인, 머캅토에탄올, 프로테아제 억제제, 혈청, 알부민과 같은 성분의 첨가를 피해야 합니다. 이들은 콜라게나제, 열분해 신, DNase 1 효소 활성을 억제할 수 있기 때문입니다²⁷. 효소 혼합물이 해리 전 확실한 작동 시간은 발표되지 않았으나, 이전 데이터는 췌장의 장기간 냉보존이 섬 수율과 기능에 부정적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다²⁸. 경험적으로, 우리 프로토콜에서는 첫 번째 췌장을 얼음 위에 올려 세척한 후 37°C 수조로 옮긴 사이의 총 냉 허혈 기간이 1.5시간 이내로 유지될 때 성공적인 분리가 일관되게 이루어졌음을 발견했습니다. 최종 사용자 애플리케이션에 따라 이 매개변수의 추가 최적화가 필요할 수 있습니다.

견고함에도 불구하고, 이 프로토콜은 여러 실용적·기술적 한계가 있습니다. 첫째, 효소 혼합물(콜라겐제, 열분해신, DNase I)과 밀도 구배는 효율적인 조직 해리와 섬 분리에 필수적이지만, 상당한 비용을 초래합니다. 효소 조합 선택은 췌장 세포외기질의 구조적 특성과 효과적인 조직 해리와 섬의 무결성 보존의 균형을 맞춰 결정되었습니다. 각 효소 성분은 뚜렷한 역할을 수행합니다: 콜라겐제는 섬유 및 저저막 콜라겐을 표적으로 하여 섬을 해방시키고; 중성 프로테아제인 열분해신은 비콜라겐 기질 단백질과 세포 간 접착 분자를 절단하여 필요한 콜라겐제 노출을 줄입니다; 그리고 DNase I은 용해 세포에서 방출되는 DNA에 의해 발생하는 점도를 최소화합니다 ^29,30,31. 저가의 소화 효소 제형도 상업적으로 구할 수 있지만, 그 순도는 변동적이며 효소 성능을 저해할 수 있습니다^13,23. 콜라게나제가 박테리아 배양에서 분리되기 때문에 추가 정제 단계가 내독소 오염을 줄이지만, 비용이 크게 증가합니다^13,23.

콜라게나제의 경우, 병당 약 2,000에서 4,000 Wünsch 단위의 활성 제제를 권장하며, 이는 적당한 용량에서 효율적인 해리를 지원하면서 장기간 소화를 피할 수 있습니다. 특히, 블렌드에는 콜라겐제 클래스 I과 클래스 II의 균형 잡힌 비율이 포함되어야 하며, 이는 콜라겐제 II 대비 총 콜라겐제 비율이 약 0.3-0.5에 해당합니다. 이 비율은 강한 콜라겐 분해 활성을 제공하면서도 비콜라겐 세포외 기질의 과도한 파괴를 제한합니다. 또한, 콜라겐제 혼합물에는 이미 언급한 이유들로 중성 프로테아제 활성(약 150,000-250,000 단위)과 DNase가 보완되어야 합니다.

품질 관리 관점에서 각 로트는 낮은 내독소 부하(≤50 EU/mg 단백질), 높은 효소 순도(HPLC 기준 ≥85%), 그리고 검증된 로트 간 활성에 대한 문서가 포함되어야 하며, 효소 순도와 조성은 제조사에 따라 크게 다를 수 있습니다. 마지막으로, 로트 조성의 차이는 소화 일관성과 아슬렛 수율에 영향을 미칠 수 있으므로, 로트별 내부 검증이 필요합니다. 이러한 검증은 이 프로토콜에 설명된 표준화된 소화 조건을 따르고, 이후 소화 효율과 섬 형태를 평가함으로써 달성할 수 있습니다. 효소 성능이 최적이 아닌 지표로는 조직 해리 불완전, 경계가 불규칙하거나 거친 섬, 분리를 위해 과도한 기계적 전단이 필요하며, 이 경우 소화 시간의 적정이 필요할 수 있습니다.

밀도 구배에도 유사한 고려사항이 적용됩니다. 우리는 1.2 g/mL까지 안정적인 구배를 형성하고 섬^{분리 32,33}에서 오랜 실적을 가진 비이온 호수성 자당-에피클로로히드린 공중합체인 비이온 자당-에피클로로히드린 공중합체를 선택했습니다. 아이오딕사놀은 잘 검증된 대안이며, 인간 섬 연구에서는 아이오딕사놀 기반 구배가 생존력과 기능을 유지하면서 섬 회복을 개선할 수 있음을 보여줍니다 34,35,36,37. 그러나 설치류 데이터는 결론을 내리지 못했으며, 일부 연구에서는 아이오딕사놀을 사용한 결과가 더 우수했고, 다른 연구는 polysucrose 기반 구배에서 더 나은 생존성과 기능을 보였습니다^32,35. 무엇보다도, 실험실 간 재현성을 높이기 위해 상업적으로 제조되고 품질 관리된 구배 솔루션의 사용을 권장합니다. 폴리자당 기반 구배는 섬 분리에 최적의 밀도로 널리 제공되며, 아이오딕사놀 구배는 일반적으로 사내 희석으로 준비되어 추가적인 변동성을 제공합니다. 두 번째 제한은 외과적 적출이 높은 수준의 기술적 숙련도를 요구한다는 점으로, 특히 오디 괄약근을 통한 관내 관류와 신속한 췌장 절제술이 필요합니다. 작은 지연이나 정렬 불균형도 조직 손상, 누출, 불균일한 관류 또는 장기간 열질 허혈을 초래하여 섬 수율과 생존력을 저해할 수 있습니다. 이 한계를 완화하기 위해 프로토콜에는 상세한 절차적 설명과 색상으로 구분된 해부학적 랜드마크가 포함된 원본 그래픽 보조 자료가 포함되어 있어 이해를 돕습니다. 신규 운영자는 완전한 분리를 수행하기 전에 관류 기술에 익숙해지도록 권장되며, 생체 수확 시도 전에 사체에 대한 연습이 권장됩니다.

셋째, 최대 효율을 위해서는 이 프로토콜이 팀워크를 조율해야 합니다. 췌장 채취와 효소 소화 과정에는 일반적으로 세 명의 훈련된 운영자가 필요합니다: 한 명은 멸균 수술, 한 명은 멸균 상태에서 췌장을 청소하며, 한 명은 비멸균 환경에서 순환 및 안락사를 진행합니다. 소화 후, 숙련도가 달성되면 일반적으로 더 적은 수의 조작자만으로도 후속 정제 단계를 수행할 수 있습니다. 이러한 조정은 초기 물류 요구가 필요하지만, 비교적 짧은 시간 내에 여러 동물로부터 많은 섬을 분리할 수 있게 해주어, 덜 조율된 작업 흐름에 비해 전체 처리량을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 기술적으로 까다롭고 자원을 많이 소모하지만, 이러한 한계는 모든 섬 분리 방법에 공통적으로 존재합니다. 표준화된 소화 조건, 구조화된 훈련, 그리고 조정된 실행을 강조함으로써, 이 고처리량 접근법은 분리당 시간과 노동을 줄이고 훈련된 팀이 수행할 때 일관되고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있습니다.

기존 설치류 섬 격리 프로토콜과 비교할 때, 이 방법은 처리량, 재현성, 일관성 면에서 상당한 이점을 제공합니다. 전통적인 단일 장기 소화는 수작업으로 직접 골라내는 데 크게 의존하며, 순도가 다양하게 변하는 경우가 많습니다^. 반면, 저희 프로토콜은 통합 소화와 밀도-구배 정제를 활용하여 준비 시간과 샘플 간 변동성을 크게 줄이면서도 높은 섬의 생존성과 기능적 반응성을 유지합니다. 분리된 섬들은 형태학(디티존 염색), 생존성(생/사망 분석), 기능(포도당 자극 인슐린 분비) 등 종합적으로 특성화되어 방법의 견고함을 확인하였습니다. 이 표준화된 워크플로우를 종합하여 캡슐화, 이식, 미세생리학적 모델링 등 하위 응용 분야에 적합한 풍부하고 깨끗하며 기능적인 섬 준비물을 생성할 수 있습니다 38,39,40. 중요하게도, 이 기법으로 분리된 루이스 쥐 섬들은 전임상 모델에서 당뇨병을 역전시켰으며, 이는 이 재현 가능하고 확장 가능한 접근법의 번역적 중요성을 강조합니다⁴¹.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
21 G x 2인치. BD 프리시전 글라이드 니들	BD	305129
500 및 마이크로; m 황동 프레임과 304 스테인리스 스틸 스크린, 직경 3인치 x 깊이 1인치 (체수 번호 35)	맥마스터-카	34735K525
에어타이트 멸균 주사기, 루어 락	피셔 사이언티브	14-817-178
바이오겔 PI 울트라터치 M	M&WOOML; 인리케	42665
본 가위; 이성애; 날카로운 가운데; 날개 길이 15 mm; 전체 길이 3 1/2"	로보즈	RS-5840
브레인트리 사이언티픽 GERMINATOR 500 드라이 멸균기	피셔 사이언티브	NC9956482
셀-IQ 시리즈 5.8 입방피트. CO2 실험실 인큐베이터	PHCBI	MCO-170AICUVHL-PA
코닝 100mm TC 처리되지 않은 배양 접시	코닝	430591
코닝 태아 소 혈청, 500 mL, 일반, USDA 안전 테스트 (열 비활성화)	코닝	35011CV
코닝 섬 경배 1.069 (밀도 1.069 g/cm3)	코닝	99-815-CIS	회사에서 특별 요청이 필요합니다
코닝 아일렛 경배 1.096 (밀도 1.096 g/cm3)	코닝	99-691-CIS	회사에서 특별 요청이 필요합니다
코닝 아일렛 경배 1.108 (밀도 1.108 g/cm3)	코닝	99-692-CIS	회사에서 특별 요청이 필요합니다
코비디언 텐더소브 언더패드	피셔 사이언티브	22-225-102
DNase I 2등급	로슈	10104159001
팔콘  50 mL 고투명 원뿔 원심분리기 튜브	피셔 사이언티브	14-432-22
피셔브랜드 알루미늄 호일, 표준 궤간 롤	피셔 사이언티브	01-213-100
피셔브랜드  부직포 거즈 스펀지	피셔 사이언티브	22-028-559
피셔브랜드 재사용 유리 중장 저형 비커	피셔 사이언티브	FB101600
형광 미기경 및 nbsp; BZ-X810	키엔스	BZ-X810
포도당 용액	깁코	A2494001
할시 마이크로 바늘 홀더	파인 사이언스 툴즈	12500-12
HBSS, 칼슘, 마그네슘, 페놀 레드 없음	깁코	14025092
HEPES (1 남성)	깁코	15630080
정혈겸자 클래식 크릴 5-1/2인치 길이	맥케슨	1231217
허드슨(에왈드) 겸자	로보즈	RS-5238
주사막 단삭 1-1/2인치 길이 16게이지 일반 벽 안전장치 없음	맥케슨	43481
L-글루타민 (200 mM)	깁코	25030081
리버레이제 T-플렉스, 연구용 등급	로슈	5989132001
포유류 세포용 생백신/사망 생존 가능성/세포독성 키트	인비트로젠	그리고 nbsp; L3224
MATLAB 소프트웨어 패키지	수학 작품	https://www.mathworks.com/pricing-licensing.html?prodcode=ML
NE-4000 2채널 프로그래밍 주사기 펌프	시린지펌프	NE-4000-미국
바늘, 하이포 스트렝스 디스프 27GX1/2" (100/BX) 엑스린트	맥케슨	408877
Nunc 세포 배양/페트리 접시	열과학	174926
올림푸스 CKX41 역위상 대비 현미경	올림포스	CKX41-B
PBS, pH 7.4	깁코	10010023
페니실린(Penicillin) 스트렙토마이신 (10,000 U/mL)	깁코	15140122
RPMI 1640	깁코	11875093
RPMI 1640, 포도당 없음	깁코	11879020
피루베이트 나트륨 (100 mM)	깁코	11360070
피루베이트 나트륨 (100 mM 재고)	깁코	11360070
소르발 ST 16R	열과학	75004381
스테인리스 스틸 304 주사기 바늘	밀리포어 시그마	Z117013-1EA
수술용 드레이프, 일회용, 36인치 X 100야드	코베트루스	10408
수술용 가위 - ToughCut	파인 사이언스 툴즈	14054-13
엄지 드레싱 겸자 4.5인치 톱니 모양의 섬세한 끝 폭 1.3mm	로보즈	RS-8120
Thermo Scientific Nunc 200mL 원심분리관	열과학	14-962-17
Thermo Scientific Nunc 원심분리기 병 어댑터 및 쿠션	열과학	12-565-283B
TSDUB15 15L 더브노프 셰이킹 워터 배스	피셔 사이언티브	300610298
TX-400 4 x 400 mL 스윙잉 버킷 로터	열과학	75003181
타이곤 S-50-HL	타이곤	AAXoooo3
초민감 쥐 인슐린 ELISA 키트	크리스탈 켐	90060