유동 세포분석에서 다양한 게이팅 전략을 사용한 정자 DNA 분석 결과 비교

요약

다각형 게이팅(PGG)과 십자형 게이팅(CFG)은 정자 DNA 무결성을 검출하기 위한 유세포 측정 방법입니다. PGG는 DNA 단편화 지수(DFI)와 높은 DNA 염색 지수(HDS)를 측정합니다. CFG는 심한 DFI, 경미한 DFI, 그리고 전반적인 DFI를 보고합니다. 이 연구는 이들 간의 결과와 상관관계를 비교하는 것을 목표로 합니다.

초록

정자 DNA 완전성은 성공적인 수정, 배아 발달, 그리고 지속적인 임신을 보장하는 데 핵심적인 요소입니다. DNA 변성 후 유세포분석을 이용한 정자 염색질 구조 평가(SCSA)와 아크리딘 오렌지 염색은 정자 DNA 평가의 골드 스탠다드로 간주됩니다. 유세포분석법 기반 정자 DNA 단편화 지수(DFI) 평가를 위한 두 가지 게이팅 전략이 문헌에 보고되어 있습니다: 다각형 게이팅(PGG)과 십자형 게이팅(CFG). 본 연구의 목적은 PGG와 CFG 간의 분석 결과를 비교하고, 기본 정액 분석 매개변수와의 상관관계를 분석하는 것이었습니다. 두 방법으로 독립적으로 얻은 데이터는 Bland-Altman 그래프와 회귀분석 등 통계 분석을 통해 비교되었습니다. 우리 병원 생식 센터에서 생식 평가를 받는 총 121명의 남성 외래 환자를 완전 무작위 표본 추출 방법으로 선정하였습니다. 정자 DFI 및 관련 지표는 각각 PGG와 CFG를 이용한 유세포검사로 검출되었습니다. 결과는 두 방법으로 얻은 DFI 값이 좋은 일치를 보였음을 보여주었다. PGG 방법의 DFIp와 CFG 방법의 DFIm, DFIs, DFIc 간의 상관계수는 각각 0.6497, 0.9404, 0.9667이었습니다(모두 p < 0.01). 높은 DNA 염색 지수(HDS)는 DFIs와 약간의 음상관관계를 보였다(r = -0.3042, p < 0.05). 점진적으로 운동성이 심한 정자의 비율은 DFIp, DFIs, DFIc와 음의 상관관계를 보였다(r = -0.3824, -0.3794, -0.3574, 모두 p < 0.05). HDS와 정액량, 정자 농도, 총 정자 수 또는 PR(%)과 유의한 상관관계는 관찰되지 않았습니다. 이 결과는 DFI가 남성 생식력과 더 밀접하게 연관되어 있음을 시사하며, 이 매개변수를 제공하는 CFG 방법이 정자 DNA 손상의 임상 평가에 더 적합할 수 있음을 시사합니다.

서론

정자 DNA 완전성은 정자 핵 내 DNA 분자 구조의 완전성과 기능적 안정성을 의미합니다. 구체적으로, 정상적인 염색질 구조, 파손이나 산화 손상이 없는 온전한 염기서열, 그리고 자손에게 유전 정보를 정확하게 전달하는 능력이 특징입니다. 정자 생성 과정에서 산화 스트레스^{가 증가하거나}, 염색질 재형성이 비정상이^{거나, 정}자가 환경 독소에 의해 영향을 받으면³, 정자 DNA의 완전성이 손상되어 염기 불일치, 손실, 변형, DNA 첨가 및 가교 결합, 단가닥 및 이중 가닥 단절 등이 발생합니다. 더불어, 손상된 정자 DNA는 남성 생식력을 저해하고 보조 생식 기술(^ART)에서 임신 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며, 재발^{성 임신 손실} 위험도 증가시킵니다. 2021년 유럽 비뇨기과 협회(EAU)는 남성 생식^{평가 시스템에} DFI 검사를 포함할 것을 권고했습니다.

현재 정자 DNA의 무결성은 주로 정자 DNA 단편화 지수(DFI)를 통해 평가됩니다. 유세포분석을 이용한 정자 염색질 구조 분석법(SCSA)은 DFI⁷을 평가하는 주요 방법입니다. 문헌에는 정자 DFI 검출을 위한 두 가지 유세포 게이팅 방법이 보고되었습니다. 하나는 다각형 게이팅 방법(PGG)으로, 정자 DFI와 HDS⁸과 같은 두 가지 주요 지표를 동시에 보고할 수 있습니다. PGG는 더 작은 검출 변동 계수와 우수한 반복성을 특징으로 하는 고전적인 SCSA 접근법입니다^. 하지만 DNA 손상의 심각성을 구분할 수는 없습니다. 또 다른 유형은 십자형 게이팅 방법(CFG)으로, 이는 정자 DNA의 심각한 손상 마지커(DFIs), 경미한 손상 정자 DNA 마커(DFIm), 그리고 십자형 게이팅 방법의 전체 DFI(DFIc)를 보고할 수 있습니다. DFIc는 DFIs와 DFIm의 합과 같습니다. 현재 정자 DNA 무결성 평가 기술과 비교할 때, CFG 방법은 정자 DNA 손상의 심각성을 반영할 수 있습니다¹⁰.

정자 질 평가에 더 적합한 방법을 결정하기 위해, 본 연구는 PGG 방법과 CFG 방법을 모두 사용하여 정자 내 DFI 및 관련 매개변수를 측정하였습니다. 이 두 방법의 결과와 기존 정액 분석 매개변수 간의 상관관계를 비교하였다. 우리가 아는 바로는, PGG와 CFG 두 방법론 간 검출 결과 상관관계를 분석한 최초의 연구입니다.

프로토콜

이 연구는 난징 의과대학 회안제일병원 부속 의학윤리위원회의 승인을 받았습니다(승인번호: KY-2024-181-01). 본 연구에 사용된 샘플을 사용한 환자들로부터 사전 동의를 받았습니다. 그림 1에 제시된 워크플로우의 전체 회로도. 사용된 시약과 장비의 세부 사항은 재료표에 명시되어 있습니다.

유세포계용 CFG 설정
산성 처리 후, 손상된 DNA를 가진 정자의 핵염색질은 단일 가닥 DNA를 보이지만, 손상되지 않은 정자의 핵 염색질은 온전한 이중 가닥 구조를 유지합니다. 형광 염료인 아크리딘 오렌지(AO)는 단일 가닥 DNA에 결합하여 488nm 레이저에 의해 여기될 때 붉은 형광을 방출합니다. 이중 가닥 DNA에 결합하면 488nm 레이저에 의해 여기될 때 녹색 형광을 방출합니다. 플로우 사이토미터가 포착한 적색 및 녹색 형광 신호 수를 바탕으로, 적색 형광과 적색 및 녹색 형광 총합의 비율을 계산하여 정자 DFI를 나타냅니다.

CFG 설정은 Yang 등이 제공한 개요에 따라 구현^{되었습니다.} 유세포계는 AO 염색된 정상 정자에서 측정된 가장 낮은 녹색 형광과 가장 높은 적색 형광을 경계 기준으로 구성해야 합니다(그림 2). 다음은 CFG 내 각 사분면의 세포 특성 목록입니다:
Q1 사분면은 정상 정자를 나타냅니다. 정자 DNA는 온전했고, AO의 결합량도 미미하여 녹색 형광이 나타났다.
Q2 사분면의 정자는 DNA가 부분적으로 분해되어 형광 현미경 검사에서 주황색으로 보입니다. 이러한 DNA는 복구 가능할 수 있으며, 이 정자는 경미한 DNA 분열(DFIm)을 가진 것으로 분류됩니다¹⁰.
쿼드런트 Q3는 감산된 비특이적 형광으로 정의됩니다.
Q4 사분면의 정자는 DNA가 조각되어 형광 현미경 검사에서 붉게 보이며, 이는 심각한 DNA 단편화(DFI)를 나타냅니다.

Q2와 Q4 사분면의 정자는 모두 분편화된 DNA를 포함하고 있으며, 이들의 합은 DFIc로 정의된다.

유세포계용 PGG 설정
유세포 분석을 위한 다각형 게이트는 Evenson 등에서 설명한 방법을 따라 확립^{되었습니다.} 그림 3에서 볼 수 있듯이, 각 게이트와 관련된 세포 특성은 다음과 같습니다:
P3는 변성 DNA를 가진 세포의 비율을 나타냅니다.
P4는 DNA 염색성이 높은 정자(HDS)를 나타냅니다. 이 정자 그룹은 정상적인 히스톤-프로타민 교환이 없습니다.
P3 및 P4 게이트 외부에 위치한 주요 세포 집단은 정상적인 정자로 구성되며, 붉은 형광은 감소하고 주로 녹색 형광을 방출합니다.

정액 샘플 채취 및 분석
121개의 정액 샘플은 모두 난징의과대학 산하 회안제1병원 생식센터를 방문한 남성들의 것이었습니다. 정액 샘플은 2-7일간의 금단 후 자위행위로 채취되었습니다. 정액 분석은 WHO 인간 정액 검사 및 처리 실험실 매뉴얼 ^11,12의 요구사항에 엄격히 따라 수행되었습니다. 정자 농도 및 운동성 분석은 컴퓨터 지원 정자 분석 시스템(CASA)을 사용하여 수행되었습니다. 각 샘플은 두 번 분석되었습니다. 결과는 두 결과 간 차이가 95% 신뢰구간 내에 있을 때만 평균으로 보고되었으며; 그 외에는 재샘플링과 분석이 이루어졌습니다.

DFI 분석
유세포검사 키트에서 추출한 정자 시약 A 내 정자 농도가 2–3 x 10⁶/mL로 되도록 정액 샘플의 필요한 샘플 부피를 계산하세요. 계산 방법: 원래 정액 샘플의 정자 농도가 M x 10⁶/mL라고 가정하면, 필요한 정액 부피(μL) = 150/M. 계산된 정액량을 유세포계 튜브에 넣고, 50 μL 시약 A를 추가한 후 부드럽게 혼합합니다. 시약 B 100 μL을 넣고 부드럽게 섞은 후 상온에서 30초간 배양합니다. 즉시 300 μL 시약 C를 추가하고 부드럽게 섞으세요. 유세포계의 CFG와 PGG를 사용해 샘플을 검출하고, 최소 5,000개의 정자를 분석합니다.

통계 분석
데이터는 GraphPad Prism 6.0을 사용하여 통계 분석을 수행하였습니다. Bland-Altman 플롯은 평균과 차이를 계산하여 PGG와 CFG 간의 일치 수준을 평가하기 위해 구성되었습니다. 두 방법의 차이를 평균값과 비교하여 그래프로 표시했습니다. 또한 Pearson 방법을 활용하여 PGG와 CFG 간의 상관관계를 분석하였습니다. p 값이 0.05 미만이면 통계적으로 유의한 것으로 확인되었습니다.

결과

121명의 연구 참가자(평균 연령: 32.5세± 4.9세; 범위: 26–44세 중 28명이 무기력정자증, 4명이 소정자증 진단을 받았습니다. 기초 인구통계학적 특성과 정액 분석 매개변수는 표 1에 요약되어 있습니다.

그림 4에서 보듯, Bland-Altman 플롯은 PGG와 CFG 방법으로 얻은 정자 DFI 결과가 우수한 일관성을 보였음을 보여주었습니다(r = 0.9667, p = 0.0000). 두 표본만이 +10% 이상의 차이를 보였고, 세 표본은 -10% 미만의 차이를 보였으며, 비율은 각각 1.7%와 2.5%였습니다.

표 2는 PGG에서 얻은 DFIp와 CFG에서 유래한 세 가지 매개변수(DFIm, DFIs, DFIc) 각각과 강한 양의 상관관계를 보...

토론

WHO 인간 정액 검사 및 처리 실험실 매뉴얼^{6판 12} 는 정자 DNA 완전성을 평가하는 네 가지 방법을 권장합니다: 말단 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(dUTP) 니크 엔드 라벨링(TUNEL), 단세포 겔 전기영동(Comet) 분석, SCSA, 정자 염색질 분산(SCD) 검사. 이 중 SCSA는 유동 세포분석을 통해 분석에 사용되어 고처리량, 효율성, 객관성을 제공하며, DFI 및 HDS⁷과 같은 매개변수를 동시에 보고할 수 있어 고형학 실험실에서 널리 채택되고 있습니다. 전 세계 설문조사에^따르면, 전 세계 생식 임상의의 거의 4분의 1(24.1%)이 정자 DNA 무결성 평가 방법으로 SCSA를 선택했습니다.

SCSA 절차에서 가장 중요한 단계는 적절한 유세포 게이팅을 확립하는 것입니다. 전...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
컴퓨터 지원 정자 분석 시스템	베이징 수이자 소프트웨어 유한 회사	SA-II
유세포 계측기	심천 민드레이 바이오메디컬 일렉트로닉스 유한 회사	사이토 E6
유세포 분석 키트	심천 브레드 바이오테크놀로지 유한 회사
마클러 계수 챔버	세피 메디컬 인스트루먼트
정자 핵 DNA 무결성 키트	심천 브레드 바이오테크놀로지 유한 회사	-