흐름 세포 분석에서 서로 다른 게이팅 전략을 사용한 정자 DNA 분석 결과 비교

Summary

다각형 개판(PGG)과 십자형 개판(CFG)은 정자 DNA 무결성을 탐지하기 위한 유세포 분석 방법입니다. PGG는 DNA 단편화 지수(DFI)와 높은 DNA 염색 지수(HDS)를 측정합니다. CFG는 심한 DFI, 경미한 DFI, 그리고 전반적인 DFI를 보고합니다. 이 연구는 이들 간의 결과와 상관관계를 비교하는 것을 목적으로 합니다.

Abstract

정자 DNA 무결성은 성공적인 수정, 배아 발달 및 지속적인 임신을 보장하는 핵심 요소입니다. DNA 변성 및 아크리딘 오렌지 염색 후 흐름 세포계를 사용한 정자 염색질 구조 평가(SCSA)는 정자 DNA를 평가하는 황금 표준 방법으로 간주됩니다. 정자 DNA 단편화 지수(DFI)의 흐름 세포계–기반 평가를 위한 두 가지 게이팅 전략인 다각형 게이팅(PGG)과 십자형 게이팅(CFG)이 문헌에서 보고되었습니다. 본 연구의 목적은 PGG와 CFG의 검사 결과 간의 관계를 비교하고, 기본 정액 분석 매개변수와의 상관관계를 분석하는 것이었습니다. 두 방법으로 독립적으로 얻은 데이터는 통계적 분석을 사용하여 비교되었으며, Bland-Altman 플롯 및 회귀 분석이 포함되었습니다. 우리 병원의 생식 센터에서 불임 평가를 받는 남성 외래 환자 121명이 완전한 무작위 샘플링 방법으로 선택되었습니다. 정자 DFI 및 관련 지표는 각각 PGG와 CFG를 사용한 흐름 세포계로 검출되었습니다. 결과는 두 방법으로 얻은 DFI 값이 좋은 일치를 보였습니다. PGG 방법의 DFIp와 CFG 방법의 DFIm, DFIs, DFIc 간의 상관계수는 각각 0.6497, 0.9404, 0.9667이었습니다(모든 p < 0.01). 높은 DNA 염색 지수(HDS)는 DFIs와 약간의 부정적 상관관계를 보였습니다(r  = -0.3042, p < 0.05). 진행 모양을 보이는 정자의 비율은 DFIp, DFIs, DFIc와 부정적 상관관계를 보였습니다(r = -0.3824, -0.3794, -0.3574, 모두 p < 0.05). HDS와 정액 부피, 정자 농도, 총 정자 수 또는 PR (%) 사이에는 유의미한 상관관계가 관찰되지 않았습니다. 이러한 결과는 DFIs가 남성 임신력과 더 밀접한 관련이 있음을 시사하며, 이 매개변수를 제공하는 CFG 방법이 정자 DNA 손상의 임상 평가에 더 적합할 수 있음을 시사합니다.

Introduction

정자 DNA 무결성은 정자 핵 내 DNA 분자 구조의 무결성 및 기능적 안정성을 말합니다. 구체적으로, 정상적인 염색질 구조, 파손이나 산화 손상 없는 염기 서열, 그리고 정확한 유전 정보를 자손에게 전달하는 능력으로 특징지어집니다. 정자 생성 과정에서 산화 스트레스가 증가하는 경우¹, 염색질 리모델링이 이상하거나², 정자가 환경 독소에 영향을 받는 경우³, 정자 DNA의 무결성이 손상되어 염기 불일치, 손실, 변형, DNA 첨가 및 교차 결합, 단일 가닥 및 이중 가닥 파손 등이 발생할 수 있습니다. 또한, 손상된 정자 DNA는 남성 생식력을 손상시키고 보조 생식 기술(ART)에서 임신 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다⁴ 및 재발성 임신 상실 위험을 증가시킬 수 있습니다⁵. 2021년, 유럽 비뇨기과 협회(EAU)는 남성 생식력 평가 시스템에 DFI 검사를 포함할 것을 권고했습니다⁶.

현재, 정자 DNA의 무결성은 주로 정자 DNA 단편화 지수(DFI)를 검출하여 평가합니다. 유세포 분석을 이용한 정자 염색질 구조 분석(SCSA)은 DFI를 평가하는 주요 방법입니다⁷. 문헌에는 정자 DFI 검출을 위한 두 가지 유세포 분석 게이팅 방법이 보고되었습니다. 하나는 다각형 게이팅 방법(PGG)으로, 정자 DFI와 HDS 등 두 가지 주요 지표를 동시에 보고할 수 있습니다⁸. PGG는 작은 검출 변이 계수와 우수한 반복성을 특징으로 하는 고전적인 SCSA 접근법입니다⁹. 그러나 DNA 손상의 심각성을 구분할 수 없습니다. 다른 유형은 십자형 게이팅 방법(CFG)으로, 정자 DNA의 심각한 손상 지표(DFIs), 정자 DNA의 경미한 손상 지표(DFIm), 그리고 십자형 게이팅 방법의 총 DFI(DFIc)를 보고할 수 있습니다. DFIc는 DFIs와 DFIm의 합과 같습니다. 현재 정자 DNA 무결성을 평가하는 기술과 비교할 때, CFG 방법은 정자 DNA 손상의 심각성을 반영할 수 있습니다¹⁰.

정자 품질을 평가하는 데 어떤 방법이 더 적합한지 결정하기 위해, 이 연구에서는 PGG 방법과 CFG 방법 모두를 사용하여 정자의 DFI와 관련 매개변수를 측정했습니다. 이 두 방법의 결과와 기존의 정액 분석 매개변수 사이의 상관관계를 비교했습니다. 우리가 알기로는, 이것은 PGG와 CFG 두 가지 방법의 검출 결과 상관관계를 분석한 최초의 연구입니다.

Protocol

이 연구는 난징 의학 대학 소속 화이안 제1 인민 병원 의학 윤리 위원회의 승인을 받았습니다(승인 번호: KY-2024-181-01). 본 연구에 사용된 시료의 환자로부터 동의서를 얻었습니다. 제시된 워크플로우의 전체 개요 다이어그램은 그림 1에 나타나 있습니다. 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 자료 표에 설명되어 있습니다.

흐름 세포계에 대한 CFG 설정
산 처리 후 손상된 DNA를 가진 정자의 핵 크로마틴은 단일 가닥 DNA를 나타내고, 손상되지 않은 DNA를 가진 정자의 핵 크로마틴은 그대로 두 가닥 구조를 유지합니다. 형광 염료인 아크리딘 오렌지(AO)는 단일 가닥 DNA에 결합하여 488 nm 레이저에 의해 흥분되었을 때 붉은색 형광을 발산합니다. 이는 이중 가닥 DNA에 결합하면 488 nm 레이저에 의해 흥분되었을 때 녹색 형광을 발산합니다. 흐름 세포계가 포착한 붉은색 및 녹색 형광 신호의 수에 따라 붉은색 형광과 붉은색 및 녹색 형광의 총합에 대한 비율을 계산하며, 이는 정자 DFI를 나타냅니다.

CFG 설정은 Yang 등¹⁰이 제공한 개요에 따라 구현되었습니다. 흐름 세포계는 AO 염색된 정상 정자에서 측정된 최저 녹색 형광과 최고 붉은색 형광을 경계 참조로 사용하여 구성되어야 합니다(그림 2). CFG의 각 구획에 대한 세포 특성 목록은 다음과 같습니다:
구획 Q1은 정상 정자를 나타냅니다. 정자 DNA가 그대로 유지되었으며, AO의 결합량이 최소화되어 녹색 형광이 나타났습니다.
구획 Q2의 정자는 부분적으로 단편화된 DNA를 가지며, 형광 현미경으로 보면 주황색을 띠며, 이러한 DNA는 수복 가능할 수 있습니다. 이러한 정자는 경미한 DNA 단편화(DFIm)¹⁰로 분류됩니다.
구획 Q3은 뺄셈을 거친 비특이적 형광으로 정의됩니다.
구획 Q4의 정자는 단편화된 DNA를 가지며, 형광 현미경으로 보면 붉은색을 띠며, 이는 심한 DNA 단편화(DFIs)를 나타냅니다.

구획 Q2와 Q4에 있는 정자는 모두 단편화된 DNA를 포함하고, 이들의 합계는 DFIc로 정의됩니다.

흐름 세포계에 대한 PGG 설정
흐름 세포계 분석을 위한 다각형 게이트는 Evenson 등⁸이 설명한 방법에 따라 설정되었습니다. 그림 3과 같이, 각 게이트와 관련된 세포 특성은 다음과 같습니다:
P3은 변성된 DNA를 가진 세포의 비율을 나타냅니다.
P4는 높은 DNA 염색성(HDS)을 가진 정자를 나타냅니다. 이 정자 그룹은 정상적인 히스톤-프로타민 교환이 부족합니다.
P3 및 P4 게이트 외부에 위치한 주요 세포 집단은 정상 정자를 포함하며, 붉은색 형광이 감소하고 주로 녹색 형광을 발산합니다.

정자 시료 수집 및 분석
모든 121개의 정자 시료는 난징 의학 대학 소속 화이안 제1 병원 생식 센터를 방문한 남성으로부터 채취되었습니다. 정자 시료는 2-7일의 금욕 기간 후 자위를 통해 수집되었습니다. 정자 시료의 일상적인 분석은 WHO 인간 정자 검사 및 처리 연구소 매뉴얼^11,12의 요구 사항에 따라 엄격하게 수행되었습니다. 정자 농도 및 운동성 분석은 컴퓨터 보조 정자 분석 시스템(CASA)을 사용하여 수행되었습니다. 각 시료는 두 번 분석되었습니다. 결과는 두 결과의 차이가 95% 신뢰 구간 내에 있는 경우에만 평균으로 보고되었습니다. 그렇지 않은 경우 재채취 및 분석을 실시하였습니다.

Results

121명의 연구 참가자(평균 연령: 32.5 ± 4.9세; 범위: 26~44세) 중 28명이 무운동성 정자증으로 진단되었고 4명은 소정자증으로 진단되었습니다. 기본 인구통계학적 특성 및 정액 분석 매개변수는 표 1에 요약되어 있습니다.

그림 4에 보여진 바와 같이, Bland-Altman 그림은 PGG 및 CFG 방법으로 얻은 정자 DFI 결과가 우수한 일치성을 나타내는 것으로 나타났습니다(r = 0.9667, p = 0.0000). 단 2개의 샘플만이 +10% 미만의 차이를 보였고, 3개의 샘플은 -10% 이하의 차이를 보였으며, 각각 1.7%와 2.5%의 비율을 나타냈습니다.

표 2는 PGG의 DFIp와 CFG에서 유래한 각각의 세 가지 파라미터인 DFIm, DFIs, 그리고 DFIc 사이에 강한 양의 상관관계가 있음을 보여줍니다. 상관 계수는 각각 0.6497, 0.9404, 그리고 0.9667이었고, p-값은 모두 0.05 미만이었습니다. PGG 방법으로 검출된 HDS 결과는 CFG 방법으로 검출된 DFIs 및 DFIc와 유의한 음의 상관관계가 있었습니다. 상관 계수는 각각 -0.3042 및 -0.2120이었고, p-값은 모두 0.05 미만이었습니다. 조사 결과 HDS와 DFIm 사이에는 상관관계가 없음이 밝혀졌습니다(p-값이 0.05 이상).

표 3에 나타난 바와 같이, 진행성 운동 정자의 비율은 DFIp, DFIm, DFIs, 그리고 DFIc와 유의하게 음의 상관관계가 있었으며(모든 p-값이 0.05 미만), HDS와는 상관관계가 없었습니다(p-값이 0.05 초과). 정액 부피는 DFIp, DFIs, 그리고 DFIc와 유의한 양의 상관관계가 있었으며(모든 p-값이 0.05 미만), HDS와는 상관관계가 없었습니다(p-값이 0.05 초과). 정자 농도 및 총 정자 수는 PGG 및 CFG의 분석 결과와 상관관계가 없는 것으로 나타났습니다(p-값이 0.05 초과).

CFG 방법은 DFI 평가에 있어 PGG와 우수한 일치성을 나타냅니다. CFG는 DNA 손상의 정도를 구분할 수 있으며, 그 DFI 파라미터는 정자 운동성과 유의한 상관관계가 있습니다. 심각한 정자 DNA 손상의 지표로 알려진 DFIs는 임상 일상 실습에 더 적합합니다.

데이터 가용성:
본 연구 과정에서 생성 및/또는 분석된 데이터셋은 환자 수준의 임상 데이터를 포함하고 있으며, 기관의 개인 정보 보호 및 윤리적 고려사항으로 인해 공개되지 않습니다. 합리적인 요청을 제출하고 난징 의대 제1부속 화이안 병원 윤리위원회의 승인을 얻은 후, 대응 저자는 식별 정보가 제거된 데이터 및 분석 결과를 제공할 권한을 갖습니다. 이 연구는 맞춤 코드의 개발을 포함하지 않았습니다.

그림 1: 워크플로우의 전반적인 개요 다이어그램. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 보십시오.

그림 2: DFI 검출을 위한 유세포법의 십자형 게이팅(CFG). Q1 - 정상 정자. Q2 - 경미한 DNA 파편화(DFIm). Q3 - 제거된 비특이적 형광. Q4 - 심각한 DNA 파편화(DFIs). DNA 손상이 있는 정자는 Q2와 Q4 모두에 속합니다. 이들의 합계가 총 DNA 파편화 정자 집단(DFIc)을 나타냅니다. 여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 보십시오.

Discussion

WHO 실험실 인간 정액 검사 및 처리 매뉴얼¹²의 6판에서는 정자 DNA 무결성을 평가하기 위해 네 가지 방법을 권장합니다: 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(dUTP) 닉 엔드 라벨링(TUNEL), 단일 세포 겔 전기영동(Comet) 분석, SCSA 및 정자 염색질 분산(SCD) 검사입니다. 이 중 SCSA는 분석에 흐름 세포검사법을 사용하기 때문에 높은 처리량, 효율성 및 객관성을 제공하며, DFI 및 HDS⁷와 같은 매개변수를 동시에 보고할 수 있는 능력으로 인해 안과학 실험실에서 널리 채택되었습니다. 글로벌 설문조사⁷에 따르면 전 세계 생식 임상의의 거의 4분의 1(24.1%)이 정자 DNA 무결성을 평가하기 위해 SCSA를 선택했습니다.

SCSA 절차에서 가장 중요한 단계는 적절한 흐름 세포검사 게이팅을 수립하는 것입니다. 기존의 PGG 방법은 DNA 가닥의 파손된 조각(DFI)과 비정상적으로 높은 DNA 염색(HDS) 정자를 감지할 수 있으며, 이는 정상적인 히스톤과 프로타민 교환의 부족으로 특징지어집니다¹³. 그러나 정자 DNA의 단일 가닥 및 이중 가닥 파손을 구별할 수는 없습니다. 최근에 Yang 등¹⁰은 흐름 세포검사법을 사용하여 정자의 DFI를 분석하기 위한 CFG 방법을 확립했으며, 이는 정자 DNA 손상의 심각도를 구별할 수 있습니다. 이 방법의 핵심 단계는 흐름 세포검사기에 십자형 게이트를 설정하는 것입니다. CFG 방법은 우수한 반복성(변이 계수는 5% 미만)과 DFI 검출의 선형 범위(8.93%에서 53.90%)를 나타냅니다. 이 방법은 세 가지 지표—DFIm, DFIs, DFIc—를 보고하지만 HDS 결과는 제공하지 않습니다¹⁰.

이 연구는 CFG 방법의 총 DFI(DFIc)가 PGG 방법의 DFI(DFIp)와 잘 일치함을 발견했습니다. 상관 분석 결과, DFIs와 DFIp의 상관 계수가 DFIm보다 유의하게 높았습니다. 정자 농도 또는 총 정자 수는 CFG 또는 PGG 방법의 결과와 상관관계가 없었습니다. PR(%)와 네 가지 DFI 유형(DFIm, DFIs, DFIc, DFIp)은 모두 유의하게 음의 상관관계가 있었습니다. PR(%)는 네 가지 DFI 유형(DFIm, DFIs, DFIc, DFIp)과 모두 유의하게 음의 상관관계가 있었습니다. DFIm(r = -0.1975)과의 상관관계는 DFIs, DFIc, DFIp(r = -0.3794, -0.3574, -0.3824, 각각)보다 유의하게 약했습니다. 이러한 결과는 Yang 등¹⁰이 보고한 결과와 일치합니다. 더욱이, DFIs와 DFIc는 정액 부피와 양호한 상관관계를 나타냈지만, DFIm은 그렇지 않았습니다. 기본 정액 매개변수와 밀접한 상관관계를 갖는 지표의 임상적 유용성이 제한될 수 있지만, 이 결과는 심각한 정자 DNA 손상 지수(DFIs)가 정자 생성의 별개의 병리학적 측면을 반영할 수 있음을 시사합니다. 더 중요한 것은, 우리의 상관 분석에서 볼 수 있듯이, DFIs는 진행성 운동 정자의 비율과 DFIm에 비해 유의하게 강한 상관관계를 나타내며, 이는 기존의 정액 분석을 넘어 남성 생식 건강 평가에서의 보완적 지표로서의 잠재력을 더욱 지지합니다.

HDS는 정상적인 히스톤 및 프로타민 교환이 부족한 미성숙 정자의 비율을 나타냅니다. HDS 정자의 프로타민 1 전구체는 일반적으로 분리되는 말단 아미노산을 유지하며⁸, 이는 적절한 염색질 응축을 방해하고 dsDNA의 아크리딘 오렌지 염색을 증가시킬 수 있습니다. 이전 연구는 정자의 염색질 결함을 기술하는 데 있어 HDS의 중요성을 강조했습니다. Lin 등¹⁴와 Virro 등¹⁵의 연구에 따르면, HDS가 15% 이상인 남성

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
컴퓨터 지원 정자 분석 시스템	베이징 수이지아 소프트웨어 유한 회사	SA-II
유세포 분석기	심천 민드레이 바이오-메디컬 일렉트로닉스 유한 회사	Cyto E6
유세포 분석 키트	심천 브레드 생명 공학 유한 회사
막레르 카운팅 챔버	세피 메디컬 인스트루먼트
정자 핵 DNA 무결성 키트	심천 브레드 생명 공학 유한 회사	-