주사기 펌프 시스템을 이용한 체 외 생쥐 눈의 유출 시설 및 안구 순응도 측정

요약

기존의 압력 제어 관류 방법에서 분석 접근법을 통합하여 마우스 눈의 유출 시설과 안구 순응도를 평가하는 간단하고 저비용의 주사기 펌프 시스템을 최적화했습니다.

초록

안구 내 압력(IOP)을 적절하고 안정적인 수준으로 유지하는 것은 안구 건강에 필수적입니다. 소모망(TM), 슐렘관(SC), 그리고 전체 각막막 껍질의 생체역학적 특성은 IOP 항상성에 중요한 역할을 합니다. 유출 시설(C)은 TM과 SC의 방수액 배출 효과를 평가하는 핵심 매개변수이며, 안구 순응도(φ)는 각막 공막 껍질의 탄력성과 TM 및 SC를 통한 일시적 유출을 반영합니다. 이전에는 C를 평가하기 위해 간단하고 비용 효율적인 주사기-펌프 시스템이 개발되었습니다. 그러나 생 체 내 데이터 분석에 단순 선형 회귀를 사용하는 것은 TM과 SC 기능을 특성화하는 데 한계가 있습니다. 본 연구에서는 주사기 펌프 시스템이 확립된 압력 제어 안구 관류 시스템에 개발된 분석 접근법을 적용하여 최적화하였습니다. 체 외 눈에서 측정된 C와 φ 값은 이전에 발표된 관류 시스템 값과 비교되었으며, 보고된 범위와 일치하였습니다. 요약하자면, 이 간단하고 저비용의 주사기 펌프 시스템은 TM과 SC의 생체역학적 특성 평가를 용이하게 합니다.

서론

적절하고 안정적인 안압(IOP) 수준을 유지하는 것은 안구 건강에 필수적입니다¹. 녹내장의 주요 위험 요인은 안압 지속적 상승입니다. 수개월 또는 수년에 걸친 장기 IOP 변동도 시력 손실에 영향을 미칩니다 ^4,5. 최근 연구들은 일상 활동에 의해 발생하는 일시적인 IOP 변동 형태를 확인했으며, 이는 녹내장 진행을 가속화할 수 있습니다 ^6,7. 예를 들어, 20년간 눈꺼풀을 비비는 이력을 가진 46세 남성과 10년간 눈을 비볐던 52세 남성 모두 가속된 시신경 유두 손상 ^8,9를 보였다. 이러한 발견은 시력 손실 위험을 최소화하기 위해 안압 변화에 대해 시기적절하고 적절한 대응의 중요성을 강조합니다.

IOP는 방수(AH) 생성과 배수 간의 균형에 의해 조절됩니다¹⁰. AH는 주로 관습 및 양막 경관을 통해 눈을 통해 나옵니다^. 정상 및 녹내장 눈 모두에서, 신랑 망(TM)과 슐렘관(SC)으로 구성된 기존 경로가 IOP 항^상성에 영향을 미치는 유출 저항의 주요 원인^입니다. 따라서 TM과 SC의 생체역학적 특성은 눈이 IOP^{15, 16, 17} 변화에 적응하는 데 필수적입니다.

최근 기술 발전으로 AH 유출량을 보다 정확하게 평가할 수 있게 되었습니다. 중력 기반 관류와 주사기 펌프 시스템과 같은 침습적 접근법이 개발되어 유출 시설(C)을 계산하는데, 이는 TM과 SC가 정상 상태 유출^{18,19,20,21,22,23,24}를 어떻게 조절하는지를 나타냅니다. 녹내장 환자에서 C를 판정하기 위해 임상적으로 토노그래피²⁵와 형광광도계²⁶과 같은 비침습적 방법이 사용되어 왔습니다. 하지만 대부분의 접근법은 TM과 SC 기능을 구체적으로 평가할 수 없습니다. 예를 들어, 주사기-펌프 시스템에서는 정상 상태 유량과 압력 데이터를 단순 선형 회귀를 사용하여 적합하며, 기울기는 압력 의존 C로 해석됩니다. 그러나 살아있는 쥐에서 계산된 이 C는 AH 분비, 양도막 유출, 그리고 골드만 방정식에 의해 설명된 경련식에 의해 영향을 받기 때문에 기존 경로를 통한 AH 유출 능력을 정확히 반영할 수 없습니다.

이 한계를 해결하기 위해 Millar 등은 안락사 후 AH 유입 부재, 막상정맥압 없음, 양막공막 유출량 변함 없음을 가정하여, 동일한 마우스 눈에서 AH 유입, 기존 유출, 양막공막 유출을 여러 일정 유량 측정으로 계산했다²². 2016년 Sherwood 등은 체 외 눈에서 0 mmHg에서 양막 유출이 0임을 보고했으며, iPerfusion(이하 관류 시스템이라 부름)을 이용한 멱법칙 모델을 도입하여 같은 질문에 답^{했습니다.} 방법론적 발전은 TM과 SC의 뚜렷한 역할을 명확히 하여, 정상 상태 AH 유출을 유지하는 생리적 기능에 대한 이해를 높였습니다.

또한, TM과 SC가 IOP 변동에 일시적으로 반응하는 것은 IOP 항상성 유지에 필수적입니다. 이 움직임을 추적하기 위해 신 등은 위상 감응 광학 코히어런스 단층촬영(OCT)을 개발하여 초²⁸초 단위의 시간 척도에서 관측할 수 있게 했습니다. 3차원 직렬 블록면 주사 전자현미경은 이 운동을 초구조 수준에서 관찰할 수 있다²⁹. 그러나 이미지 기반 방법은 TM과 SC의 생체역학적 특성만 추정할 뿐, 과도 AH 배수의 실제 값을 산출하지 않습니다. 2019년, iPerfusion을 개발한 후 Sherwood 등은 각막 공막 탄력성과 TM 및 SC³⁰의 과도 반응을 모두 측정하는 주요 지표로 안구 순응성(φ)을 계산했습니다. 이 발전은 IOP 변동에 반응하는 TM과 SC의 과도적 행동을 평가하는 정량적 매개변수를 제공합니다.

TM 및 SC 기능 평가의 이러한 진보를 바탕으로, 본 연구는 C 계산을 위한 멱법칙 모델을 통합하고 새로운 방법론을 통합하여 주사기 펌프 시스템을 개선하였φ. 이 측정값들은 관류 시스템을 이용해 얻은 발표 데이터와 비교하여, 최적화된 주사기-펌프 시스템이 체 외 마우스 눈에서 유출 시설 및 안구 순응성 평가에 적합한지 평가하였습니다.

프로토콜

모든 실험은 안과 및 시각 연구에서 동물 사용 ARVO 성명서와 칭다오 대학교 의료센터의 실험동물 관리 및 사용 지침(QDU-AEC-2022069)에 따라 수행되었습니다.

1. 동물 선택 및 취급

1. 5개월 된 쥐를 사용하는데, 50% C57BL/6과 50% BALB/c 유전적 배경을 가지고 있습니다. 실험 설계에서 성(sex)을 고려하지 마세요.
2. 쥐는 23± 2°C, 습도 50± 5%에서 12시간 동안 12시간 동안 밝고 어두운 주기를 유지하세요.

2. IOP 측정

1. 2.5% 이소플루란과 80%(부/부피) 산소를 밀폐된 챔버에서 3.5분간 쥐에게 마취합니다.
   주의: 이소플루란은 휘발성 마취제입니다. 마취는 환기가 잘 되는 곳이나 적절한 격리 시스템에서 시행하세요.
2. 마우스를 운영 플랫폼으로 옮기세요. 마스크를 착용하고 마취를 30초 더 유지하세요.
3. 모든 측정은 9시부터 12시 사이에 수행하세요. 한 눈당 세 번의 측정값을 기록하세요. 각 데이터 포인트의 평균 값을 계산하세요.

3. 시스템 구성 (그림 1)

1. 100 μL 주사기를 주사기 펌프에 연결하세요.
2. 주사기를 플로우스루 압력 센서에 연결하세요.
3. 센서를 데이터 수집 시스템에 연결하세요.
   참고: 압력 센서와 아이 홀더가 같은 높이로 정렬되어 압력 인위물을 방지하도록 하세요.
4. 시스템에 인산염 완충 생리식염수(PBS)를 1× 채웁니다. 모든 기포를 제거하세요.
5. 눈을 원형 홈(직경 4–6mm)이 있는 홀더에 넣습니다. 캐닐레이션 시 눈이 안정적인지 확인하세요. 압력 센서와 아이 홀더를 같은 높이로 배치하세요.
   참고: 정렬 불량은 압력 측정 오차를 유발할 수 있습니다. 맞춤형 아이홀더의 STL 설계 파일은 보충 파일 1로 제공됩니다.

4. 소프트웨어 운영

1. 압력 센서 보정
   1. 데이터 수집 소프트웨어를 열어보세요. 보정 설정 파일을 불러와. 보정 기능을 선택하세요.
   2. 시스템을 두 개의 지정된 높이에서 물 저장소에 연결합니다.
   3. 변환을 사용한 입력 및 실제 압력:
      1 cm 높이₂O = 0.735 mmHg
2. 펌프 설치
   1. 모듈 설정을 열어보세요. 조절기 설정 파일을 불러와.
   2. 펌프 장치를 선택하세요. 최대 유량 과 주사기 직경을 입력하세요.
3. 데이터 기록
   1. 녹화 시작해.
   2. 압력 단계마다 녹음을 멈추세요.
   3. 다음 압력 값을 입력하세요.
   4. 녹화를 다시 시작하세요.

5. 바늘 준비

1. 정해^{진 프로토콜에} 따라 유리 마이크로피펫을 뽑으세요.
2. 팁을 내경 80–100 μm로 갈아줍니다. 바늘 끝을 닦아.
   주의: 유리바늘은 부상을 방지하기 위해 조심해서 다루세요.
3. 바늘을 마이크로매니퓰레이터에 장착하세요. 바늘을 압력 변환기에 연결하세요.
4. PBS로 주사기를 채워라.
5. 바늘 끝을 압력 센서와 같은 높이로 위치시키세요.
6. 저항 측정
   1. 1 mmHg의 압력을 가하세요. 유량을 기록하세요.
   2. 바늘 저항 계산:
      
   3. 저항이 0.01에서 0.5 mmHg/(μL/min) 사이의 바늘을 사용하세요.

6. 시스템 시설 및 준수

1. 시설 측정
   1. 시스템에 PBS를 공급하세요. 3방향 밸브로 시스템을 밀봉하세요.
   2. 6, 8, 10, 12, 14, 16 mmHg의 압력 단계를 적용합니다.
   3. 각 단계마다 P와 Q를 10분씩 기록하세요. 최근 5분간의 평균 값을 계산하세요.
   4. 선형 회귀를 수행하세요. 경사면을 시스템 시설로 해석하세요.
2. 검증
   1. 측정을 3번 반복하세요.
   2. 시스템 시설이 0.2 nL/min/mmHg 미만인지 확인하세요.
3. 준수 측정
   1. 35cm 실리콘 튜브를 시스템에 삽입하세요.
   2. 테플론 튜빙 유무 여부 모두 측정하세요.
   3. 이산 부피 방법을 사용하여 부피 변화를 계산합니다¹⁴.
   4. 시스템 적합성을 4 nL/mmHg로 측정합니다.
4. 민감도 검사
   1. 검출 가능한 시스템 순응도가 9.9 nL/mmHg 이상인지 확인하세요.

7. 핵 제거

1. CO2를 0.7L/분의 유량으로 3분 동안 안락사시키세요.
   주의:_CO2 안락사는 인도적인 종말을 보장하기 위해 기관 지침을 따라야 합니다.
2. 멸균 기구를 사용해 외안근과 시신경을 해리합니다. 눈알을 핵제거하세요.
3. 즉시 한쪽 눈을 35.5 °C에서 홀더에 장착하세요.
4. 반대쪽 눈은 4°C에 보관하세요.
5. 같은 방법으로 양쪽 눈을 측정하세요.

8. 캐닐레이션

1. 바늘 삽입
   1. 바늘을 중앙 각막을 45° 각도로 통과시켜 넣으세요.
   2. 바늘을 0.3–0.5 mm 깊이로 전방 방으로 밀어 넣습니다.
2. 검증
   1. 시스템을 안정시키세요. 마지막 5분 동안 압력 변동≤ 0.4 mmHg 확인해.

9. 안구 C_r

1. 눈을 8 mmHg에서 30분간 안정화하세요.
2. 6, 8, 10, 12, 14, 16 mmHg의 압력 단계를 적용합니다.
3. 마지막 단계는 8 mmHg에서 적용합니다.
4. 자료 수집
   1. 최대 유량을 4 μL/min으로 설정하세요.
   2. 각 단계마다 P와 Q를 10분씩 기록하세요.
5. 분석
   1. P–T 및 Q–T 곡선을 그립니다. 최근 5분 동안의 평균값을 계산하세요.
   2. 멱법칙 모델에 데이터를 적합시키기²⁷:
      
6. C_r (시스템 시설을 뺀 후)를 안구 배출 시설로 정의합니다.
7. P _r = 8 mmHg 집합.
8. β를 비선형 계수로 정의하자.

10. 안구 Φ_r

1. 압력 증가 시 P–T 및 Q–T 곡선을 분석합니다. Q _max로 유량이 증가하고 이후 감속되는 현상을 식별합니다.
2. 이산 부피 방법을 사용하여 t_p 와 t_max 간의 부피 변화를 계산합니다.³⁰.
3. 수정된 프리덴발트 방정식³⁰에 대한 적합 데이터:
   
4. P _r = 13 mmHg 설정. Φ_r(시스템 순응도를 뺀 후)을 눈 순응성 Φ, _눈으로 정의하고, γ를 재료 매개변수로 정의합니다.

결과

최적화된 주사기-펌프 시스템의 성능은 5개월 생후 쥐의 C와 φ를 압력 제어 안구 관류 연구에서 발표한 값과 비교하여 평가하였다. 그림 2F 에 나타난 데이터셋의 정규성은 Shapiro–Wilk 검정을 사용해 평가했으며, 통계적 비교는 양측 쌍 Student's t-검정을 사용했습니다.

그림 2A–C에 나타난 것처럼, 안압(IOP), 눈_C, 눈 Φ, 눈은 각각 14.0 mmHg(95% 신뢰구간: 13.2–14.8 mmHg), 5.2 nL/min/mmHg(95% 신뢰구간: 4.1–6.4 nL/min/mmHg), 46.0 nL/mmHg(95% 신뢰구간: 40.6–51.3 nL/mmHg)였습니다. 주사기 펌프 시스템은 ...

토론

본 연구는 마우스 눈의 유출 시설과 안구 순응도를 추정하기 위한 최적화된 주사기-펌프 시스템을 제시하며, 압력 제어 안구 관류 시스템을 사용한 값과 일치하는 값을 산출합니다. 본 접근법은 주사기 기반 측정의 정확도를 향상시키면서도 간단하고 접근성 높은 실험 환경을 유지합니다. 이러한 방법론적 정교함과 접근성의 결합은 더 발전된 시스템이 쉽게 제공되지 않는 실험실에서 더 널리 채택될 수 있습니다.

이 시스템의 주요 장점은 데이터 정확도 향상으로, AH 유출과 안구 생체역학에 관여하는 주요 유전자와 분자 경로를 식별할 수 있게 합니다. 이러한 개선은 녹내장에 대한 약리학적 개입과 유전적 조작을 촉진할 수 있으며, 미묘한 연령 관련 변화, 조기 질병 진행, 치료 반응 모니터링을 단기간에 지원합니다. 예를 들어, C의 정확한 평가는 TM 역학 조절과 AH^유출에 영향을 미치는 TRPV4...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
시약	1× PBS 버퍼	써모피셔 사이언티브	10010023
이소플루란	선전 리우드 생명과학 유한회사, 중국	R640
재료	100 & mu; L 고정밀 주사기	해밀턴	1710
붕실리케이트 유리	서터, 노바토, 캘리포니아	BF100-50-10
일회용 멸균 주사기	펑린 의료기기 유한회사, 중국 장시성	10ml
압력 센서	ICCU메디컬	PX26-015G
실리콘 튜브	런제 플루이드 유한회사, 중국 난징	해당 없음
투명 PTFE 튜브	런제 플루이드 유한회사, 중국 난징	해당 없음
장비	플래밍/브라운 피펫 풀러	서터, 노바토, 캘리포니아	P-97
수동 마이크로매니퓰레이터	월드 프리시전 인스트루먼트(WPI)	M3301
금속 욕조	비버 생물학, 쑤저우, 중국	2016C
마이크로포지	일본 도쿄 나리시게 과학기기 연구소	MF830
마이크로피펫 그라인더	MPInstrument Co., 유한, 중국	KDG-02
PZMIII 입체 줌 쌍안경 현미경	월드 프리시전 인스트루먼트(WPI)	PZMIII
주사기 펌프	월드 프리시전 인스트루먼트(WPI)	AL-1000