뎅기열 바이러스 2형 감염 포유류 세포에서 엑소좀 강화된 세포외 소포의 분리 및 특성 분석

요약

여기서는 뎅기열 바이러스 2형 감염 세포 배양 상액에서 엑소좀 풍부 세포 소포를 분리한 후, 소포의 완전성과 크기 분포를 특성화하고, 정의된 실험 조건에서 플라크 분석으로 검출 가능한 감염성 바이러스가 없는지 평가합니다.

초록

엑소좀 강화 EV는 다양한 세포 유형에서 혈장, 소변, 타액, 세포 배양 배지 및 기타 체액과 같은 세포외 체액으로 방출되는 소포입니다. 직경은 30 nm에서 150 nm 사이입니다. 이들은 감염 중 세포 통신과 면역 조절 등 다양한 세포 과정에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 효과를 바탕으로 여러 바이러스의 발병 기전 연구에 사용되었습니다. 현재 정제 기법을 사용해 바이러스에 감염된 세포 상액에서 엑소좀 농축된 EV를 분리하는 것은 어렵습니다. 이는 주로 특정 바이러스와 엑소좀 강화 EV 간의 크기 중복 때문입니다. 여기서는 뎅기열2형 감염 세포 배양 상청액에서 엑소좀 강화 EV를 정제하는 것을 목표로 합니다. 엑소좀 농축 EV는 상업용 엑소좀 분리 키트를 사용해 분리되었습니다. 이 프로토콜에서 분리된 엑소좀 강화 EV에서는 실험 조건 하에서 플라크 분석으로 감염성 바이러스가 검출되지 않았습니다. 정제된 엑소좀 농축 EV는 테트라스패닌을 위한 서부 블롯팅, 나노입자 추적 분석, 크기 확인을 위한 투과 전자현미경을 통해 특성화되었습니다. 우리는 엑소좀 강화된 EV가 정상 직경인 30-150 nm 범위 내에 있음을 입증했습니다. 전반적으로 우리 프로토콜은 바이러스에 감염된 세포 배양 상청액에서 엑소좀 강화된 EV를 정제하는 저렴한 방법을 제공하며, 이는 후속 기능 분석에 활용할 수 있습니다.

서론

엑소좀 강화 EV는 신체의 모든 세포에서 방출되는 나노 크기의 소포입니다. 이들은 엔도사이틱 기원의 세포외 소포(EV)의 아형입니다. 엑소좀 강화 EV는 망상혈구^{배양 배}지 1에서 처음 발견되었습니다. 지난 수십 년간 엑소좀 농축 EV는 혈액, 소변, 타액, 모유, 정액, 양수 등 여러 체액에서 정제되었습니다(2,3,4,5). 직경은 30nm에서 150nm 사이^입니다. 이들의 세포외 구획 방출은 다소포체(MVB)와 세포 원형질막의 융합을 통해 이루어집니다. 감염과 면역 반응의 맥락에서, 외국체 강화 EV는 포유류 세포에서 특이적 반응을 유발하는 것으로 알려져 있습니다. 이러한 반응에는 사이토카인 방출이나 감염에 대한 감수성 변화가 포함됩니다 ^7,8,9.

엑소좀 강화 EV의 함량은 여러 요인에 의해 영향을 받는데, 가장 중요한 것은 이를 생성하는 세포의 유형과 상태입니다^10,11. 또한, 그 성분은 순진한 수용 세포에 미치는 영향도 결정합니다. 현재 생물학적 액체에서 엑소좀 농축된 EV를 분리하기 위해 여러 방법이 사용되고 있습니다. 일반적인 방법으로는 차동 초원심분리, 침전, 면역친화성 포획, 크기 배제 크로마토그래피, 자기 기반 격리, 마이크로유체 기반 분리가 있습니다.

차동 초원심분리는 가장 많이 사용되는 기법 중 하나로 간주됩니다 12,13,14. 초원심분리기 정제 방법은 비용이 많이 들고 상당한 기술적 숙련도를 요구합니다. 이 방법은 여러 초원심분리 단계로 인해 EV의 상당한 손실을 초래합니다. 마지막으로, 결과적으로 생성된 엑소좀 농축 EV는 유사한 표현형 특성 때문에 활성 바이러스 입자가 없는 것은 아닙니다. 이로 인해 바이러스에 감염된 세포 상액에서 엑소좀 농축된 EV를 정제하는 것이 도전적이었습니다. 따라서 바이러스가 엑소좀과 유사한 크기와 밀도를 공유하기 때문에, 엑소좀 강화된 EV 용액에서 뎅기열바이러스(DENV) 수준을 효과적으로 검출 불가능한 수준으로 낮추기 위한 최적화된 프로토콜 개발이 ^{중요합니다.}

다른 일반적으로 사용되는 기술과 비교할 때, 이 프로토콜은 정제 시간 단축, 저렴하고 널리 접근 가능한 실험실 장비 의존, 그리고 검출 가능한 생바이러스 오염 없이 엑소좀 농축된 EV를 분리할 수 있는 능력 등 여러 장점을 제공합니다. 또한, 밀도 구배 원심분리나 자기 기반 격리와 같은 방법은 수율 증가와 높은 순도 같은 장점을 제공할 수 있지만, 이러한 접근법은 초원심분리 초심분리 단계가 필요합니다. 이 글의 목적은 검사된 조건에서 감염된 상청액에서 감염된 상청액에서 감염성 바이러스가 검출되지 않는 플라크 분석을 통해 분리하는 방법을 제시하는 것입니다.

프로토콜

1. 엑소좀 프리 배지의 준비

1. 클래스 II 생체 안전 캐비닛(BSC) 내부의 수신기 베이스에 0.1 μm 필터를 부착합니다.
2. 무균으로 열로 비활성화된 태아 소 혈청(FBS)을 필터에 부어 BSC 내부의 진공 펌프에 연결하세요.
3. 플로우스루를 사용해 1.2 단계를 두 번 더 반복하세요.
4. 트리플 필터 FBS 10%, 페니실린/스트렙토마이신 1%, L-글루타민 1%를 포함한 완전한 배지를 준비합니다.
   참고: 삼중 여과 방식은 초원심분리기와 같은 기기의 필요성을 피하기 위해 사용됩니다.

2. 뎅기열 바이러스 포유류 세포 감염

1. 조직 배양 인큐베이터 내 T75 cm² 배양 플라스크에서 5%_CO2로 37°C에서 베로 세포를 하룻밤 배양합니다.
2. 다음 날에는 세포가 70%에서 80% 사이의 융합률을 확인하고, 5mL의 완전 배지에 0.1 감염 중복률(MOI)의 DENV-2를 투여하여 37°C에서 5%_CO2 와 함께 2시간 배양합니다.
3. 2시간 후에는 상청액을 제거하고 플라스크를 멸균 인산염염수(PBS)로 3번 세척합니다.
4. 플라스크에 50mL의 완전 배지를 추가하고 37°C에서 5%_CO2 와 함께 4일간 배양합니다(세포병리적 효과가 관찰되기 직전).

3. 키트 기반 엑소좀 정제

1. 플라스크에서 세포 배양 배지를 50mL 원뿔 튜브로 옮기고, 200 × g 에서 실온에서 15분간 원심분리기를 사용합니다.
2. 배지를 새 원뿔 튜브로 옮기세요. EV 침전 시약 125 μL를 추가한 뒤, 수지 600 μL을 추가합니다. 10초 동안 소용돌이를 돌리고, BSC 내부에서 실온에서 10분간 두세요.
3. 10초 더 소용돌이치고, 약 450× g 에서 실온에서 2분간 원심분리기를 가집니다. BSC로 옮기고, 상원액을 버린 후 600 μL 부유 완충제를 페릿에 적용합니다.
4. 10초 동안 소용돌이를 돌리고 실온에서 15분간 배양합니다.
5. 10초 더 소용돌이를 사용하고, 약 25× g 에서 실온에서 2분간 원심분리합니다.
6. 상청액을 필터 스핀 컬럼으로 옮기고 약 4,500 × g 에서 실온에서 1분간 원심분리기를 사용합니다. 온전한 엑소좀 농축 EV가 포함된 플로우스루를 수집하여 -80 °C에서 보관하여 사용 준비가 될 때까지 보관합니다.
7. 엑소좀 강화 EV가 살아있는 바이러스가 없음을 확인하려면 플라크 검사¹⁷을 수행하세요.
8. 엑소좀 농축된 EV를 크기는 전자현미경으로, 크기 분포와 농도는 나노입자 추적 분석을 통해 특성화합니다¹⁸.

4. 웨스턴 블롯에 의한 엑소좀 강화 EV의 특성

1. BCA와 같은 분석법을 사용하여 엑소좀 강화 EV의 단백질 농도를 측정합니다.
2. 외국체 농축 EV 용액과 RIPA 버퍼를 같은 양으로 섞고, 4:1의 LDS 로딩 버퍼를 4배로 추가합니다.
3. 4-12% Bis-Tris 젤을 사용해 엑소좀 강화된 EV 단백질을 분리합니다.
4. 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 옮깁니다.
5. 5% 무지방 우유를 1x TBS-Tween 버퍼에 녹여 실온에서 1시간 동안 블록합니다.
6. 1차 항체를 5% 무지방 건조 우유로 1:1,1,000 희석한 후, 4°C에서 CD63, CD9 같은 외국체 단백질을 밤새 탐색합니다.
7. 1차 항체를 제거하고 1개의 TBS-Tween 버퍼로 5분간 세척하세요.
8. 2차 항체(항 토끼 IgG HRP)를 무지방 건우유와 1:5,000 희석으로 희석한 후, 이 용액과 함께 멤브레인을 상온에서 1시간 배양합니다.
9. 2차 항체를 제거하고 5분간 1개의 TBS-Tween 버퍼를 로커에 올려 세척하세요.
10. ECL 검출 시약을 사용해 막을 현상하고, 화학발광 영상 장치를 사용해 단백질 신호를 검출합니다.

5. 투과 전자현미경을 이용한 엑소좀 농축 EV의 특성 규명

1. 200메쉬 구리 그리드에 5μL의 엑소좀 샘플을 추가하고 폼바와 탄소 코팅을 한 상태에서 자연 건조합니다.
2. 격자에 1% 수용성 우라닐 아세테이트로 60초 동안 염색한 후 자연 건조하세요.
3. 80 kV¹⁸에서 TEM을 사용해 이미지를 캡처하세요.

결과

프로토콜에 설명된 외국체 농축 EV를 플라크 분석법을 사용해 혼합물 내 활성 DENV-2 입자를 검출할 수 있는지 확인했습니다. 그림 1에 나타난 것처럼, 양성 대조군과 비교했을 때 검사된 조건에서는 플라크가 발견되지 않았습니다. 이 결과는 감염성 바이러스가 플라크 검사의 검출 임계값 이하임을 나타냅니다. 플라크 분석은 생물학적 3중과 기술적 복제본으로 이루어졌습니다. 분리된 엑소좀 풍부 EV의 단백질 농도는 BCA 분석법을 사용하여 측정되었습니다. 결과 단백질 농도는 989 μg/mL에서 1,300 μg/mL 사이임을 보여주었습니다(표 1). 또한, 엑소좀 강화 EV의 웨스턴 블롯 분석에서는 CD63과 CD9 테트라스판닌이 존재하는데, 이들은 일반적인 엑소좀 표지자입니다(그림 2

토론

최근 감염병 연구의 진전은 바이러스에 감염된 나이브 세포에서 방출된 엑소좀 강화 EV가 숙주 면역 반응 조절에 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었습니다 ^7,8,9. 엑소좀 강화된 EV는 적절한 항바이러스 반응을 촉진하여 면역 방어를 강화하거나, 반대로 숙주 방어 기전을 억제하여 바이러스 면역 회피를 촉진할 수 있습니다.

이러한 상반된 효과를 밝히기 위해서는 오염 바이러스 입자가 없는 온전한 엑소좀 강화 EV를 분리하는 것이 필수적입니다. 엑소좀 강화 EV 정제에는 현재 여러 방법이 사용되고 있습니다 12,13,14;

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항토끼 IgG-HRP 연관 항체	세포 신호 전달	7074S	2차 항체
CD63	세포 신호 전달	52090S	1차 항체
CD9	세포 신호 전달	13174S	1차 항체
세포 배양 배지 엑소좀 정제 키트	노르겐	60600	엑소좀 정제 키트
뎅기열 바이러스 2	ATCC	VR-1584	바이러스
DMEM	피셔 사이언티픽	11-995-073	문화 매체
EMEM	ATCC	30-2003	문화 매체
FEI 탈로스 F200X 투과전자 현미경	써모피셔 사이언티픽
태아 소 에이룸	신경역학	FBS002	미디어 보충
나노 입자 추적 분석기	입자 메트릭스
베로 셀	ATCC	CCL-81	포유류 세포주