방법 논문

노령 눈물 및 침샘에서 단세포 해리, RNA 시퀀싱 및 노령 분수선에서 근상피세포 및 섬유아세포 분리 프로토콜

DOI:

10.3791/70441

⸱

2026년 4월 24일

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1Department of Molecular and Cellular Biology, Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 프로토콜은 노화 마우스 눈물선을 해리하여 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 생존 가능한 단일 세포를 얻는 최적화된 방법을 설명합니다. 순차적 효소 소화와 부드러운 취급은 세포의 무결성을 유지하여, 세포 유형 특이적 분리 및 노화 관련 눈물샘 변화의 전사체 분석에 적합한 고품질 현탁액을 생성합니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

눈물샘(LG)의 노화는 눈물 분비 감소와 만성 염증과 연관되어 안구건조증에 기여합니다. 연령 관련 눈물샘 변화에는 면역세포 침윤, 세포 손상, 아시나세포 내 지질 축적, 세포외 기질 침착, 그리고 멘토 확장이 포함됩니다. 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)은 노화 중 세포 이질성과 전사 변화를 프로파일링하는 강력한 접근법을 제공합니다; 그러나 노화된 LG 조직에서 생존 가능한 단일 세포 현탁물을 생성하는 것은 섬유증 증가, 세포 취약성, 지질 축적 증가로 인해 기술적으로 어렵습니다. 본 연구는 노화 마우스 LG의 효율적인 해리 및 다중 세포 유형의 분리를 위한 최적화되고 재현 가능한 프로토콜을 제시하며, 이는 후속 scRNA-seq 분석에 적합합니다. 중요하게도, 이 프로토콜은 젊은 눈물선, 결막 및 기타 외분비 조직에도 적용 가능합니다. 작업 흐름은 초기 조직 소화를 위해 콜라게나제 IV, 디스퍼즈 II, DNase I를 사용한 단계적 효소 해리 전략을 사용하고, 이어서 Accutase로 남은 세포 클러스터를 해리하며, 최종 DNase I 처리를 통해 깨끗한 단일 세포 현탁을 얻습니다. 세포 손상을 최소화하기 위해 모든 플라스틱웨어는 소 혈청 알부민이 포함된 PBS로 미리 코팅되어 있으며, 조직 처리는 통제된 온도 및 교반 조건 하에서 수행됩니다. 적혈구 용해와 여러 체를 통한 순차적 여과는 세포 순도를 더욱 향상시킵니다. 세포 유형 특이적 분리는 리포터 마우스 라인과 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 결합하여 달성됩니다. Acta2GFP 와 PdgfraEGFP 마우스를 사용하여 EpCAM 항체로 면역염색을 한 후 각각 근상피세포와 섬유아세포를 성공적으로 분리하였습니다. FACS는 EpCAM⁺/αSMA⁺ 근상피 집단의 분리를 가능하게 했고, PdgfraEGFP마우스의 EGFP⁺ 세포는 섬유아세포 집단을 대표했습니다. 이 프로토콜은 노화된 LGs로부터 고품질의 생존 가능한 단일 세포 현탁물을 제공하며, 부드러운 해리와 표적 세포 분리가 필요한 다른 섬유화 또는 노화 외분비 조직에도 쉽게 적응할 수 있습니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

눈막(LG)은 눈물막의 수층을 분비하는 외분비 저수관(수막)입니다. 생애 동안 각막 표면과 LG는 박테리아 및 바이러스 감염에 노출되어 상피 세포의 전신 교란, 만성 염증 반응 유도, 면역 세포 침투, 재생 부족으로 이어질 수 있습니다. 노화는 만성 염증성 질환 발생률 증가와 함께 나타납니다1. 이 중 건조안증(DED)은 전 세계적으로 시각 장애의 10대 흔한 원인 중 하나이며, 노인 인구의 독립성, 이동성, 일상 기능 저하에 주요 원인입니다2. DED의 주요 원인 중 하나는 LG 기능 장애입니다3.

나이가 들면서 쥐와 인간의 LG는 구조적·기능적으로 뚜렷한 변화를 겪는데, 여기에는 아시나 세포 위축, 관도 확장, 면역 세포 침윤, 섬유화, 지질 침착 4,5,6,7 등이 포함됩니다. 이러한 퇴행성 변화는 또한 LG의 만성 염증과 조직 섬유화 3,5,8,9를 동반합니다. 노화와 LG 병리 사이의 명확한 연관성에도 불구하고, 이러한 변화를 유발하는 분자 및 세포 메커니즘은 아직 잘 이해되지 않았습니다.

단일 세포 RNA 시퀀싱은10세 노화 기간 동안 세포 집단과 전사 변화를 포괄적으로 프로파일링할 수 있게 합니다. 이 접근법은 눈물선 내 다양한 세포 유형과 상태를 편향 없이 식별할 수 있게 하며, 노화가 유전자 발현 프로필, 면역 세포 침투, 상피-중간엽 상호작용에 미치는 변화를 밝혀냅니다.

현재는 기계적 해리 방법11과 콜라게나제, 디스파이즈, 트립신12와 같은 효소를 이용한 37°C의 따뜻한 효소 소화 프로토콜 등 다양한 조직 해리 방법이 존재합니다. 간, 폐, 신장, 심장, 다중 종양 유형 등 다양한 조직에 대해 다양한 해리 전략이 기술되어 왔습니다13, 14, 15. 그러나 노화된 눈물 조직에서 생존 가능한 단일 세포 현탁물을 준비하는 것은 섬유화와 세포 취약성 증가로 인해 기술적으로 여전히 도전적입니다. 또한, 앞서 보고했듯이, 연약한 액시막 세포의 회복은 어려울 수 있는데, 해리로 인한 막 투과성 변화가 이러한 대형 분비 세포에서 발생하는 주변 RNA 방출을 증가시켜 하위 단일 세포 데이터셋의 배경 신호에 기여할 수 있기 때문입니다16. 여러 연구에서 노화 눈물샘의 scRNA-seq 아틀라스가 보고되었지만, 이 데이터셋의 질은 최적의 해리 방법이 부족해 상피세포의 생산성이 기질 집단보다 낮았습니다. 여기서는 노화 마우스 LG의 효율적인 해리와 하위 scRNA-seq 및 대량 RNA-seq 분석을 위한 구체적이고 최적화된 프로토콜을 제시합니다(그림 1). 이 접근법은 연령 관련 눈물샘 기능 장애의 분자 메커니즘을 연구하는 강력한 도구를 제공합니다.

이 프로토콜은 노화된 분수선에서 고품질의 생존 가능한 단일 세포 현탁물을 생성할 수 있게 하여, 포괄적인 전사체 분석을 위한 신뢰할 수 있는 기반을 제공합니다. 이 프로토콜은 노화 관련 변화를 겪는 근상피세포, 섬유아세포, 기타 상피 및 기질 세포 유형을 포함한 다양한 세포군의 상세한 식별과 분자 특성 분석을 가능하게 합니다. 최적화된 워크플로우는 세포의 무결성을 보존하고 스트레스로 인한 전사 인공물을 최소화하여 생체 내 세포 상태의 정확한 표현을 보장합니다. 더불어, 이 방법론은 폭넓게 적용 가능하며, 부드러운 조직 해리와 구별되는 세포 집단의 정밀한 분리가 하위 단일 세포 연구에 매우 중요한 다른 외분비선이나 섬유화 조직에도 적용할 수 있습니다.

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프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

모든 동물 실험은 스크립스 연구소의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)가 승인한 프로토콜(프로토콜 번호 08-0123; 2023년 8월 29일 승인)에 따라 수행되었습니다. 스크립스 연구소의 동물 관리는 국제 실험동물 관리 평가 및 인증 협회(AAALAC)로부터 인증을 받았습니다. 쥐는 표준 12시간 빛/12시간 암흑 주기 하에 음식과 물을 자유 롭게 제공하며 유지되었습니다. 실험에는 PdgfraEGFP 와 Acta2GFP 형질전환 마우스 계통이 사용되었습니다. 마우스 계통에 대한 자세한 정보는 "재료 표" 섹션에 제공되어 있습니다.

1. 일반적인 고려사항

  1. 생물학적 위험 물질과 동물 조직을 다룰 때는 NIH 범용 예방 조치17 을 준수하세요. 모든 동물 작업을 승인된 IACUC 프로토콜과 지정된 동물 생물안전 수준에 따라 수행하세요.
  2. 입 피펫 사용을 피하고, 날카로운 도구 사용을 최소화하며, 에어로졸 생성 절차를 위한 생물학적 안전 캐비닛 사용, 적절한 개인 보호 장비 착용, 날카로운 도구를 구멍 방지 용기에 폐기하고, 모든 생물학적 위험 폐기물을 폐기 전에 적절히 라벨 부착하고 오염 제거하는 등 표준 실험실 안전 지침을 준수하세요.
  3. 적절한 소독제(예: 표백제 10%)를 사용하여 작업면과 장비를 정기적으로 제염하세요.
  4. 모든 원심분리 단계는 4°C에서 미리 냉각된 냉장 원심분리기에서 수행하여 세포의 생존성을 유지하고 온도 유발 스트레스를 최소화합니다.
  5. 특정 기기 구성에 맞는 유세포계 및 세포 분류기 설정을 최적화하고, 적절한 대조 샘플을 사용하여 각 항체-형광체 결합체의 매개변수를 조정합니다. 동일한 세포계와 분류 기기를 고정되고 최적화된 설정으로 사용하여 실험 시리즈 내내 변동성을 최소화하세요.
  6. 선택된 용액은 최대 하루 전에 준비하여 적절히 보관하세요. 모든 용액은 생물안전 캐비닛에서 멸균 조건에서 준비하세요.
  7. 효소 단계 중 킬레이션을 방지하기 위해 Ca2+/Mg2+ 함유 용액은 EDTA 함유 완충액과 분리하여 보관하세요. 이 절차에 필요한 모든 시약은 재료표에 표시되어 있습니다.

2. 플라스틱 제품

  1. 멸균 상태에서는 접시, 튜브, 주사기로 1x PBS + 1% BSA를 1시간 동안 실온(RT)에서 미리 코팅하세요. 흡인하고 사용 전까지 모두 멸균 상태로 유지하세요.
  2. 피펫 팁을 미리 코팅하세요. 각 팁마다 PBS + 1% BSA를 세 번씩 흡입하여 내면을 코팅합니다. 코팅된 팁을 멸균 팁 박스에 다시 넣고 멸균 인큐베이터에서 하룻밤 건조시킵니다. 다음 날 세포 분리 과정에서 이 코팅된 팁을 사용하세요.

3. 해와 완충

  1. DNase I 스톡 (5 mg/mL)
    1. 5M NaCl 스톡에서 150 mM NaCl을 준비하고 멸균 필터를 거칩니다.
    2. 여과된 150 mM NaCl 용액에 1 M CaCl₂를 첨가하여 최종 농도는 5 mM CaCl₂를 얻습니다.
    3. 100 mg DNase I를 150 mM NaCl / 5 mM CaCl₂ 완충제 20ml에 재현탁하여 5 mg/mL DNase I 재고 용액을 얻습니다.
    4. 500 μL 알리쿼트를 준비하여 −20 °C에서 최대 6개월간 보관하세요. 효소 활성 손실을 방지하기 위해 반복적인 동결-해동 과정을 피하세요.
  2. 소화 배지
    1. 실험 전날에는 DMEM/F12와 0.5% BSA를 섞어 미디엄 베이스 믹스를 준비하고 필터링하세요.
    2. 기본 배지 DMEM/F12 / 0.5% BSA에 1M HEPES와 1M CaCl₂를 첨가하여 각각 최종 농도가 15 mM과 3 mM을 얻습니다.
    3. 사용 직전에 다음 모든 효소를 추가하세요: 콜라게나제 IV(1 mg/mL; 125 U/mL), 디스페이즈 II(2.5 mg/mL; 1.25 U/mL), DNase I(20 U/mL; 5 mg/mL 스톡에서 0.05 mg/mL).
  3. 블로킹 미디엄 1 (BM1)
    1. 1M HEPES와 0.5M EDTA를 1x HBSS에 추가하여 각각 최종 농도가 15 mM과 3 mM을 얻습니다.
  4. 블로킹 미디엄 2 (BM2)
    1. DMEM/F12에 FBS와 1M HEPES를 추가하여 각각 최종 농도가 10%와 15 mM을 얻습니다.
  5. DNase 처리용 배지
    1. 실험 전날에는 0.5% BSA가 섞인 HBSS 1개를 섞어 베이스 배지를 준비하고 여과하세요.
    2. 1M HEPES, 1M CaCl₂, 1M MgCl₂를 기본 배지 1x HBSS / 0.5% BSA에 첨가하여 각각 최종 농도인 10 mM, 1.5 mM, 2 mM을 얻습니다.
    3. 사용 직전에 DNase I(200 U/mL; 5 mg/mL 스톡에서 0.5 mg/mL)를 혼합물에 첨가하세요.
  6. 블로킹 미디엄 3 (BM3)
    1. 동일한 여과 베이스 배지 1x HBSS / 0.5% BSA를 사용하고, 1M HEPES와 0.5M EDTA를 추가하여 각각 최종 농도가 10 mM과 1 mM을 얻습니다.
  7. 블로킹 미디엄 4 (BM4)
    1. 동일한 여과 베이스 배지 1x HBSS / 0.5% BSA를 사용하고, 1M HEPES를 추가하여 최종 농도는 10 mM을 얻습니다.
  8. FACS 버퍼
    1. 실험 전날에는 0.5% BSA와 1x DPBS를 섞어 베이스 배지를 준비하고 여과합니다.
    2. 1M HEPES와 0.5M EDTA를 1x DPBS / 0.5% BSA에 추가하여 각각 최종 농도가 25 mM과 1 mM을 얻습니다.
  9. scRNAseq(MSC) 배지
    1. 실험 전날에는 0.4% BSA와 1x DPBS를 혼합해 배지를 준비하고 여과하세요.

4. 조직 채취 및 미세해리 (~ 40 - 50분)

  1. 아이소플루란으로 마취하고 기관 IACUC 지침에 따라 경추 탈구로 안락사합니다.
  2. 가는 겸자와 가위를 사용해 눈과 귀 사이 피부를 절개하고 부드럽게 당겨 눈물선을 노출시킵니다.
  3. 샘을 분리하기 위해 무딘 끝의 겸자를 사용해 살짝 들어 올리고, 주변 결합 조직을 원형으로 부드럽게 떼어내며 조심스럽게 분리합니다. 눈샘의 경계가 명확히 보여, 이하선을 포함한 인접 조직과 쉽게 분리할 수 있습니다.
  4. 각 분비선(각 분비선은 쥐의 무게, 생녀, 나이에 따라 약 10-25 mg)을 35mm 페트리 접시에 넣고, 얼음 위에 1x PBS 차가운 2mL를 넣습니다. 해부 현미경으로 남은 지방을 제거하고 두 개의 겸자로 결합 조직 캡슐을 조심스럽게 벗깁니다.
  5. 세포 표지의 확인은 형광 현미경으로 작은 조직 조각을 검사하고, 예상되는 리포터 또는 형광 신호를 확인한 후 효소 소화로 진행됩니다.
  6. 멸균된 35mm 페트리 접시를 얼음 위에 올려놓고, 접시 중앙에 1x PBS(양을 샘 크기에 맞게 조절한 부피)를 800-1000 μL에 넣습니다. 유즙선 하나를 1x PBS로 옮깁니다.
  7. 멸균 메스 두 개를 사용해 샘을 부드럽고 반죽 같은 질감이 될 때까지 작은 조각으로 곱게 다집니다. 다진 과정 내내 조직 조각이 PBS에 잠겨 있도록 하되, 접시 위를 자유롭게 떠다니게 하지 않도록 하세요.
  8. 접시 한쪽에서 조직 조각을 채취하고, 잔여 PBS를 흡인한 후 신선한 냉각 PBS 1mL로 조각을 세척합니다.
  9. 세척된 조직 조각을 6웰 플레이트에 옮기고, 웰당 2mL의 예열된 소화 배지를 넣습니다. 모든 샘플이 처리될 때까지 플레이트를 얼음 위에 보관하세요.

5. 첫 번째 효소 소화 (~1.5 - 2시간)

  1. 플레이트를 37°C, 60rpm의 흔들리는 물에 30분간 부양합니다.
  2. 넓은 보어 1mL 팁으로 조직을 15번 부드럽게 분쇄한 후, 플레이트를 다시 37°C, 60rpm의 흔들리는 물욕에 다시 넣어 추가로 30분간 세척합니다.
  3. 일반 1mL 팁으로 샘플을 10번 부드럽게 분쇄한 후, 플레이트를 37°C, 60rpm에서 다시 흔드는 물에 30분간 추가로 넣습니다.
  4. 샘플을 10번 부드럽게 분쇄한 후 세포 현탁액을 2mL 돌핀 마이크로 원심분리관으로 옮깁니다.
  5. 플레이트의 각 웰에 1mL의 차가운 BM1을 추가하여 잔류 세포가 포함된 남은 소화 배지를 수집합니다. 다음 단계까지 플레이트를 얼음 위에 올려두세요.
    참고: 이 단계에서 큰 세포 군집이나 조직 조각이 관찰된다면, 각 잠복 단계를 추가로 10-20분 연장하세요. 지정된 분열 횟수(최대 10-15회 부드럽게 통과)를 초과하지 마세요. 추가적인 기계적 스트레스는 세포 생존력을 저해할 수 있습니다.

6. 효소 활성 및 1차 세척 종료 (~ 15분)

  1. 세포 현탁액을 담은 튜브를 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리합니다.
  2. 상원액은 버리세요. 초기 플레이트의 각 웰(잔류 세포 포함)에서 BM1을 해당 튜브로 옮기고 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다.
  3. 각 웰을 600 μL 추가로 차가운 BM1로 세척한 후, 해당 튜브와 세척액을 결합해 남은 모든 세포를 수집합니다.
  4. 세포 현탁액을 부드럽게 다시 현탁하고, 다시 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리한 후 상청액을 버립니다.

7. 아큐타제 및 DNase 처리 (~ 30 - 35분)

  1. 세포 펠릿에 1mL의 Accutase를 추가하고 부드럽게 재현탁합니다. 튜브를 37°C, 60rpm에서 5-10분간 배양합니다.
    참고: 배양 중에는 세포가 가라앉아 바닥에 달라붙는 것을 방지하기 위해 튜브를 옆으로 눕혀야 합니다.
  2. 1mL 피펫 팁을 사용해 10번 부드럽게 분쇄하세요.
  3. 1mL의 차가운 BM2를 첨가하여 Accutase를 희석하여 효소 반응을 종료합니다.
  4. 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리하고 상원액을 버립니다.
  5. 세포를 배지에 재현탁하여 DNase 처리를 위해 튜브를 위쪽까지 채웁니다.
  6. RT에서 10분간 부양하고, 5분 후 한 번 부드럽게 재현탁하세요.
  7. 한편, 1mL의 BM3가 담긴 70 μm 세포 체를 15 mL 원뿔관 위에 미리 적셔 넣습니다.
  8. 셀 현탁액을 체로 옮기세요.
  9. 원래 채취관을 1mL의 BM3로 씻고, 같은 체에 세척액을 옮깁니다.
  10. 체를 5mL 추가로 BM3로 세척하세요.

8. 세포 수 및 생존 가능성 검사

  1. 여과된 세포 현탁액 10 μL을 BM3에 넣고 10 μL 트리판 블루와 혼합합니다. 트리판 블루 배제법을 사용하여 세포 농도와 생존 가능성을 측정하고, 수동 계수나 자동 세포 계수기(예: Countess 3 자동 세포 계수기)로 정량화합니다. 생존 가능성이 다음 응용의 기준치(일반적으로 ≥70-80%)를 충족할 때만 진행하세요.
    참고: 수율을 계산할 때 현재 15mL 튜브에 들어간 총 부피 ~7-9 mL를 고려하세요.
  2. 하류 적용에 따라 진행하세요. scRNA-seq는 섹션 9로 진행하세요. 플로우 사이토메트리 기반 세포 분류는 섹션 10으로 진행하세요.
    참고: scRNA-seq 워크플로우에는 적혈구 용해와 자기장 죽은 세포 제거가 포함되어 잔해와 주변 RNA를 줄이고 데이터 품질을 개선합니다. 그러나 이러한 단계들은 세포 유형 표현에 편향될 수 있으며, 이는 아시나르 세포를 포함한 취약하거나 희귀한 상피 집단에 우선적으로 영향을 줄 수 있습니다. 유세포분석 기반 분류의 경우, 회수 극대화와 세포 표면 에피토프 보존을 위해 이러한 단계들은 생략되었습니다. 따라서 워크플로우 선택은 실험 목표에 따라 진행되어야 하며, scRNA-seq나 세포 복원의 데이터 품질과 분류 및 후속 응용의 생존 가능성을 우선시해야 합니다.

9. scRNA-seq 세포 준비 (~ 1 - 1.5시간)

  1. 밀리큐 물로 10x 용액을 재구성하여 1x RBC 용액을 준비합니다.
  2. 세포 현탁액이 담긴 15mL 튜브를 400 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상정액을 버립니다.
  3. 세포 펠릿을 5mL 1x 적혈구 완충액에 재현탁하고 RT에서 5분간 배큐합니다.
  4. 다시 300 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리하고 상원액을 버립니다.
  5. 세포 펠릿을 2 mL의 차가운 BM4에 재현탁합니다.
  6. 여과된 세포 현탁액 10 μL을 BM4에 넣고 10 μL 트리판 블루와 혼합하여 세포 농도와 생존 가능성을 평가합니다.
  7. MACS 30 μm 체를 1 mL 1x HBSS로 미리 적셔 15 mL 튜브에 세포 현탁액을 걸러줍니다.
  8. 이전 채취관을 2mL의 차가운 BM4로 헹구고, 같은 체에 세척물을 15mL 튜브로 옮깁니다.
  9. 체를 10mL 차가운 BM4로 세척하세요.
  10. 15mL 튜브를 400 × g에서 4°C에서 5 분간 원 심분리하여 상원액을 완전히 제거합니다.
  11. 펠릿을 100 μL MACS 마이크로비즈에 부드럽게 재현탁한 후 RT에서 15분간 배양합니다.
  12. 그동안 멸균 이중 증류수를 사용해 죽은 세포 제거 키트에서 결합 완충제(BB) 1개를 준비하세요.
  13. MACS MS 컬럼을 500 μL 1x BB로 세척하여 평형을 맞춥니다.
  14. 샘플에 400 μL BB를 추가하고, 마이크로비즈로 세포를 재현탁한 후 전체 부피를 평형 MS 컬럼에 적용합니다. 흐름 물질을 15mL 튜브에 모으세요.
  15. 컬럼을 500 μL BB로 네 번 세척하여 모든 흐름 분획을 수집합니다.
  16. 400 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리한 후 상원액을 버립니다.
  17. 세포를 400 μL MSC 완충액에 재현탁시키고, 현탁액을 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
  18. 이전 튜브를 700 μL MSC 버퍼로 세척하고 샘플과 함께 헹군습니다.
  19. 400 × g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기로 넣고 상청액을 버립니다.
  20. 넓은 구경 팁을 사용해 MSC 버퍼에 세포 펠릿을 재현탁하여 최종 부피 약 1.5mL까지 만듭니다.
  21. 400 × g에서 4°C에서 5분간 원심분리기로 넣고 상청액을 버립니다.
  22. 상청액 ~100 μL을 남기고, 펠릿을 부드럽게 재현탁한 후 6 μL 세포와 6 μL 트리판 블루를 혼합하여 세포 수를 다시 세어.
  23. MSC 버퍼로 최종 부피를 조정하여 700-1200 세포/μL에 도달하고, 세포 농도를 확인하기 위해 세포를 재계산합니다.
  24. 적혈구 용해와 죽은 세포 제거 후 세포 생존율을 70%(일반적으로 70-95%) ≥ 10배 크롬 가공(크롬 단일세포 3' 용액 V3)을 투여하기 전에 보장합니다.
  25. 기본 scRNA-seq 품질 관리 기준을 적용하세요: nUMI > 500, nGene > 200, 미토콘드리아 유전자 분율<15%). 대사 활성이 높은 상피 집단을 보존하기 위해 허용 미토콘드리아 임계값(15%)을 사용하세요. 하위 분석에는 모든 QC 기준을 충족하는 세포만 포함하세요.
    참고: 이 QC 임계값은 당사 데이터셋에서 도출된 예시 값(보충 그림 1)이며, 이전 논문18에서 보고되었습니다.

10. 유동 세포분석을 위한 세포 준비 (~ 1 - 1.5시간)

  1. MECs와 섬유아세포의 유동 세포분석 기반 분리에는 각각 PdgfraEGFP 와 Acta2GFP 리포터 마우스 라인을 사용하여 각 집단의 정확한 식별을 가능하게 했습니다.
  2. 세포 현탁액이 담긴 15mL 튜브를 400 × 5 분간 4 °C에서 원심분리하고 상원액을 버립니다.
  3. 세포 펠릿을 차가운 FACS 완충기에 재현탁하여 최종 농도는 5 x 10⁵에서 2 x 10 x 106 셀/ 100 μL로 만듭니다.
  4. FACS 보상에 필요한 대조군을 준비합니다: 음성 대조군 - 야생형 마우스의 염색되지 않은 세포, 배경 형광 대조군 - Acta2GFP 및 PdgfraEGFP 마우스의 염색되지 않은 세포, 단일 염색 대조군 - 실험에 사용된 각 항체로 개별 염색한 야생형 마우스 세포.
    참고: 각 대조군 샘플에 대해 최소 1× 10⁵ 셀을 100 μL FACS 완충액에 재현탁하여 사용하세요.
  5. FcBlock(1:100)을 추가하고 얼음 위에서 5분간 배양하세요.
  6. CD326 (EpCAM)-APC 단클론 항체(1:100) 또는 CD140a (PDGFRα) 단클론 항체(1:100)를 추가하세요. 빛으로부터 보호한 상태로 얼음 위에 45분간 인큐베이팅합니다.
  7. 항체 배양 중에는 세포를 15분마다 부드럽게 재현탁하세요.
  8. 각 튜브를 위쪽까지 차가운 FACS 완충제로 채우고, 300 × g 에서 4 °C에서 5분간 원심분리기를 사용하세요.
  9. FACS 버퍼에 FxCycle 작업 용액(1:1000)을 준비하세요.
  10. 샘플을 1mL에 재현탁하고, FxCycle을 이용해 500μL 냉각 FACS 버퍼에 대조군을 넣습니다.
  11. 모든 샘플을 FACS 튜브로 옮기고 얼음 위에 보관하며 빛으로부터 보호하세요.
  12. 즉시 플로우 사이토메트리 코어로 이동하여 분류를 진행하세요. 분류된 세포는 후속 적용에 따라 FACS 버퍼, 배양 배양지, 용해 버퍼 또는 RNA 후에 수집합니다.
    참고: 기기 설정(예: 노즐 크기 및 압력)과 사건 발생률은 분류기 구성과 목표 셀 집단에 따라 달라집니다; 따라서 각 실험에 최적의 매개변수를 결정하기 위해 예비 파일럿 실행을 권장합니다.

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결과

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노화된 외분비샘의 해리 과정은 지질 축적과 광범위한 ECM 침착으로 인해 어렵습니다. 노화된 분비샘은 뚜렷한 림프구 침윤과 뇌관 내 물질과의 뚜렷한 관상 확장을 보이며, 이는 조직 해리를 복잡하게 하는 구조적·염증성 변화를 반영합니다. 눈물샘은 세 가지 주요 상피세포 유형인 원상피세포, 관세포, 근상피세포로 구성된 외분비 기관입니다. 원상세포는 각막 수분을 유지하고 항균 및 상처 치유 기능을 제공하는 눈물막의 수성 및 단백질 성분을 생성합니다. 노령 LGs에서는 만성 염증이 상피 손상, 면역 세포 침윤, 액차체 세포 내 지질 축적, 세포외 기질 침착 증가, 그리고 관관 확장과 연관되어 있으며, 이들은 모두 눈물 분비를 저해하고 조직의 이질성을 더욱 증가시킬 수 있습니다(그림 2). 그럼에도 불구하고, 본 프로토콜은 LG를 효과적으로 해리하여 젊은(2개월)과 노(20개월) 모두에서 주요 세포 군집을 식별할 수 있게 했...

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토론

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여기서는 외분비 조직에서 단일 세포 현탁액을 생성하는 데 있어 크게 개선된 프로토콜을 최적화하고 평가했으며, 특히 눈물선에 초점을 맞췄습니다. 이 접근법을 사용하여 노후 LG와 젊은 LG 모두에서 깨끗하고 고품질의 단일 세포 현탁액을 생성하여 단일 세포 시퀀싱 및 기타 후속 응용에 적합하게 만들었습니다.

수많은 조직 해리 프로토콜이 존재했음에도 불구하고, 격리 중 가장 취약한 세포 집단을 효율적으로 회복하기 위해 이들을 수정하고 최적화할 필요가 있었습니다. 특정 세포 집단의 취약성과 분리가 어려운 상피 및 중간엽 집단이 동시에 존재하기 때문에, 비효소적 기계적 해리만을 기준으로 초기 프로토콜에서 제외했습니다21,22. 냉 효소 해리는 저온(0-10 °C)에서 높은 촉매 활성을 유지하는 정신성 생물에서 유래한 프로테...

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공개 사항

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모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립보건원(NIH), 국립안과 연구소(NEI) 5R01EY026202 R01EY035333 연구비; 국립치과두개안면연구소(NIDCR) 보조금R01DE031044 2R01DE014756, 국립암연구소(NCI) 5R01CA271500 보조금의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
<강>물질
BSA 시그마-올드리치A4919
CaCl2 (1  M 솔루션)바이오비전B1010-100
콜라겐제 IV시그마-올드리치C5138
죽은 세포 제거 키트밀텐이 바이오텍130-090-101
죽은 세포 제거 키트밀텐이 바이오텍130-090-101
디스파즈 II로슈C756V28
DNase I시그마-올드리치DN25-100MG
DPBS 깁코, 써모피셔 사이언티브14190-144
태아 소 혈청, 초저 IgG깁코# 16250078
행크의 밸런스 소금 솔루션 (HBSS)코닝 (써모 피셔 사이언티픽)21-022-CV
HEPES (1  M 솔루션)시그마-올드리치H0887
이소플루란 용액코버투스# 11695067772
MACS® SmartStrainers (30 및 마이크로; m)밀텐이 바이오텍130-098-458
MACS® SmartStrainers(70 및 마이크로; m)밀텐이 바이오텍130-110-916
미디엄/F12 (DMEM/F12)밀리포어DF-042-B
MgCl2 1M시그마-올드리치M1028-100ML
MS 칼럼밀텐이 바이오텍130-042-201
NaCl (5M 스톡)인비트로젠과 무역;AM9759
인산염 완충식염수(PBS) 정제시그마-올드리치P8920-500ML
적혈구 용해액 (10번&1회)밀텐이 바이오텍130-094-183
스템프로 액큐타제 깁코, 써모피셔 사이언티브A1110501
트리판 블루 솔루션, 0.4%깁코, 써모피셔 사이언티브15250061
초순도 EDTA (0.5M, pH 8.0)인비트로젠15575020
<강>항체
CD140a (PDGFRA) 단클론 항체(APA5), APC-eFluor 및 trade; 780, 쥐 / IgG2a, 카파e바이오사이언스47-1401-82; RRID:AB_2784706
FcBlock (CD16/CD32 Fc 차단기)BD 생명과학  553141; 리드:AB_394656
FxCycle™ 바이올렛 스테인써모피셔 사이언티브F10347
쥐 CD326 (EpCAM)-APC 단클론 항체(G8.8), 쥐 IgG2a, 카파e바이오사이언스17-579182; 리드:AB_2716944
<강하>쥐
Acta2GFP  이보 칼라이지치 박사님의 친절한 선물PMID: 18571490
PdgfraEGFP  - B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J잭슨 연구소리드: IMSR_JAX:007669
<스트롱>장비
인비트로젠과 무역; 그리고 nbsp; 백작부인과 무역; 3 자동 셀 카운터피셔 사이언티브A49862; RRID:SCR_026963

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guo, J., et al. Aging and aging-related diseases: from molecular mechanisms to interventions and treatments. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 391(2022).
  2. Zhang, X., Wang, L., Zheng, Y., Deng, L., Huang, X. Prevalence of dry eye disease in the elderly: A protocol of systematic review and meta-analysis. Medicine (Baltimore). 99 (37), e22234(2020).
  3. Donthineni, P. R., et al. Aqueous-deficient dry eye disease: Preferred practice pattern guidelines on clinical approach, diagnosis, and management. Indian J Ophthalmol. 71 (4), 1332-1347 (2023).
  4. Yuksel, S., et al. Aging Affects Lipid Homeostasis in Lacrimal Glands by Upregulating Lipogenesis and Changing Its Specificity. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 1(2025).
  5. Galletti, J. G., et al. Ectopic lymphoid structures in the aged lacrimal glands. Clin Immunol. 248, 109251(2023).
  6. Delcroix, V., et al. Lacrimal Gland Epithelial Cells Shape Immune Responses through the Modulation of Inflammasomes and Lipid Metabolism. Int J Mol Sci. 24 (5), 4309(2023).
  7. Mauduit, O., et al. Spatial transcriptomics of the lacrimal gland features macrophage activity and epithelium metabolism as key alterations during chronic inflammation. Front Immunol. 13, 1011125(2022).
  8. Prasad, D., et al. Assessing the Independent and Combined Effects of Hyperosmolarity and Inflammatory Stress on Human Corneal Epithelial Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (13), 47(2025).
  9. Scholand, K. K., et al. Heterochronic Parabiosis Causes Dacryoadenitis in Young Lacrimal Glands. Int J Mol Sci. 24 (5), 4897(2023).
  10. Molla Desta, G., Birhanu, A. G. Advancements in single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics: transforming biomedical research. Acta Biochim Pol. 72, 13922(2025).
  11. Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. J Vis Exp. (29), e1266(2009).
  12. Jankelow, A., Almeida-Porada, G., Atala, A., Sawyer, S. W., Porada, C. D. Recent advancements in tissue dissociation techniques for cell manufacturing single-cell analysis and downstream processing. Stem Cells Transl Med. 14 (11), szaf055(2025).
  13. Duong, A., et al. A Rapid Human Lung Tissue Dissociation Protocol Maximizing Cell Yield and Minimizing Cellular Stress. Am J Respir Cell Mol Biol. 71 (5), 509-518 (2024).
  14. Koenitzer, J. R., Wu, H., Atkinson, J. J., Brody, S. L., Humphreys, B. D. Single-Nucleus RNA-Sequencing Profiling of Mouse Lung: Reduced Dissociation Bias and Improved Rare Cell-Type Detection Compared with Single-Cell RNA Sequencing. Am J Respir Cell Mol Biol. 63 (6), 739-747 (2020).
  15. Ikeuchi, T., et al. Dissociation of murine oral mucosal tissues for single cell applications. J Immunol Methods. 525, 113605(2024).
  16. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130(2020).
  17. Kahwaji, N. Universal Precautions. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL. (2024).
  18. Delcroix, V., et al. The First Transcriptomic Atlas of the Adult Lacrimal Gland Reveals Epithelial Complexity and Identifies Novel Progenitor Cells in Mice. Cells. 12 (10), 1435(2023).
  19. Mauduit, O., et al. A closer look into the cellular and molecular biology of myoepithelial cells across various exocrine glands. Ocul Surf. 31, 63-80 (2024).
  20. Zyrianova, T., Basova, L. V., Makarenkova, H. P. Isolation of Myoepithelial Cells from Adult Murine Lacrimal and Submandibular Glands. J Vis Exp. (148), e59602(2019).
  21. Montanari, M., et al. Automated-Mechanical Procedure Compared to Gentle Enzymatic Tissue Dissociation in Cell Function Studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  22. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. J Immunol Methods. 425, 69-78 (2015).
  23. Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
  24. Reichard, A., Asosingh, K. Best Practices for Preparing a Single Cell Suspension from Solid Tissues for Flow Cytometry. Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).
  25. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neurosci. 17 (1), 30(2016).
  26. Lai, T. Y., et al. Different methods of detaching adherent cells and their effects on the cell surface expression of Fas receptor and Fas ligand. Sci Rep. 12 (1), 5713(2022).

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