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방법 논문

산소 전달 응용을 위한 계층적 다공성 UiO-66 나노입자에서의 합성, 헤모글로빈 캡슐화 및 이교수 PEGylation

604 조회수

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DOI:

10.3791/70445

⸱

2026년 5월 8일

 , 
1Department of Health Technology, Technical University of Denmark

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 산소 전달을 위해 설계된 계층적으로 다공성인 UiO-66 나노입자의 합성, 헤모글로빈 캡슐화, 표면 PEG질화를 상세히 설명합니다. 이 절차는 결함 공학과 변형 촉진 바이코치옹 커지먼트를 결합하여 생의학 응용에 적합한 투과율이 높고 생리학적으로 안정적인 운반체를 생성합니다.

초록

헤모글로빈 기반 산소 운반체(HBOCs)는 여러 생의학적 맥락에서 저산소증을 완화하는 중요한 산소 전달 플랫폼입니다. 하지만 자유 헤모글로빈(Hb)은 적혈구 밖에서는 불안정하고 혈관 활성 상태입니다. 여기서는 Hb를 캡슐화하고 생체 직교 폴리에틸렌글리콜(PEG) 껍질로 안정화되는 계층적 다공성 UiO-66 나노입자(HP-UiO-66 NPs)를 제작하기 위한 재현 가능하고 확장 가능한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 계층적 중포로시티는 도데카노산 변조와 이후 산 세척을 통해 도입되어, 결정성이 보존되고 I/IV N2 등온선이 결합된 HP-UiO-66-NH₂ NP를 생성합니다. 표면 아민은 아지드(HP-UiO-66-N₃ NPs)로 전환되어, 촉매가 없는 변형 촉진 알킨-아지드 고속도로첨가물(SPAAC)가 Hb@HP-UiO-66-PEG NP를 생성할 수 있게 합니다. 작업 흐름은 다음과 같습니다: i) UiO-66-NH₂ NP의 결함 공학, ii) 변조기 제거, iii) 아지드 설치, iv) 버퍼 수용 매체에서의 Hb 부하, v) SPAAC 매개 PEGylation. 각 단계마다 중요한 실험 매개변수, 표준 고장 모드, 문제 해결 전략이 상세히 설명되어 실험실 간 재현성을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 배치당 HP-UiO-66-NH₂ NP를 그램 단위로 생산할 수 있습니다. Hb의 캡슐화 효율은 온화한 조건에서 ~35%(적재 함량 ~24 wt%)를 얻으며, PEG화화 후 유체역학적 직경 ~140 nm의 재분산성 NP를 사용합니다. 포괄적인 물리화학적 특성 분석을 통해 프레임워크의 완전성, 중간포로시성, 성공적인 표면 화학, 그리고 최대 ~12 nm 너비의 확산 PEG 코로나가 검증됩니다. 기능적 분석은 캡슐화된 Hb의 산소 공급/탈산소 가역성을 보여주며, 산소 운반 능력이 유지됨을 나타냅니다. PEG화는 식염수, HEPES, 혈청에서 콜로이드 및 구조적 안정성을 현저히 향상시켜 비PEG화에서 관찰되는 인산염 유발 분해를 방지합니다. 상세한 문제 해결 안내, 중요한 단계의 영상 시각화, 확장 고려사항을 통합함으로써, 이 모듈식 프로토콜은 금속-유기물 프레임워크 기반 HBOC로 가는 견고하고 접근 가능한 경로를 제공합니다. 이 전략은 치료 전달을 위해 보호적이면서도 접근 가능한 미세 환경이 필요한 다른 생체대분자나 효소에도 쉽게 적응할 수 있습니다.

서론

적절한 산소 공급은 다양한 생의학 환경에서 효과적인 치료와 조직 치유를 위해 매우 중요합니다. 외상 및 수술 출혈에서는 심한 산소 손실이 생명을 위협할 수 있어, 기증자 혈액이 없을 때 안전한 혈액 대체 혈액의 필요성을 강조합니다. 종양학에서는 저산소 종양 부위가 산소 의존 치료의 효과를 제한하며, 보조 산소 공급은 치료 효과를 현저히 향상시킬 수 있습니다 3,4,5,6. 산소는 상처 치유에서도 중심적인 역할을 하며, 산소 가용성이 증가하면 혈관신생과 조직 수리가 촉진됩니다7. 마찬가지로, 허혈성 상태와 장기 이식에서는 산소 운반체가 저산소 손상을 줄이고 조직의 생존력과 회복력을 향상시킬 수 있습니다 8,9.

합성 헤모글로빈(Hb) 기반 산소 운반체(HBOCs)는 저산소증 완화에 유망한 접근법입니다. 하지만 적혈구(적혈구) 외부의 Hb는 본질적으로 불안정하며 빠르게 이합체로 해리되어 신독성, 산화 손상, 그리고 질소 산화물 청소로 인한 혈관 수축을 일으킬 수 있습니다. 이러한 문제를 완화하기 위해 리포 좀12, 폴리머좀13, 고분자 나노입자(NP)와 같은 생체 적합성 나노캐리어 내에서 Hb를 안정화하는 캡슐화 전략이 개발되었습니다. 이 시스템들은 Hb 안정성을 향상시키지만, 고유 산소 결합 기능을 유지하면서 높은 캡화 효율을 달성하는 것은 여전히 도전적입니다18. 또한, 메트헤모글로빈으로의 산화적 전환과 헴 누출은 산소 운반 성능을 저해할 수 있습니다19. 빠른 배출과 조기 Hb 누출은 순환 시간과 임상 번역을 더욱 제한합니다20.

금속-유기 프레임워크(MOFs)는 결정 구조, 넓은 표면적, 그리고 조절 가능한 다공성 덕분에 약물 및 생체 거대분자 전달을 위한 다목적 나노플랫폼으로 최근 부상했습니다. 유기 링크커와 정렬된 금속 노드로 구성된 MOF는 분자 확산과 구조 맞춤화를 가능하게 하여 생의학 응용 분야에 매력적입니다. 그러나 대부분의 MOF는 주로 미세공공(<2 nm)을 가지고 있어, 단백질, 핵산 또는 효소22, 23, 24, 25와 같은 고분자의 합성 후 캡슐화를 심각하게 제한합니다. 이 한계를 극복하는 한 가지 방법은 현장 생체 모방 광물화(in situ biomometic mineralization)로, 생체분자가 MOF 성장 중 핵생성 중심 역할을 하는 것으로, ZIF-8과 ZIF-90에서 입증되었습니다26,27,28. 효과에도 불구하고, 이 전략은 양성 가능한 MOF 화학의 범위를 제한하는 약한 합성 조건을 요구합니다.

UiO-66은 Zr6O4(OH)4 팔면체 노드와 1,4-벤젠디카복실레이트(BDC) 연결체로 구성된 지르코늄 기반 MOF로, 뛰어난 화학적 안정성과 생체 적합성으로 돋보입니다31. 견고한 구조는 수중 및 생리 환경에서 분해를 방지하여 생의학 응용 분야에 이상적입니다32. 그럼에도 불구하고, 그 본질적인 미세다공성 구조 때문에 생체거대분자 캡슐화에는 적합성이 제한됩니다. 분자 크기가 ~5 nm인 Hb는 순수한 UiO-66의 내부 기공 내에 수용할 수 없습니다. 이에 따라 UiO-66을 Hb 관련 시스템에서 탐구한 연구는 소수에 불과하며, MOF는 주로 표면 기반 Hb 감지에 사용되며 프레임워크 캡슐화에는 사용되지 않는다33,34. 그 결과, UiO-66 기반 Hb 캡슐화 플랫폼은 여전히 비교적 미완성 상태로 남아 있습니다.

최근에는 Hb를 수용할 수 있는 중공성 도메인을 포함해 이 공의 크기 제한을 극복하는 계층적 다공성 UiO-66 NP(HP-UiO-66 NP)를 도입하여, HBOC 개발을 위한 UiO-66의 기능 범위를 확장했습니다35. 계층적 다공성은 결함 공학을 통해 도입되며, 합성 과정에서 도데카노산(DA)과 같은 장쇄 단카복실산을 조절제로 사용하여 사용된다. 이 변조체는 Zr4+와의 배위를 두고 BDC 리간드와 경쟁하여 결함 형성과 중간공 확대를 초래합니다. 이후 변조자를 제거하면 미세공과 중공성 도메인이 공존하는 HP-UiO-66 NP가 생성되며, 변조제 농도 또는 사슬 길이에 따라 공 크기를 조절할 수 있습니다.

중간포로시티 도입은 분자 접근성을 높이지만, 인산염 함유 버퍼의 프레임워크 무결성을 저해할 수도 있습니다. 인산염 이온은 Zr 클러스터와 협력하여 부분적 또는 완전한 구조적 붕괴를 초래할 수 있습니다38,39. 따라서 표면 안정화 전략은 생리학적 조건에서 콜로이드 및 화학적 안정성을 유지하는 데 필수적입니다40. 일반적으로 MOF 표면 안정화는 비공유 상호작용(예: 반 데르발스 상호작용 및 수소 결합)41, 노출된 금속 부위와의 배위 상호작용42, 또는 유기 링크43에 대한 공유 결합을 통해 달성될 수 있습니다. 여러 연결 물질 중에서, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)은 광범위한 가용성과 최소한의 합성 복잡성 덕분에 특히 매력적입니다44. 특히, PEG 표면 변형(일반적으로 PEG기화)은 우수한 생체 적합성, 비특이적 단백질 흡착 감소, 면역 인식 및 대식세포 흡수 감소 등 약물 전달 시스템에 여러 유리한 특성을 부여합니다45,46. 이 효과들은 종합적으로 면역원 반응을 줄이고 전신 순환을 연장합니다47.

전통적인 PEGylation 기술은 종종 카보디이마이드 또는 말레이이마이드 화학에 의존하며, 이들은 촉매나 반응성 중간체가 필요하여 Hb와 같은 민감한 생체분자를 손상시킬 수 있습니다. 이 한계를 우회하기 위해 우리는 아지드와 디벤질사이클로옥틴(DBCO) 기능화된 종 간의 촉매 없는 생체 직교 반응인 변형 촉진 알킨-아지드 사이클로가전(SPAAC)을 사용하여 온화한 수용 조건에서 부위특이적 접합을 가능하게 합니다35,48. 이 방법은 캡슐화된 Hb 기능을 저해하지 않으면서 효율적인 표면 변형을 보장합니다.

구조 설계와 생체기능 검증에 중점을 둔 이전에 보고된 HP-UiO-66 NPs35를 바탕으로, 본 프로토콜은 정의된 매개변수 범위와 중요한 처리 고려사항을 포함한 상세하고 단계별 실험 워크플로우를 제공하여 방법론적 투명성과 재현성을 강조합니다. 합성의 핵심 단계, Hb 캡슐화, SPAAC 화학을 통한 PEG질화에 대한 문제 해결 지침이 포함되어 있으며, 궁극적으로 안정적인 Hb@HP-UiO-66-PEG NP를 얻습니다( 그림 1 참조).

작업 흐름은 다음과 같습니다: (i) DA를 조절자로 사용하여 아미노 변형된 HP-UiO-66-NH2 NP를 합성하는 결함 공학; (ii) 표면 아민기의 아지드 기능화; (iii) 온화한 수용성 조건에서 Hb의 캡슐화; (iv) SPAAC를 통한 공유 결합 PEG 결합.

각 주요 단계마다 이 프로토콜은 입자 집단, 기공 붕괴, 비효율적인 표면 기능화 등 흔한 실험적 문제를 식별하고, 실험실 간 재현성을 향상시키기 위한 실용적인 문제 해결 전략을 제공합니다. 특히, 이 글은 HP-UiO-66 NPs의 합성이 쉽게 확장될 수 있어 배치당 신뢰성 있는 그람 규모 생산이 가능함을 광범위하게 입증합니다.

최종 PEG질화된 나노캐리어는 생리식염수, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라지네탄설폰산(HEPES), 혈청에서 높은 콜로이드 안정성을 보이며, Hb의 산소 결합 및 방출 능력35를 유지합니다. 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR), 핵자기공명(NMR), 분말 X선 회절(PXRD), 질소(N2) 흡수, 제타(ζ)-퍼텐셜 분석, 동적 광산란(DLS), 주사 전자현미경(SEM), 투과 전자현미경(TEM)과 같은 분석 방법은 화학적 변환, 프레임워크 무결성, 다공성, 나노 규모 형태 및 성공적인 표면 기능화를 확인합니다.

재현성, 확장성, 운영적 명확성을 강조하고, 기술적으로 민감한 단계의 영상 기반 시각화를 통해 이 방법론은 안정적인 MOF 기반 산소 운반체를 재현 가능하고 견고하며 접근 가능한 방식으로 제작할 수 있는 경로를 제공합니다. 중요한 점은, 이 접근법이 모듈화되어 기능을 유지하기 위해 보호되면서도 산소 투과성이 있는 미세환경이 필요한 다른 생체대분자나 효소에 쉽게 적응할 수 있다는 점입니다. 따라서 Hb@HP-UiO-66-PEG NPs는 산소를 효율적으로 전달하면서도 생물학적 체액 내 분해에 저항할 수 있는 HBOC 개발을 향한 유망한 진전을 의미합니다.

실용적인 관점에서 이 전략은 Hb 이상의 다른 생체대분자에도 확장될 수 있으며, 이들이 약 20 nm 미만의 크기(최대 접근 가능한 중간공 크기에 해당)를 가지고, 다음 중 하나 이상을 보여야 합니다: (i) 가혹한 화학 조건에 대한 민감성, 온화한 합성과 표면 변형을 선호함; (ii) 기능적 활동을 유지하기 위해 수분 공급되고 산소 투과성이 있는 미세환경이 필요함; 그리고 (iii) 인산염에 의한 MOF 열화에 취약하여 표면 안정화가 필요함을 의미합니다. 이 접근법은 중간 결함 밀도를 기준으로 중간포어 접근성과 프레임워크 무결성 균형을 맞추는 데 중점을 둡니다. 생체분자 기능을 보존하기 위해 촉매가 없는 부위 특이적 표면 변형이 필요할 때, SPAAC 기반 PEGylation은 명확한 이점을 제공합니다. 따라서 이 프로토콜은 생리학적 조건에서 효율적인 생체거대분자 하중, 기능 보존, 장기 콜로이드 안정성에 적합하며, 훨씬 큰 생체분자나 극한의 열 또는 산 안정성을 요구하는 시스템은 대체 MOF 플랫폼이 필요할 수 있습니다.

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프로토콜

1. Hb 추출 (예상 소요 기간: 2일)

참고: 상업적으로 이용 가능한 소 혈액(SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK)에서 Hb 추출은 이전에 보고한 프로토콜49에 따라 수행됩니다.

  1. 소의 혈액(일반적으로 한 번에 10mL씩)을 50mL 원뿔형 원심분리관에 옮깁니다. 혈액을 희석하고 점도를 낮추기 위해 0.9% (w/v) 식염수를 같은 부피로 첨가하세요. 부드럽게 여러 번 뒤집어 균일한 현탁이 될 때까지 반복합니다.
  2. 희석된 혈액을 1,500 x g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리합니다. 원심분리 후에는 조밀한 붉은 펠릿(적혈구) 위에 투명한 노란색 상원액(혈장)이 나타납니다. 완전한 펠릿이 이루어지지 않으면 필요에 따라 원심분리를 계속하세요.
  3. 플라즈마 층을 조심스럽게 디캔트하고 폐기하면서도 펠릿을 건드리지 마세요. 신선한 식염수(10mL)를 추가하고, 적혈구 펠릿을 부드러운 역전으로 재현탁한 후, 동일한 조건에서 원심분리 과정을 반복합니다. 혈장, 단백질, 혈소판을 제거하기 위해 총 두 번의 세척 사이클을 수행하세요.
    참고: 세척 과정은 하류 톨루엔 추출을 방해할 수 있는 혈장 오염물질이 없는 순수 적혈구를 얻는 데 매우 중요합니다.
  4. 두 번째 세척 후에는 상청액을 버리고 세척된 적혈구 펠릿을 톨루엔, 초순수수, 식염수 혼합물에 1:0.4:1의 부피 비율로 재현탁합니다. 예를 들어, 펠릿을 넣기 전에 50 mL 분리 깔때기에서 톨루엔 10 mL, 초순수 4 mL, 식염수 10 mL를 섞어 넣습니다.
  5. 깔때기를 밀봉하고 부드럽게 여러 번 뒤집어 단계들을 섞으세요. 깔때기를 4°C에서 하룻밤(~12-16시간)에 두어 완전한 상 분리를 가능하게 합니다. 톨루엔상은 지질막을 추출하여 Hb 함량이 풍부한 투명한 수상을 남깁니다.
  6. 다음 날, 분리 깔때기의 스톱콕을 이용해 하부 수층을 조심스럽게 수집합니다. 이 층은 투명하고 짙은 붉은색으로 보입니다.
  7. 수용성 Hb 용액을 원심분리관에 옮기고, 4°C에서 8,000 x g 에서 20분간 돌려 남아 있는 세포 이물질이나 유화 물질을 제거합니다.
  8. 진공 여과 장치를 이용해 상청토를 규조토 분열로 걸러냅니다. 부드러운 진공만 적용하세요(거품이나 단백질 변성이 발생할 수 있는 높은 음압은 피하세요).
  9. 스트로마 프리 Hb가 포함된 여과액을 수집하세요. 즉시 사용할 경우 얼음에 보관하거나, 알리코트(~1 mL)로 보관한 후 장기간 사용 시 −80 °C에서 냉동하세요.
    참고: Hb 알리코트는 몇 달간 냉동 보관해도 분해가 감지되지 않습니다.
  10. 제조사 프로토콜에 따라 순수 소 Hb를 교정 표준으로 사용하여 비신코닌산 단백질 분석법을 사용하여 Hb 농도를 정량합니다. 최종 Hb 재고를 원하는 작동 농도로 조정합니다(일반적으로 HEPES 버퍼 내 20 mg mL-1 , pH 7.4).
    참고: 세포 물질이 없는 투명하고 붉은 Hb 용액을 기대하세요.
  11. 선택 사항: 추출된 Hb의 자외-가시 흡수 스펙트럼(375-700 nm)을 측정하여 산소 결합 및 방출 능력을 평가합니다. 초기 자외선-가시 스펙트럼을 기록하세요. 디티오나이트를 추가하고N2 가스로 10분간 퍼지하여 산소를 방출하고, 탈산소화된 Hb 스펙트럼을 기록합니다. 그 후 10분간 공기로 퍼지하여 산소 재공급과 스펙트럼 재기록을 허용합니다.
    참고: 산소화된 산소(소렛 밴드의 경우 ~412 nm; Q 밴드의 경우 ~541 및 ~577 nm)와 산소 제거(소렛 밴드는 ~430 nm, Q-밴드는 Q-밴드의 ~557 nm)로 각각 공기와 N2로 정화한 후의 특징적인 소렛 및 Q 밴드의 존재는 Hb가 여전히 기능함을 나타냅니다(보충 그림 1).
    주의: 톨루엔은 실험실 가운, 안전경, 장갑 등 적절한 개인 보호 장비를 착용한 채 연기구 내에서 조심하여 다룰 수 있습니다. 본 연구에서는 모든 톨루엔 함유 폐기물이 덴마크 환경부 지침에 따라 지정된 용기(그룹 C)에 유기 화학 액체 폐기물로 수집되어 폐기되었으며, "톨루엔 및 혼합물"이라는 라벨이 붙었습니다. 해당 폐기물 처리 문서는 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

2. HP-UiO-66-NH2 NP 제작 (예상 기간: 3일)

주의: HCl(37%)은 부식성이 있습니다; 실험실 가운, 산성 방지 장갑, 적절한 눈 보호구를 착용한 채 연기구 내부에서 다루세요. 산을 천천히 첨가하고 증기 흡입을 피하세요.

  1. ZrCl4 (400mg, 1.715 mmol)를 250mL 둥근 바닥 플라스크에 무게를 재세요. DMF(80 mL)를 천천히 추가하고 5분간 초음파로 가열하여 ZrCl4를 완전히 녹입니다. DA(12 g, 60 mmol)를 추가하고 30분 더 초음파 가열하여 투명하고 균질한 용액이 나올 때까지 가열합니다. 눈금이 달린 실린더를 사용해 전체 용액 부피를 측정하고, 필요에 따라 DMF를 추가하여 최종 부피를 100 mL로 조정합니다. DA는 경쟁 변조자로서 제어된 격자 결함을 도입합니다.
    참고: ZrCl4를 용해할 때는 DMF를 천천히 첨가하세요. 이 배위 과정이 발열 반응을 일으켜 약간의 연기를 유발할 수 있습니다; 모든 작업을 연기 후드에서 수행하세요. DA 도입으로 인한 부피 증가를 고려하여, 초기 부피 80 mL DMF를 사용해 ZrCl4와 DA를 용해하고, 최종 부피는 완전한 용해후에만 100 mL로 조정하여 정확한 농도 조절을 보장합니다.
  2. 같은 플라스크에 2-아미노-1,4-벤젠디카복실산(BDC-NH2, 155mg, 0.857 mmol)을 추가하고 추가로 30분간 초음파 처리합니다. 균일한 연한 노란색 용액이 나올 때까지 계속합니다.
  3. 혼합물을 용매열 합성에 적합한 150 mL 테플론 라이닝 오토클레이브 또는 둥근 바닥 압력 용기에 옮깁니다. 단단히 밀봉한 후 120°C에서 예열된 머플 퍼니스에 18시간 동안 보관하세요. 가열 중에는 원자로를 방해하지 말아 통제되지 않은 핵생성을 방지하세요.
  4. 반응 후에는 용기를 끄고 용기를 자연스럽게 실온(~2시간)까지 냉각시킵니다. 매질 전체에 균일하게 나타나는 미세한 노란색 현탁액을 관찰하세요.
  5. 원심분리(11,000 x g, 10분, 실온)로 제품을 수집한 후 상원액을 버립니다. 펠릿을 DMF(100 mL)로 세 번 세척하여 동일한 원심분리 조건으로 과도한 리간드와 반응하지 않은 DA를 제거합니다. 제품이 완전히 페일렛이 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요.
  6. 0.5 mL 농축 HCl(37%)을 포함한 DMF(100 mL)로 구성된 산 제거 용액을 준비합니다. 세척된 펠릿을 이 용액에 완전히 담근 후 머플 퍼니스에서 90°C에서 12시간 가열합니다. 이 단계는 DA 변조기를 제거하여 구조 내에 중간공을 생성합니다.
  7. 12시간 후에는 원심분리기(11,000 x g, 5분, 상온)로 상청액을 버립니다. 산성 처리를 0.5 mL HCl이 포함된 신선한 배치로 반복하여 DA를 완전히 제거합니다. 제품이 완전히 페일렛이 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요.
  8. 펠릿을 DMF, 아세톤, 에탄올(100 mL, 11,000 x g, 5분, 실온)으로 순차적으로 세척하여 잔여 산과 용매를 제거합니다. 침전물이 완전히 덩어리가 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요. 각 세척 사이에는 소용돌이 또는 가벼운 초음파 처리로 펠릿을 부드럽게 재분산시킵니다.
  9. 제품을 후드 내에서 상환경적으로 건조한 후 진공 오븐(140 °C)에서 하룻밤 건조합니다. 최종 재료(HP-UiO-66-NH2 NPs)는 미세한 노란색 가루로 나타납니다. 일반적인 수확량은 ~428 mg입니다.
  10. 2θ = 7.3°, 8.4°, 25.7°의 PXRD 피크가 여전히 선명함을 확인하여(그림 2A), 결정질 UiO-66 위상이 유지되고 있음을 나타냅니다. 알칼리성 분해 후 1HNMR로 DA가 완전히 제거되는지 확인(1.2 ppm에서 메틸렌 피크 없음)(그림 2B).
  11. N2 흡착-탈착 반응으로 77 K50에서 다공도를 특성화합니다. 이 곡선은 히스테리시스 루프(그림 2C)와 결합된 I/IV 등온선을 나타내며, 중간공 형성을 확인한다.
    참고: 고온 건조 불완전 또는 시료 질량 부족은 N2 흡착-탈착 등온선을 사용한 공극도 측정이 부정확합니다; 진공 건조 과정을 140 °C에서 반복하고, Brunauer−Emmett−Teller(BET) 면적이 1,000 m2 g-1< 시료 무게가 100 mg을 초과하도록 합니다.
  12. 선택 사항: SEM을 이용해 NP의 형태를 평가할 수 있습니다. HP-UiO-66-NH2 NP는 구형 형태를 보이며 크기가 ~100 nm에 달합니다(그림 2D).
    참고: HP-UiO-66-NH2 NP는 미세공자와 중간공을 모두 포함하며, 이후 Hb 캡슐화에 적합할 것으로 예상합니다.
  13. HP-UiO-66-NH2 NP의 합성은 2.1 - 2.9단계에서 사용되는 모든 시약과 용매의 양을 비례적으로 늘리고 여러 병렬 용매열 반응을 수행함으로써 확장할 수 있습니다. 동일한 몰 비율, 농도, 반응 온도, 반응 시간을 유지하고 시약 및 용매 양을 1.5배 증가시키면, 두 개 이상의 150 mL 테플론 라이닝 오토클레이브 또는 둥근 바닥 압력 용기를 동시에 작동시켜 HP-UiO-66-NH2 NP의 그람 규모 생산이 가능합니다(그림 3).
    참고: 실험실 가운, 산성 방지 장갑, 적절한 안구 보호구를 착용한 상태에서 모든 유기 용제를 연기 후드 안에 다루세요. 모든 DMF 함유 폐기물을 수집하여 덴마크 환경부 지침에 따라 "DMF 및 혼합물"이라고 표시된 지정된 용기(그룹 C)에 유기 화학 액체 폐기물로 폐기합니다. ZrCl4 와 HCl이 미량으로 포함된 폐기물 용액은 이에 맞게 처리되었습니다. 해당 폐기물 처리 문서는 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

3. HP-UiO-66-NH2 NPs의 아지드 기능화 (HP-UiO-66-N3 NP) (예상 기간: 1일)

주의: 트리메틸실릴 아지드(TMSN₃)와 삼부틸 아질산염(tBuONO)은 독성이 있고 휘발성이 있습니다. 모든 과정을 실험실 가운, 니트릴 장갑, 안구 보호구를 착용하고 연기구 내부에서 진행하세요.

  1. 25mL 둥근 바닥 플라스크에 HP-UiO-66-NH2 NP(50mg)를 정확히 저울을 재세요. THF(10 mL)를 추가하고 5분간 초음파 검사하여 입자를 완전히 분산시킵니다. 서스펜션은 불투명하지만 균일하게 변합니다.
    참고: 초음파 후 NP의 균일한 분산은 반응물과의 효과적인 접촉에 매우 중요합니다. 분산이 불완전하면 용액 부피를 늘리고 초음파 검사를 반복합니다.
  2. 플라스크를 400rpm으로 설정된 자석 교반기 위에 얼음물 욕조(0°C)에 넣습니다. 유리 주사기를 사용해 5분 동안 5분 동안 0.4mL 양쪽으로 온도를 5°C 이하로 유지하며 투여합니다.
  3. 즉시 TMSN₃(0.35 mL)을 같은 냉기 조건에서 점차 첨가합니다. 약간의 기품이 나타날 수 있는데, 이는 질산화 진행 상황을 나타냅니다. 욕조를 알루미늄 호일로 감싸서 빛으로부터 반응을 보호하세요..
  4. 반응 혼합물을 얼음물에서 하룻밤(~16시간) 계속 저어주어 MOF 표면의 아민기가 완전히 치환되도록 합니다.
  5. 얼음 욕조를 제거하고 현탁액이 실온에 도달하도록 하세요. 원심분리기(11,000 x g, 5분, 실온)로 수정된 NP를 수집합니다. 침전물이 완전히 덩어리가 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요.
  6. 펠릿을 THF(10 mL)로 세 번 완전히 세척하고, 각 세척 후 원심분리(실온에서 11,000 x g, 5분)로 수집합니다. 이어서 아세톤(10mL)을 사용한 세 차례의 추가 세척을 하고, 같은 조건에서 원심분리하여 잔류 시약과 부산물을 제거합니다. 침전물이 완전히 덩어리가 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요.
  7. 제품(HP-UiO-66-N3 NPs)을 140 °C 오븐에서 진공 상태로 하룻밤 건조한 후 후드 내에서 상존 건조 후 건조합니다. 일반적인 수확량은 ~45mg입니다.
  8. FTIR 분광법으로 화학 변환을 검증하라: ~2122 cm-1 에서 급격한 비대칭 아지드 스트레칭이 나타난다(그림 4A). 밴드 강도는 표면 치환 효율과 상관관계가 있습니다.
    참고: 변환이 불완전하면 이후 클릭 활용에 지장이 있을 수 있습니다. 아지드 밴드가 약할 경우, t, BuNO, TMSN₃의 2배 양을 사용하여 기능화를 반복합니다. 아지도 말단 HP-UiO-66-N3 NP가 결정성 보존 및 중간공성 구조를 갖추고 있으며(그림 4B-D), Hb 캡슐화 및 SPAAC PEGylation에 적합할 것으로 예상됩니다.
    주의: TMSN₃이 포함된 모든 폐기물은 덴마크 환경부 지침에 따라 지정된 그룹 O 유해 폐기물 용기에서 다른 시약(예: tBuONO와 THF와 혼합된 것)을 포함해 수집하십시오. 모든 용기에 TMSN₃ 및 그 혼합물의 존재를 명확히 표시하세요. 관련 폐기물 처리 문서는 보충 파일 1에 제공되어 있습니다.

4. Hb 부하 및 정량화 (예상 기간: 2일)

  1. HP-UiO-66-N3 NPs(5 mg)를 2 mL 원심분리관에 옮긴 후, 0.5 mL HEPES 버퍼(20 mM, pH 7.4)에서 ~2분 초음파 검사를 합니다. Hb가 함유된 HEPES 완충액 0.5mL(20 mg mL-1)를 추가하고, 튜브를 여러 번 부드럽게 뒤집어 NP를 완전히 분산시킵니다.
  2. 튜브를 열셰이커에 올려 실온(22-25 °C)에서 1,000 rpm 아래에서 2시간 동안 배양하세요.
  3. 배양 후에는 실온에서 13,500 x g 원심분리기로 5분간 원심분리하여 얻은 Hb@HP-UiO-66-N3 NPs를 펠릿으로 추출합니다. 상청액을 주의 깊게 수집하여 갇히지 않은 Hb의 정량화를 수행합니다. 침전물이 완전히 덩어리가 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요.
  4. 펠릿을 초순수수(1mL)로 부드럽게 세척한 후 피펫팅으로 위아래로 느슨하게 흡착된 Hb를 제거한 후 두 번 세척합니다. 각 세척액의 상액을 신중히 수집하여 함정되지 않은 Hb의 정량화를 수행하세요. 최종 펠릿을 0.5mL 초순수수에 재현탁하여 특성화합니다. 산화를 막기 위해 샘플을 냉장 보관(4 °C)하세요.
  5. 수집된 상청액에서 갇히지 않은 Hb를 라우릴 황산나트륨(SLS)-Hb 분석법51을 사용하여 측정합니다. 각 상원액 10 μL을 96웰 마이크로플레이트에 피펫 흡입하고, 100 μL SLS 시약(초순수수 내 0.6 mg mL-1 )을 첨가합니다. 실온에서 어두운 환경에서 5분간 인큐베이트한 후, UV-가시광도계로 412nm에서 흡수도를 측정합니다.
  6. HEPES 버퍼에서 Hb 스톡 용액(0-10 mg mL-1)을 사용해 표준 곡선을 만들어 흡광도 값을 농도로 변환합니다.
  7. 캡슐화 효율(EE)과 적재 내용(LC)을 다음과 같이 계산합니다:
    EE (%) = [(초기 Hb - 상정액 Hb)/초기 Hb] × 100
    LC (%) = [(캡슐화된 Hb)/(캡슐화된 Hb + NP 질량)] × 100
  8. Hb 캡슐화를 확대하기 위해 NP 100mg을 20mL Hb 용액(10 mg mL⁻¹)과 함께 배양합니다. 캡슐화 후 공극도를 평가하기 위해, 생성된 비탄을 에탄올에 24시간 담근 후 140°C의 진공 오븐에서 하룻밤 건조한 후N2 흡착-탈착 등온선을 기록하여 다공도를 평가합니다. 분말의 붉은색은 Hb가 성공적으로 캡슐화되었음을 나타내며(그림 5A),N2 흡수가 현저히 감소하면 중간공이 Hb로 성공적으로 채워졌음을 확인한다(그림 5B).
  9. Zetasizer Nano ZS를 사용해 ζ 전위를 측정하세요. 표면 전하는 ~+40 mV (HP-UiO-66-N3 NP)에서 ~+20 mV (Hb@HP-UiO-66-N3 NP)로 감소하며, 이는 Hb 흡착과 일치합니다(그림 5C).
  10. 선택 사항: 형태학적 완전성과 구조적 안정성을 보장하기 위해 SEM 현미경사진(그림 5D)과 PXRD 회절도(그림 5E)를 획득할 수 있습니다.
  11. NP의 가역적 산소 결합을 평가하기 위해 UV-vis 스펙트럼(375-700 nm)을 기록합니다. 나트륨 디티오나이트를 첨가하고N2 로 10분간 퍼지하여 산소를 방출한 후 스펙트럼을 기록한 후, 재결합을 위해 10분간 공기로 퍼지한 후 다시 스펙트럼을 기록합니다(그림 5F).
    참고: 공기와N-2로 정화한 후 각각 산소화된 (소렛 밴드의 경우 ~412 nm; Q-밴드의 ~541 및 ~577 nm)과 소렛 밴드의 산소 제거(소렛 밴드는 ~430 nm, Q-밴드는 Q-밴드의 ~57 nm)로 구성된 특징적인 소렛 및 Q-밴드의 존재는 Hb가 여전히 기능함을 나타냅니다.
  12. 기능적으로 활성화된 Hb를 포함하는 균일한 빨간색 Hb@HP-UiO-66-N3 NP를 기대하며, 산소 공급은 가역적입니다.

5. Hb@HP-UiO-66-PEG NP의 제조: SPAAC를 이용한 PEG화(예상 기간: 2일)

  1. 2mL 원심분리관을 준비하고, Hb@HP-UiO-66-N₃ NPs(10 mg)를 0.5 mL 초순수수에 분산시킵니다. DBCO-PEG(Mw ~2,000, 0.5mL 초순수수에 20mg)를 추가하여 PEG와 NP의 비율을 2:1(w/w)로 만듭니다. 완전히 혼합될 때까지 부드럽게 소용돌이를 돌립니다.
  2. 혼합물을 실온에서 1,000rpm 열셰이커에서 1시간 배양한 후, 냉장고(4°C)로 옮겨 하룻밤(~16시간) 반응을 진행합니다. 이 촉매 없는 SPAAC 클릭 반응은 DBCO를 아지드 그룹에 공유 결합하여 안정적인 트리아졸 결합체를 형성합니다.
  3. 12,000 x g 에서 실온에서 5분간 원심분리하여 PEG화된 Hb@HP-UiO-66-PEG NP를 펠릿으로 발굴합니다. 침전물이 완전히 덩어리가 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요. 반응하지 않은 PEG가 포함된 상청액을 버리세요.
  4. 펠릿을 초순수수(피펫팅으로 위아래로 피펫팅하여 각각 2mL)로 세 번 세척합니다. 이로 인해 자유 PEG 사슬과 소분자 부산물이 제거됩니다.
  5. 정제된 Hb@HP-UiO-66-PEG NP를 2 mL 초순수수에 재현탁하여 4 °C에서 보관합니다.
    콜로이드는 균질하고 약간 오팔빛을 띠어 분산 안정성이 우수함을 나타냅니다.
  6. FTIR 분광법에 의한 성공적인 PEGylation을 확인하라(그림 6A): 2122 cm-1 에서 아지드 밴드가 사라지고 PEG 유래 메틸렌(−CH2−)과 에테르 결합(−O−) 신호가 각각 2883cm와 1097 cm-1에서 출현.
  7. 알칼리성 소화 후 2 M KOH/D 2O에서 1H NMR(그림 6B)으로 검증; PEGylated 시료는 PEG의 옥시에틸렌 양성자에 해당하는 δ = 3.53 ppm의 추가 신호를 보입니다.
  8. DLS를 이용해 유체역학적 직경과 다분산 지수(PDI)를 측정합니다(그림 6C).
    ~115 nm(PDI ~0.1)에서 ~140 nm(PDI ~0.17)로 증가하면 얇은 폴리머 층으로 표면 코팅이 확정됩니다.
  9. 선택 사항: Zetasizer Nano ZS를 사용하여 표면 PEGylation이 표면 전하에 미치는 무시할 만한 영향을 검증하기 위해 표면 ζ 전위를 측정하는 것(그림 6D). PEGylation 후 약간의 변화(~+20 mV에서 ~+17 mV로)는 표면 전하에 미치는 영향이 최소화됨을 나타냅니다.
  10. TEM을 이용한 형태를 관찰하라(그림 6E). TEM은 입자 가장자리 주변에 퍼진 ~10-12 nm 가장자리를 드러내며, 이는 PEG 코로나를 나타냅니다.
  11. 산소 전극(그림 6F)을 사용하여 산소 방출 분석법을 수행하여 PEG질화 후에도 Hb 기능이 유지됨을 보여주며, 이는 PEG화되지 않은 형태와 유사합니다. 안정적인 적갈색 분산된 Hb@HP-UiO-66-PEG NPs가 강한 콜로이드 안정성과 산소 결합 능력을 유지하여 장기 생리학적 검사에 적합함을 기대합니다.
  12. 선택적으로: Hb@HP-UiO-66-PEG NP에 캡슐화된 자유 Hb 및 Hb의 산소 해리 곡선(ODC)을 수행하여 50% Hb 산소포화도(p50)와 Hill 계수(Hill-n)에서 부분 산소압을 규명합니다(그림 7).

6. NPs 안정성 평가 (예상 기간: 7일)

  1. Hb@HP-UiO-66-PEG NP(~5 mg)를 7개의 2 mL 원심분리관 7개에 투여합니다. 각 배지별로 2mL씩 추가합니다: 초순수, 식염수(0.9% NaCl), HEPES(20 mM), 마우스 혈청, 인간 혈장, 둘벡코 변형 이글 중고포도당(DMEM), 인산 완충 식염수(PBS). 배양 중 매개체 증발을 방지하기 위해 원심분리기 튜브 캡을 단단히 닫아야 합니다. CD-1 마우스 혈청과 인간 혈장은 미국 미시간주 노비의 Innovative Research에서 구매합니다.
  2. 샘플을 37°C에서 1,000rpm의 열셰이커에서 최대 7일간 배양하세요.
  3. 3일과 7일 후에 원심분리(12,000g, 10분, 상온)로 입자를 수집하고, 초순수수로 한 번 세척한 후 PXRD(그림 8A)를 위해 건조합니다. 침전물이 완전히 덩어리가 되지 않았다면 원심분리 시간을 필요에 따라 연장하세요.
  4. 0, 24, 72, 168시간에서 알리코트(~50 μL)를 추출하여 DLS 분석(크기 및 PDI)을 위해 20배 희석합니다(그림 8B).
  5. 선택적으로: PBS에서 48시간 후 SEM 샘플을 준비하여 형태를 육안으로 확인할 수 있습니다(그림 8C).
    참고: NP의 현탁액(PBS 내)을 초순수수로 희석하는 것은 SEM 분석에 필수적입니다. 이는 완충 성분의 배경 간섭을 줄이고 NP의 선명한 영상을 가능하게 하기 때문입니다.
  6. 동일한 조건에서 비PEG질화된 Hb@HP-UiO-66-N3 NPs와 비교하면; 특징적인 결정 반사가 급격히 사라지고 넓은 비정질 산란 특징이 나타나는 것은 PEG 코팅 없이 불안정성을 나타냅니다.
    참고: PEG화 샘플은 모든 배지에서 7일 후에도 구조적으로 온전한 상태를 유지하며, PEG화 샘플은 PBS 또는 DMEM에서 24시간 이내에 분해됩니다.

7. 물리화학적 특성 분석 (예상 기간: ~15일)

참고: 이 절에서는 NP의 형태, 조성, 다공성 및 Hb 무결성을 확인하는 데 필요한 분석 방법을 설명합니다. 이러한 특성화 기법들은 합성 및 변형 과정의 재현성을 검증합니다.

  1. PXRD
    1. 측정 전에 각 NP 샘플 각각을 하룻밤 동안 냉동 건조기에서 건조하여 흡착된 수분을 제거하세요.
    2. 샘플을 평평한 무배경 실리콘 홀더에 올린 후, 깨끗한 유리 슬라이드로 부드럽게 평평하게 펴서 얇고 균일한 층을 만듭니다.
      참고: 너무 세게 누르면 선호 방향 효과가 발생할 수 있습니다.
    3. Cu Kα 방사선이 장착된 벤치탑 회절계(λ = 1.5418 Å)를 사용하여 PXRD 패턴을 기록합니다. 스캐닝 매개변수를 2θ = 4-50°, 스텝 크기 = 0.02°, 드웰 = 스텝당 1초로 설정하세요.
    4. 얻어진 패턴을 이전에 보고된 결정 데이터를 기반으로 수성 소프트웨어로 생성된 시뮬레이션된 UiO-66 구조와 비교하세요31. 7.3°, 8.4°, 25.7°에 날카로운 봉우리가 나타나면 결정 완전성을 나타냅니다.
  2. N2 흡착-탈착 (BET 표면적 및 기공 크기 분포)
    1. Micromeritics Smart VacPrep 시스템과 초고순도N2 퍼징 기능을 사용해 140°C에서 24시간 동안 각 NP 샘플당 100mg을 데가스합니다.
    2. 즉시 탈기된 샘플을 마이크로메리틱스 트라이스타 표면적 분석기의 분석 포트로 옮기세요. 상대 압력 범위(P/P₀) 0-1 내에서 77 K에서 N2 개의 등온선을 기록하라.
    3. 확장 Rouquerol 기준52에 따라 BET 방법으로 표면적을 계산합니다. Micromeritics 소프트웨어에 구현된 비국소 밀도 함수 이론을 통해 기공 크기 분포를 계산합니다.
    4. Origin 2022를 사용하여 흡착/탈착 곡선과 기공 크기 분포 플롯을 생성하세요. 흡착/탈착 데이터를 소프트웨어에 가져오고, X축에는 상대 압력(P/P₀), Y축에는 흡착 부피 N2 를 표시합니다.
    5. 기공 폭을 X축, 증분 기공 부피를 Y축으로 하여 공 크기 분포 데이터를 그래프로 표시합니다. 결과를 "선 + 기호" 그래프로 제시하세요. 모든 분석을 기본 소프트웨어 설정으로 수행하세요.
  3. FTIR 분광법
    1. 깨끗한 마노 모르타르를 사용해 각 건조 샘플당 ~5mg씩 곱게 분쇄합니다. 분말을 ALPHA-P 브루커 분광기53의 ATR 결정 위에 놓으세요.
    2. 해상도 2 cm-1로 4,000-400 cm-1 범위의 스펙트럼을 수집하세요.
    3. 특징 피크 식별: ~2122 cm-1에서N-3 스트레칭이 나타나면 아지드 형성이 확인된다(그림 4A). PEG질화 후에는 각각 ~2883 cm-1과 ~1097 cm-1에서 −CH2−와 C-O-C 밴드가 관찰되며, N3 스트레칭도 사라집니다(그림 6A). 아지드 밴드의 소멸과 PEG 유도 메틸렌(−CH2−) 및 에테르 골(−O−) 신호의 출현은 SPAAC 반응의 완성을 확인시킨다.
    4. Origin 2022를 사용해 FTIR 곡선을 그려보세요. X(파수)와 Y(송신) 값을 가진 원시 데이터를 소프트웨어에 가져오세요. 소프트웨어의 기본 설정을 사용하여 "선" 형식으로 그래프를 생성하세요.
  4. 1수소 NMR
    1. 유리 바이알에2 O 내2 M KOH 0.5 mL에 NP 약 ~10mg을 첨가하고, 80 °C에서 1-2시간 가열하여 프레임워크를 소화합니다.
    2. 원심분리기(12,000 x g, 10분, 실온)로 용해되지 않은 잔류물을 회전시킵니다. 상청액을 5mm NMR 튜브로 옮깁니다.
    3. 400 MHz 브루커 아반스 분광기에서 1HNMR 스펙트럼을 기록합니다.
    4. MestReNova 소프트웨어를 사용하여 BDC-NH2 의 방향족 양성자(δ = 6-8 ppm)와 PEG 신호(δ = ~3.53 ppm, 그림 6B)를 포함한 특징적인 화학적 이동을 할당합니다. 소프트웨어의 NMR 처리 모듈을 기본 설정으로 사용하여 NMR 데이터를 분석하세요.
  5. SEM
    1. 실리콘 웨이퍼에 ~5 μL 정도의 NP 현탁액을 침착합니다; 먼지 없는 캐비닛에서 자연 건조시키세요. 충전이 발생하면 5nm 금으로 스퍼터 코팅을 하세요.
    2. FEI Quanta 200 SEM의 10-20 kV 가속 전압 이미지.
    3. ImageJ를 사용해 이미지를 분석하세요. 원본 TIFF 이미지에 스케일 정보가 포함되어 소프트웨어에 불러와, 시각화를 위해 밝기와 대비를 조정하세요. 차원 정보에 영향을 줄 수 있는 추가 처리는 하지 마십시오. 소프트웨어의 분석 기능을 사용해 스케일 바를 생성하세요.
  6. TEM
    1. 레이시-탄소 Cu 격자(300 mesh)에 ~5 μL NP 분산을 배치합니다. 과잉 필터 페이퍼로 닦아내고 주변 온도에서 말리세요.
    2. FEI Tecnai T20 G2 TEM 하에서 200 kV에서 검사합니다.
    3. ImageJ를 사용해 이미지를 분석하세요. 이미지 처리는 7.5.3절에 설명된 절차를 따릅니다.
  7. DLS와 ζ-퍼텐셜
    1. 초순수수에서 NP를 ~20배 희석하여 크기 및 PDI 분석; ζ 전위는 HEPES 버퍼(20 mM, pH 7.4)에 희석합니다.
    2. Zetasizer Nano ZS를 사용해 25°C에서 측정하세요. 최소 세 개의 독립적인 샘플(n = 3)을 준비하며, 각 샘플은 삼중 비율로 측정됩니다.
    3. Origin 2022를 사용해 DLS와 ζ 잠재 데이터를 그래프로 작성하세요. 강도 가중 입자 크기 분포를 "선 + 심볼" 그래프로, ζ 퍼텐셜 결과를 "컬럼" 그래프로 제시합니다. 데이터를 표준편차± 평균 (n = 3)로 보고하세요. 모든 분석을 소프트웨어 기본 설정으로 수행하세요.
  8. Hb 기능을 위한 UV-vis 분광법
    1. 3 mL 초순수수에 3 mg의 자유 Hb 또는 그에 상응하는 양의 NP(즉, 동등한 양의 캡슐화된 Hb 포함)를 분산시킵니다. 서스펜션을 쿼츠 쿠벳으로 옮기세요. UV-2600 UV−vis 분광광도계를 사용하여 375-700 nm 범위의 UV-vis 스펙트럼을 기록합니다.
    2. Hb 용액이나 NP 현탁액에 소듐 디티오나이트를 한 꼬집 넣고N2 로 10분간 세척하여 샘플을 탈산소화합니다. 소렛 밴드가 412nm에서 430nm로 이동하고 Q-밴드가 합병되는 과정을 기록하세요. 샘플을 10분간 공기 부풀이로 재산소화하여 반전을 관찰합니다(그림 5F 및 보조 그림 1).
    3. Origin 2022를 사용해 데이터를 표시하세요. 스펙트럼을 X축에 파장, Y축에 흡수를 표시한 "선" 그래프로 제시합니다.
  9. 방출된 산소의 정량화
    1. 600 μL 초순수수에 1mg의 자유 Hb 또는 그에 상응하는 양의 Hb@HP-UiO-66-N3 및 Hb@HP-UiO-66-PEG NP(동등한 양의 캡슐화된 Hb 포함)를 분산시킵니다. 현탁액을 2mL 유리 바이알에 옮기고 고무 캡으로 단단히 밀봉하세요.
    2. 산소 전극의 바늘 탐침을 고무 캡을 통해 현탁액에 조심스럽게 삽입하여 바늘형 O2 미터를 사용해 용존 산소 농도를 모니터링합니다.
    3. 주사기 바늘을 사용해 현탁액에 K3[Fe(CN)6] 용액(100 wt%, 10 wt%)을 빠르게 첨가하고 산소 농도 변화를 지속적으로 기록합니다.
    4. K3[Fe(CN)6] 추가 후 관측된 최대 값을 초기 값에서 빼서 방출된 산소를 계산합니다. 얻은 값들을 Origin 2022를 사용해 같은 양의 자유 Hb에서 방출된 산소(그림 6F)와 정규화합니다. 자유 Hb 또는 각 NP에 대해 세 개의 독립적인 샘플(n = 3)을 측정합니다.
      참고: Hb@HP-UiO-66-N3 와 Hb@HP-UiO-66-PEG NP는 산소 방출량이 비슷하며, 각각 자유 Hb가 방출하는 산소의 ~60%를 방출합니다.
  10. ODC 측정 및 p50 및 Hill-n 계산
    1. 최종 Hb 농도인 ~1 mL-1 의 3 mL HEPES 완충제(20 mM HEPES, 0.9% (w/v) NaCl, pH 7.4)에서 자유 소 Hb 또는 Hb@HP-UiO-66-PEG NP를 제조합니다. 샘플을 자기 교반봉이 장착된 쿼츠 큐벳으로 옮깁니다.
    2. 큐벳을 Hemox 분석기에 넣으세요. 측정 온도를 37 °C로 설정하고, 안정적인 기준선이 될 때까지 시스템을 연속적으로 교반하여 평형을 유지합니다.
    3. 1-148 mmHg의 부분 압력 범위에서 단계적 탈산소화를 통해 ODC를 기록합니다. 기본 분석 설정으로 ODC를 측정하고 p50과 Hill-n을 계산하기 위해 미리 설치된 Hemox 분석기 소프트웨어를 사용하세요. 각 샘플마다 세 개의 독립적인 샘플(n = 3)을 측정합니다.
    4. 처리된 데이터를 내보내고 Origin 2022를 기본 "선" 그래프 형식으로 ODC를 그래프로 표시하세요.

8. 재현성 및 통계 분석

  1. 이 프로토콜에 설명된 모든 절차를 최소 세 번 독립적으로 수행하세요. 이 반복들에서 관찰된 전형적인 결과로 결과를 보고합니다. 반응 시간과 온도와 같은 주요 실험 매개변수를 합리적인 범위 내에 유지하여 다른 사용자들에게 재현성과 신뢰성을 보장합니다.
  2. 통계 분석 없이 정성적 확인을 위한 대표 데이터로서 구조적 특성(PXRD, N2 흡착-탈착, FTIR, 1HNMR, SEM, UV-vis)을 제시합니다.
  3. 정량적 측정값(DLS, ζ-전위, p50, Hill-n)을 평균 ± SD(n≥ 3)로 보고합니다. 적절한 경우 쌍이 없는 쌍 양측 웰치 t검정 또는 일방향 ANOVA를 사용하여 통계적 유의성을 결정합니다. 유의수준을 ns(유의함 없음), * = p < 0.05, ** = p < 0.005, *** = p < 0.001, **** = p < 0.0001로 표시합니다.

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결과

HP-UiO-66-NH2 NP의 성공적인 합성은 PXRD에 의해 검증되었으며(그림 2A), 2θ = 7.3°, 8.4°, 25.7°에서 특징적인 회절 피크가 나타나 시뮬레이션된 UiO-66 구조36과 잘 일치하였다. 시뮬레이션 패턴에 비해 약간의 피크 확장은 입자의 나노 크기 및 합성 후 결정 무결성 보존이 확인된 결과로 추정되었다. 알칼리 소화 후 1HNMR 분광법으로 DA의 완전한 제거가 확인되었으며, 1.2 ppm에서 DA의 특징적인 메틸렌 양성자 신호가 부재한 것으로 입증되었습니다(그림 2B). N2 개의 흡착-탈착 등온선체는 I형과 IV형이 결합된 형태를 보였으며, P

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토론

이 프로토콜은 Hb 캡슐화 및 산소 전달 응용을 위해 설계된 HP-UiO-66 NP를 합성, 기능화, 특성화하는 견고하고 재현 가능한 경로를 제시합니다. 내부-아웃 엔지니어링 접근법을 채택함으로써, 이 연구는 생체거대분자 및 약물 전달을 포함한 생의학 응용 분야를 위한 MOF NP 설계를 위한 일반화 가능한 틀을 확립합니다. 기본 재료 개념과 기능적 성능은 이전에 보고된 바 있지만, 본 프로토콜은 운영 명확성, 재현 가능성, 확장성을 강조함으로써 이전 연구를 크게 확장합니다. 상세한 취급 단계, 민감한 단계에 대한 문제 해결 안내, 그램 규모 합성에 대한 실용적인 지침이 제공되어 실험실 간 신뢰성 있는 구현을 지원합니다. 아래에서 논의하듯 최적의 구조적·기능적 특성을 가진 일관된 NP를 얻기 위해 특히 중요한 단계가 몇 가지 있습니다.

HP-UiO-66-NH2

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공개 사항

저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

우리는 유럽연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(보조금 번호 101002060)을 통해 유럽연구위원회의 지원에 깊이 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-아미노-1,4-벤젠디카복실산 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)381071-25G
4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)H3375-100G
아세톤 (99%)VWR 인터내셔널 (Sø 보그, DK)23J244030
비신코닌산 단백질 분석법  서모 피셔 사이언티픽 (로스킬레, DK)23235
소의 피와 nbsp;SSI 진단 A/S (Hillerø d, DK)77667
원심분리관
원심분리기와 nbsp;서모 피셔 사이언티픽 주식회사 (매사추세츠, 미국)75009903메가퓨지 ST 플러스 시리즈 
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미니 원심분리기에펜도르프 노르딕 (Hø rsholm, DK)카탈로그 번호   5452000010
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투과전자현미경  FEI 중대 (힐스보로, 미국)FEI 테크나이 T20
트리메틸실릴 아지드 & nbsp;머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)155071-10G
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진공 오븐  서모 피셔 사이언티픽 주식회사 (매사추세츠, 미국)
제타타이저 나노 ZS말번 파날리티컬 주식회사, (영국 말번)일련번호. MAL1188530
지르코늄(IV) 염화화물머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)357405-100G

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