이 프로토콜은 산소 전달을 위해 설계된 계층적으로 다공성인 UiO-66 나노입자의 합성, 헤모글로빈 캡슐화, 표면 PEG질화를 상세히 설명합니다. 이 절차는 결함 공학과 변형 촉진 바이코치옹 커지먼트를 결합하여 생의학 응용에 적합한 투과율이 높고 생리학적으로 안정적인 운반체를 생성합니다.
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방법 논문
산소 전달 응용을 위한 계층적 다공성 UiO-66 나노입자에서의 합성, 헤모글로빈 캡슐화 및 이교수 PEGylation
이 논문에서
요약
초록
헤모글로빈 기반 산소 운반체(HBOCs)는 여러 생의학적 맥락에서 저산소증을 완화하는 중요한 산소 전달 플랫폼입니다. 하지만 자유 헤모글로빈(Hb)은 적혈구 밖에서는 불안정하고 혈관 활성 상태입니다. 여기서는 Hb를 캡슐화하고 생체 직교 폴리에틸렌글리콜(PEG) 껍질로 안정화되는 계층적 다공성 UiO-66 나노입자(HP-UiO-66 NPs)를 제작하기 위한 재현 가능하고 확장 가능한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 계층적 중포로시티는 도데카노산 변조와 이후 산 세척을 통해 도입되어, 결정성이 보존되고 I/IV N2 등온선이 결합된 HP-UiO-66-NH₂ NP를 생성합니다. 표면 아민은 아지드(HP-UiO-66-N₃ NPs)로 전환되어, 촉매가 없는 변형 촉진 알킨-아지드 고속도로첨가물(SPAAC)가 Hb@HP-UiO-66-PEG NP를 생성할 수 있게 합니다. 작업 흐름은 다음과 같습니다: i) UiO-66-NH₂ NP의 결함 공학, ii) 변조기 제거, iii) 아지드 설치, iv) 버퍼 수용 매체에서의 Hb 부하, v) SPAAC 매개 PEGylation. 각 단계마다 중요한 실험 매개변수, 표준 고장 모드, 문제 해결 전략이 상세히 설명되어 실험실 간 재현성을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 배치당 HP-UiO-66-NH₂ NP를 그램 단위로 생산할 수 있습니다. Hb의 캡슐화 효율은 온화한 조건에서 ~35%(적재 함량 ~24 wt%)를 얻으며, PEG화화 후 유체역학적 직경 ~140 nm의 재분산성 NP를 사용합니다. 포괄적인 물리화학적 특성 분석을 통해 프레임워크의 완전성, 중간포로시성, 성공적인 표면 화학, 그리고 최대 ~12 nm 너비의 확산 PEG 코로나가 검증됩니다. 기능적 분석은 캡슐화된 Hb의 산소 공급/탈산소 가역성을 보여주며, 산소 운반 능력이 유지됨을 나타냅니다. PEG화는 식염수, HEPES, 혈청에서 콜로이드 및 구조적 안정성을 현저히 향상시켜 비PEG화에서 관찰되는 인산염 유발 분해를 방지합니다. 상세한 문제 해결 안내, 중요한 단계의 영상 시각화, 확장 고려사항을 통합함으로써, 이 모듈식 프로토콜은 금속-유기물 프레임워크 기반 HBOC로 가는 견고하고 접근 가능한 경로를 제공합니다. 이 전략은 치료 전달을 위해 보호적이면서도 접근 가능한 미세 환경이 필요한 다른 생체대분자나 효소에도 쉽게 적응할 수 있습니다.
서론
적절한 산소 공급은 다양한 생의학 환경에서 효과적인 치료와 조직 치유를 위해 매우 중요합니다. 외상 및 수술 출혈에서는 심한 산소 손실이 생명을 위협할 수 있어, 기증자 혈액이 없을 때 안전한 혈액 대체 혈액의 필요성을 강조합니다. 종양학에서는 저산소 종양 부위가 산소 의존 치료의 효과를 제한하며, 보조 산소 공급은 치료 효과를 현저히 향상시킬 수 있습니다 3,4,5,6. 산소는 상처 치유에서도 중심적인 역할을 하며, 산소 가용성이 증가하면 혈관신생과 조직 수리가 촉진됩니다7. 마찬가지로, 허혈성 상태와 장기 이식에서는 산소 운반체가 저산소 손상을 줄이고 조직의 생존력과 회복력을 향상시킬 수 있습니다 8,9.
합성 헤모글로빈(....
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프로토콜
1. Hb 추출 (예상 소요 기간: 2일)
참고: 상업적으로 이용 가능한 소 혈액(SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK)에서 Hb 추출은 이전에 보고한 프로토콜49에 따라 수행됩니다.
- 소의 혈액(일반적으로 한 번에 10mL씩)을 50mL 원뿔형 원심분리관에 옮깁니다. 혈액을 희석하고 점도를 낮추기 위해 0.9% (w/v) 식염수를 같은 부피로 첨가하세요. 부드럽게 여러 번 뒤집어 균일한 현탁이 될 때까지 반복합니다.
- 희석된 혈액을 1,500 x g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리합니다. 원심분리 후에는 조밀한 붉은 펠릿(적혈구) 위에 투명한 노란색 상원액(혈장)이 나타납니다. 완전한 펠릿이 이루어지지 않으면 필요에 따라 원심분리를 계속하세요.
- 플라즈마 층을 조심스럽게 디캔트하고 폐기하면서도 펠릿을 건드리지 마세요. 신선한 식염수(10mL)를 추가하고, 적혈구 펠릿을 부드러운 역전으로 재현탁한 후, 동일한 조건에서 원심분리 과정을 반복합니다. 혈장, 단백질, 혈소판을 제거하기 위해 총 두 번의 세척 사이클을 수행....
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결과
HP-UiO-66-NH2 NP의 성공적인 합성은 PXRD에 의해 검증되었으며(그림 2A), 2θ = 7.3°, 8.4°, 25.7°에서 특징적인 회절 피크가 나타나 시뮬레이션된 UiO-66 구조36과 잘 일치하였다. 시뮬레이션 패턴에 비해 약간의 피크 확장은 입자의 나노 크기 및 합성 후 결정 무결성 보존이 확인된 결과로 추정되었다. 알칼리 소화 후 1HNMR 분광법으로 DA의 완전한 제거가 확인되었으며, 1.2 ppm에서 DA의 특징적인 메틸렌 양성자 신호가 부재한 것으로 입증되었습니다(그림 2B). N2 개의 흡착-탈착 등온선체는 I형과 IV형이 결합된 형태를 보였으며, P
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토론
이 프로토콜은 Hb 캡슐화 및 산소 전달 응용을 위해 설계된 HP-UiO-66 NP를 합성, 기능화, 특성화하는 견고하고 재현 가능한 경로를 제시합니다. 내부-아웃 엔지니어링 접근법을 채택함으로써, 이 연구는 생체거대분자 및 약물 전달을 포함한 생의학 응용 분야를 위한 MOF NP 설계를 위한 일반화 가능한 틀을 확립합니다. 기본 재료 개념과 기능적 성능은 이전에 보고된 바 있지만, 본 프로토콜은 운영 명확성, 재현 가능성, 확장성을 강조함으로써 이전 연구를 크게 확장합니다. 상세한 취급 단계, 민감한 단계에 대한 문제 해결 안내, 그램 규모 합성에 대한 실용적인 지침이 제공되어 실험실 간 신뢰성 있는 구현을 지원합니다. 아래에서 논의하듯 최적의 구조적·기능적 특성을 가진 일관된 NP를 얻기 위해 특히 중요한 단계가 몇 가지 있습니다.
HP-UiO-66-NH2
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공개 사항
저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 유럽연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(보조금 번호 101002060)을 통해 유럽연구위원회의 지원에 깊이 감사드립니다.
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재료
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| 아세톤 (99%) | VWR 인터내셔널 (Sø 보그, DK) | 23J244030 | |
| 비신코닌산 단백질 분석법 | 서모 피셔 사이언티픽 (로스킬레, DK) | 23235 | |
| 소의 피와 nbsp; | SSI 진단 A/S (Hillerø d, DK) | 77667 | |
| 원심분리관 | |||
| 원심분리기와 nbsp; | 서모 피셔 사이언티픽 주식회사 (매사추세츠, 미국) | 75009903 | 메가퓨지 ST 플러스 시리즈 |
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| 도데카노산과 nbsp; | 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK) | L556-1KG | |
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| 지르코늄(IV) 염화화물 | 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK) | 357405-100G |
참고문헌
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- Sen Gupta, A. Bio-inspired nanomedicine strategies for artificial blood components. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1464(2017).
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