방법 논문

산소 전달 응용을 위한 계층적 다공성 UiO-66 나노입자에서의 합성, 헤모글로빈 캡슐화 및 이교수 PEGylation

DOI:

10.3791/70445

2026년 5월 8일

이 논문에서

요약

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이 프로토콜은 산소 전달을 위해 설계된 계층적으로 다공성인 UiO-66 나노입자의 합성, 헤모글로빈 캡슐화, 표면 PEG질화를 상세히 설명합니다. 이 절차는 결함 공학과 변형 촉진 바이코치옹 커지먼트를 결합하여 생의학 응용에 적합한 투과율이 높고 생리학적으로 안정적인 운반체를 생성합니다.

초록

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헤모글로빈 기반 산소 운반체(HBOCs)는 여러 생의학적 맥락에서 저산소증을 완화하는 중요한 산소 전달 플랫폼입니다. 하지만 자유 헤모글로빈(Hb)은 적혈구 밖에서는 불안정하고 혈관 활성 상태입니다. 여기서는 Hb를 캡슐화하고 생체 직교 폴리에틸렌글리콜(PEG) 껍질로 안정화되는 계층적 다공성 UiO-66 나노입자(HP-UiO-66 NPs)를 제작하기 위한 재현 가능하고 확장 가능한 단계별 프로토콜을 제시합니다. 계층적 중포로시티는 도데카노산 변조와 이후 산 세척을 통해 도입되어, 결정성이 보존되고 I/IV N2 등온선이 결합된 HP-UiO-66-NH₂ NP를 생성합니다. 표면 아민은 아지드(HP-UiO-66-N₃ NPs)로 전환되어, 촉매가 없는 변형 촉진 알킨-아지드 고속도로첨가물(SPAAC)가 Hb@HP-UiO-66-PEG NP를 생성할 수 있게 합니다. 작업 흐름은 다음과 같습니다: i) UiO-66-NH₂ NP의 결함 공학, ii) 변조기 제거, iii) 아지드 설치, iv) 버퍼 수용 매체에서의 Hb 부하, v) SPAAC 매개 PEGylation. 각 단계마다 중요한 실험 매개변수, 표준 고장 모드, 문제 해결 전략이 상세히 설명되어 실험실 간 재현성을 향상시킵니다. 이 프로토콜은 배치당 HP-UiO-66-NH₂ NP를 그램 단위로 생산할 수 있습니다. Hb의 캡슐화 효율은 온화한 조건에서 ~35%(적재 함량 ~24 wt%)를 얻으며, PEG화화 후 유체역학적 직경 ~140 nm의 재분산성 NP를 사용합니다. 포괄적인 물리화학적 특성 분석을 통해 프레임워크의 완전성, 중간포로시성, 성공적인 표면 화학, 그리고 최대 ~12 nm 너비의 확산 PEG 코로나가 검증됩니다. 기능적 분석은 캡슐화된 Hb의 산소 공급/탈산소 가역성을 보여주며, 산소 운반 능력이 유지됨을 나타냅니다. PEG화는 식염수, HEPES, 혈청에서 콜로이드 및 구조적 안정성을 현저히 향상시켜 비PEG화에서 관찰되는 인산염 유발 분해를 방지합니다. 상세한 문제 해결 안내, 중요한 단계의 영상 시각화, 확장 고려사항을 통합함으로써, 이 모듈식 프로토콜은 금속-유기물 프레임워크 기반 HBOC로 가는 견고하고 접근 가능한 경로를 제공합니다. 이 전략은 치료 전달을 위해 보호적이면서도 접근 가능한 미세 환경이 필요한 다른 생체대분자나 효소에도 쉽게 적응할 수 있습니다.

서론

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적절한 산소 공급은 다양한 생의학 환경에서 효과적인 치료와 조직 치유를 위해 매우 중요합니다. 외상 및 수술 출혈에서는 심한 산소 손실이 생명을 위협할 수 있어, 기증자 혈액이 없을 때 안전한 혈액 대체 혈액의 필요성을 강조합니다. 종양학에서는 저산소 종양 부위가 산소 의존 치료의 효과를 제한하며, 보조 산소 공급은 치료 효과를 현저히 향상시킬 수 있습니다 3,4,5,6. 산소는 상처 치유에서도 중심적인 역할을 하며, 산소 가용성이 증가하면 혈관신생과 조직 수리가 촉진됩니다7. 마찬가지로, 허혈성 상태와 장기 이식에서는 산소 운반체가 저산소 손상을 줄이고 조직의 생존력과 회복력을 향상시킬 수 있습니다 8,9.

합성 헤모글로빈(....

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프로토콜

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1. Hb 추출 (예상 소요 기간: 2일)

참고: 상업적으로 이용 가능한 소 혈액(SSI Diagnostica A/S, Hillerød, DK)에서 Hb 추출은 이전에 보고한 프로토콜49에 따라 수행됩니다.

  1. 소의 혈액(일반적으로 한 번에 10mL씩)을 50mL 원뿔형 원심분리관에 옮깁니다. 혈액을 희석하고 점도를 낮추기 위해 0.9% (w/v) 식염수를 같은 부피로 첨가하세요. 부드럽게 여러 번 뒤집어 균일한 현탁이 될 때까지 반복합니다.
  2. 희석된 혈액을 1,500 x g 에서 4 °C에서 20분간 원심분리합니다. 원심분리 후에는 조밀한 붉은 펠릿(적혈구) 위에 투명한 노란색 상원액(혈장)이 나타납니다. 완전한 펠릿이 이루어지지 않으면 필요에 따라 원심분리를 계속하세요.
  3. 플라즈마 층을 조심스럽게 디캔트하고 폐기하면서도 펠릿을 건드리지 마세요. 신선한 식염수(10mL)를 추가하고, 적혈구 펠릿을 부드러운 역전으로 재현탁한 후, 동일한 조건에서 원심분리 과정을 반복합니다. 혈장, 단백질, 혈소판을 제거하기 위해 총 두 번의 세척 사이클을 수행....

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결과

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HP-UiO-66-NH2 NP의 성공적인 합성은 PXRD에 의해 검증되었으며(그림 2A), 2θ = 7.3°, 8.4°, 25.7°에서 특징적인 회절 피크가 나타나 시뮬레이션된 UiO-66 구조36과 잘 일치하였다. 시뮬레이션 패턴에 비해 약간의 피크 확장은 입자의 나노 크기 및 합성 후 결정 무결성 보존이 확인된 결과로 추정되었다. 알칼리 소화 후 1HNMR 분광법으로 DA의 완전한 제거가 확인되었으며, 1.2 ppm에서 DA의 특징적인 메틸렌 양성자 신호가 부재한 것으로 입증되었습니다(그림 2B). N2 개의 흡착-탈착 등온선체는 I형과 IV형이 결합된 형태를 보였으며, P

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토론

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이 프로토콜은 Hb 캡슐화 및 산소 전달 응용을 위해 설계된 HP-UiO-66 NP를 합성, 기능화, 특성화하는 견고하고 재현 가능한 경로를 제시합니다. 내부-아웃 엔지니어링 접근법을 채택함으로써, 이 연구는 생체거대분자 및 약물 전달을 포함한 생의학 응용 분야를 위한 MOF NP 설계를 위한 일반화 가능한 틀을 확립합니다. 기본 재료 개념과 기능적 성능은 이전에 보고된 바 있지만, 본 프로토콜은 운영 명확성, 재현 가능성, 확장성을 강조함으로써 이전 연구를 크게 확장합니다. 상세한 취급 단계, 민감한 단계에 대한 문제 해결 안내, 그램 규모 합성에 대한 실용적인 지침이 제공되어 실험실 간 신뢰성 있는 구현을 지원합니다. 아래에서 논의하듯 최적의 구조적·기능적 특성을 가진 일관된 NP를 얻기 위해 특히 중요한 단계가 몇 가지 있습니다.

HP-UiO-66-NH2

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공개 사항

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저자들은 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

감사의 글

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우리는 유럽연합의 Horizon 2020 연구 및 혁신 프로그램(보조금 번호 101002060)을 통해 유럽연구위원회의 지원에 깊이 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
2-아미노-1,4-벤젠디카복실산 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)381071-25G
4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)H3375-100G
아세톤 (99%)VWR 인터내셔널 (Sø 보그, DK)23J244030
비신코닌산 단백질 분석법  서모 피셔 사이언티픽 (로스킬레, DK)23235
소의 피와 nbsp;SSI 진단 A/S (Hillerø d, DK)77667
원심분리관
원심분리기와 nbsp;서모 피셔 사이언티픽 주식회사 (매사추세츠, 미국)75009903메가퓨지 ST 플러스 시리즈 
중수소 산화물머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)151882
디벤조사이클로옥틴-폴리에틸렌글리콜브로드팜BP-23949
도데카노산과 nbsp;머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)L556-1KG
둘벡코 수정된 독수리' S 중간과 마이너스; 고혈당 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)11965092
에탄올 (100%)VWR 인터내셔널 (Sø 보그, DK)24L044013
푸리에 변환, 적외선 분광법 및 nbsp;브루커 (빌레리카, 미국)
혈액분석기 TSC 사이언티픽 CRP (펜실베이니아, 미국)
인간 시탄화 혈장테부비오SER-PLP25
염산 (37%)머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)320331-500ML
ImageJ 소프트웨어미국 국립보건원(NIH)버전 1.47t
레이시-카본 Cu 그리드 (300 메쉬)아가 사이언티픽 주식회사, (스탠스테드 에식스, 영국)AGS166-3H
자기 교반자IKA-베르케 GmbH & KG 중대 (DE)신분증. 번호: 0010011496
MestReNova sofeware메스트레랩 리서치 (스페인)버전 12
마이크로메리틱스 트라이스타 표면적 분석기써모피셔 사이언티브 주식회사ASAP 2020 플러스
미니 원심분리기에펜도르프 노르딕 (Hø rsholm, DK)카탈로그 번호   5452000010
마우스 혈청혁신적 연구 (미시간주 노비, 미국)IGMSCD1SER10ML
머플 퍼니스 나버트름 GmbH (브레멘, 델라웨어)머플 퍼니스 LE 6/11
N,N′-디메틸포름아마이드 (99.9%)VWR 인터내셔널 (Sø 보그, DK)250131a008
나노드롭 2000c 장비  써모피셔
핵 자기 공명 브루커 (빌레리카, 미국)
O2 미터기 프레젠스 (독일 레겐스부르크)
Origin 2022 소프트웨어오리진랩 코퍼레이션 (매사추세츠, 미국)버전 2022  
산소 센서프레센스 (레겐스부르크, DE)옥시-1 ST 미량
인산염 완충 식염수와 nbsp;머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)P4417-50TAB
플레이트 리더테칸 그룹 Ltd.  (Mä 엔네도르프, CH)
헥사시아노페르산 칼륨머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)60299-100G
수산화칼륨머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)221473-500G
분말 X선 회절  말번 파날리티컬 주식회사, (영국 말번)모델: 말번 파날리티컬 에어리스 리서치 600W XRD 분말 측정 (2020년 출시)
둥근 바닥 압력 용기  머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)SYNP170004-1EA
주사 전자현미경 및 nbsp;FEI 중대 (힐스보로, 미국)듀얼 빔 FEI 헬리오스 나노랩 600
나트륨 클로라이드 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)71376
나트륨 디티오나이트 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)71699-250G
도데실 황산나트륨  머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)L4509-100G
신스웨어&트레이드; 둥근 바닥 압력 용기머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)SYNP170003
테르트-부틸 아질산염 머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)20370-100ml-F
테트라하이드로퓨란 (99.7%)VWR 인터내셔널 (Sø 보그, DK)201022A004
열셰이커그랜트 인스트루먼트 (케임브리지) Ltd (영국)PHMT-PSC18 (01012015020119)
투과전자현미경  FEI 중대 (힐스보로, 미국)FEI 테크나이 T20
트리메틸실릴 아지드 & nbsp;머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)155071-10G
TSC HEMOX DAQ 시스템TSC 사이언티픽 CRP (펜실베이니아, 미국)혈액분석기 소프트웨어 및 nbsp;
울트로사운드 소닉케이터  브랜슨 울트라소닉스 코퍼레이션 (댄버리, 미국)스쿠: 2410240003
UV-VIS 분광광도계  시마즈 (교토, 일본)
진공 오븐  서모 피셔 사이언티픽 주식회사 (매사추세츠, 미국)
제타타이저 나노 ZS말번 파날리티컬 주식회사, (영국 말번)일련번호. MAL1188530
지르코늄(IV) 염화화물머크 생명과학 A/S (Sø 보그, DK)357405-100G

참고문헌

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  1. Sen Gupta, A., Doctor, A. Oxygen Carriers. Damage Control Resuscitation. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. (2020).
  2. Sen Gupta, A. Bio-inspired nanomedicine strategies for artificial blood components. WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9 (6), e1464(2017).

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